多西环素对大鼠体外循环后肺内MMP-9和TIMP-1

多西环素对大鼠体外循环后肺内MMP-9和TIMP-1活性和基因表达的影响王常田程晓峰张雷吴海卫许飚李德闽南京军区南京总医院心胸外科210002【摘要】目的：探讨多西环素对大鼠体外循环后肺内基质金属蛋白酶-９和组织基质金属蛋白酶抑制剂-1活性和基因表达的影响。方法：健康雄性SD大鼠３６只随机分为对照组（A组）、体外循环组（B组）和治疗组（C组），分别于手术结束时（T1）和手术结束后6小时（T2）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织标本。Western-blot法测定BALF中MMP-9和TIMP-1的蛋白活性，RT-PCR法测定肺组织MMP-9和TIMP-1mRNA的表达。结果：治疗组大鼠肺组织水肿减轻，BALF的中性粒细胞减少；CPB组BALF中MMP-9活性明显升高，CPB后6小时表达最强，治疗组MMP-9活性较CPB组有明显下降，TIMP-1的活性在CPB组和治疗组于CPB结束后呈较弱的增强趋势，两组间相同时间点的表达差异不明显；CPB组和治疗组MMP-9mRNA表达增强，但治疗组MMP-9mRNA的表达在相应时间点较治疗组下降；TIMP-1mRNA在治疗组表达增强，且T２时间点显著增强；MMP-9/TIMP-1mRNA在CPB组和治疗组均有显著增大，但治疗组中T2时间点组MMP-9/TIMP-1mRNA比值较CPB组明显下降。结论：CPB可以引起大鼠术后肺内MMP-9的活性和基因表达增强，导致术后早期肺内MMP-9/TIMP-1mRNA表达失衡，多西环素可以抑制CPB后大鼠肺组织内MMP-9蛋白水平和mRNA的表达，还可能上调TIMP-1的表达而间接抑制MMP-9mRNA表达，改善MMP-9/TIMP-1的比例失衡。【关键词】基质金属蛋白酶-9，组织基质金属蛋白酶抑制剂-1，多西环素,体外循环EffectofdoxycyclineonMMP-9andTIMP-1activityandmRNAexpressioninlungaftercardiopulmonarybypasswitharatmodelWANGChangtian,CHENGXiaofeng,ZHANGLei,WUHaiwei,XUBiao,LIDeminDepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,NanjingGeneralHospitalofNanjingCommand,Nanjing210002【Abstract】Objective:ThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectofdoxycyclineontheactivityandmRNAexpressionofMMP-9andTIMP-1inCPBbyaratmodel.Methods:MaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedinto3groups(n=12,respectively):shamgroup,CPBgroup,andCPB+Doxgroup.TheratswereexecutedattheterminationofCPB(T1),6hafterterminationofCPB(T2)respectively.BALFandlungtissueswereharvestedatT1andT2.Thelungwet/dryratio(W/D)wasmeasured.NeutrophilinBALFwascounted.TheactivityofMMP-9andTIMP-1wasdetectedbyWestern-blotanalysis.TheexpressionofMMP-9andTIMP-1inlungtissuewasdetectedbyRT-PCR.Results:TheedemaoflungtissuesignificantlyreducedinCPB+DoxgroupcomparedwithCPBgroup,andneutrophilswerelessthanCPBgroup.TheactivityofMMP-9byWestern-blotinCPB+DoxgroupdecreasedsignificantlycomparedwithCPBgroupandtheactivityofTIMP-1wasaweakerincreasingtrendinCPBandCPB+Doxgroup.TheexpressionofMMP-9mRNAbyRT-PCRwassignificantlyincreasedafterCPBinCPBandCPB+Doxgroup,butsignificantlydecreasedatT2timepointinCPB+Doxgroup.TheratioofMMP-9/TIMP-1wassignificantlyincreasedinCPBandCPB+Doxgroup,butinCPB+DoxgroupwassignificantlylowerthaninCPBgroupatT2time.Conclusions:CPBcouldinducetheactivityandmRNAofMMP-9oflungincreased,causingtheratioofMMP-9/TIMP-1imbalancedseverelyattheearlypostoperative.DoxycyclinecouldinhibittheexpressionofMMP-9activityandmRNAinratlungtissueafterCPB,andmightincreasetheexpressionofTIMP-1inratsafterCPB,andinhibittheexpressionofMMP-9mRNAindirectly,whichcouldimprovetheratioofMMP-9/TIMP-1imbalance.【KeyWords】MatrixMetalloproteinase-9，Tissueinhibitorofmetalloproteinases-1,Doxycycline,CardiopulmonaryBypass体外循环(Cardiopulmonarybypass,CPB)可以导致全身炎性反应，急性肺损伤（Acutelunginjury,ALI）是主要并发症之一[１]，基底膜的损伤和修复在ALI发生发展过程中发挥重要作用[2]。基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinase，MMP）是参与细胞外基质降解的主要酶类，MMP-9主要来源于炎性细胞，其作用底物主要是Ⅳ、Ⅴ型胶原，与ALI有关[3]。组织基质金属蛋白酶抑制剂(Tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)是内源性MMPs抑制剂，在皮摩尔水平对MMPs就有很好的亲和性，是一种理想的抑制剂。近年来在ALI过程中MMPs/TIMPs的失衡逐步受到研究者的重视[4]，但在CPB所致ALI过程中的研究较少。本实验通过建立大鼠体外循环动物模型，从支气管肺泡灌洗液蛋白活性、肺组织mRNA等不同水平观察MMP-9和TIMP-1在体外循环术后肺内的表达，探讨MMP-9和TIMP-1在CPB所致ALI中的作用及可能机制。１、材料和方法１.１大鼠体外循环建立清洁级健康纯种成年雄性SD大鼠，体重500-600g，月龄5-6个月，在SPF级动物屏障环境下饲养。温度22℃，相对湿度50%-60%，分笼饲养，予以标准饲料，自由取水。南京军区南京总医院比较医学科提供，实验动物许可证明号：SYXK（军）2007-029。术前24小时禁食，自由饮水。2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射麻醉。麻醉成功后仰卧、固定于操作台，四肢接心电导联，股动脉穿刺动态监测血压，尾动脉穿刺连接动脉泵管，右侧颈内静脉置带网状侧孔的16G导管作静脉引流并接贮血槽。所有管路妥善固定于体表。预充液按晶胶比1:4配制，胶体选用贺斯，预充量10ml[5]。１.２实验设计36只大鼠随机分为3组，每组12只。A组（对照组，sham）：仅进行麻醉，股动脉、尾动脉和颈静脉插管及肝素化等处理，不进行体外循环；B组（体外循环组，CPB）:麻醉、动静脉插管及肝素化后进行体外循环。体外循环时间60min，术中维持收缩压在75-120mmHg，体外循环过程中不降温、不给地塞米松及乌司他丁等药物。C组（体外循环+药物，CPB+Dox）：术前1周开始予以多西环素（Dox）30mg/kg进行灌胃治疗，每天1次，7天后接受CPB。分别于手术结束时（T1）和手术结束后6小时（T2）处死大鼠，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）和肺组织标本，对照组分别在相应时间点取材。１.３标本的收集和保存：按预定时间点处死各组大鼠，打开胸腔完整取出心肺，取右上肺置于-75℃冰箱冻存，用于测定MMP-9和TIMP-1mRNA的表达。左肺组织先称湿重，然后用4℃生理盐水行支气管肺泡灌洗，每次灌洗量为2ml，共4次，收集灌洗液并记录回收量，BALF以3000r/min离心10min，取上清液保存于-75℃冻存待用；离心后沉淀用1ml生理盐水稀释，进行中性粒细胞计数。左肺灌洗结束后，置于烤箱中60℃干燥至恒重，称取干重。１.４Western-blot法测定BALF中MMP-9及TIMP-1的蛋白活性提取BALF中总蛋白；将30μg蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；电转法转移至聚偏乙烯氟化物膜，然后与1:1000Ⅰ抗溶液反应（羊抗鼠MMP-9和TIMP-1多克隆抗体）；漂洗后再与1:2000辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗（兔抗羊IgG）孵育2h；与NEN化学发光试剂反应3～5min，暗盒中使X光片曝光10～30sec，经显影定影后，凝胶扫描成像系统分析目的条带。ImageJ分析程序软件进行电脑推算法测定与内参β-actin灰度比值，重复3次取平均值。１.5RT-PCR法测定肺组织MMP-9/TIMP-1mRNA的表达TRIzol法提取RNA，具体方法按其说明进行。采用NCBI/Primer-BLAST设计PCR引物。取５µgRNA、OligoDt（18）1.5μL和无核酸酶的双蒸水加入0.2ml灭菌无核酸酶PCR管至总体积10μL在70℃保温10min，然后加入RNase抑制剂(40u/μL)0.5μL、10×AMVReactionBuffer2.5μL、dNTPs(10mM)1μL、DTT(1M)1.5μL、逆转录酶（AMV）1μL、无核酸酶的双蒸水8.5μL，混匀后2000rpm离心20s；42℃保温45min，然后72℃保温10min，即进行反转录，反应体系为2X的RTmix10μl、模板（cDNA稀释10倍）1μl、引物F和R5pmol/ulmix2μl、无核酸酶的双蒸水7μl，总共20μl。放置样品于循环仪并启动热循环，进行４０循环的扩增（DA7600），每个热循环包括95℃25秒，60℃30秒，72℃30秒，最后72℃保温10分钟，PCR反应完成后，采用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，大鼠的MMP-9和TIMP-１基因表达采用MMP-９和TIMP-１与β-actin的光密度比值表示。1.6统计学分析计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析处理，组间均数比较采用方差分析法。p＜0.05为差异有显著统计学意义。２.结果２.１三组大鼠手术后肺的W/D值和BALF中性粒细胞数三组大鼠术后W/D值和BALF中性粒细胞数见表１。各组之间差异明显，在T２时间点，Ｂ组的W/D值明显高于A组和C组(8.9±0.9vs4.0±0.3,5.6±0.8,p<0.01)。而C组则介于A组和B组之间，明显低于B组而高于A组，之间有显著差异（4.5±0.7,5.6±0.8vs6.7±0.8,8.9±0.9,p<0.05；4.5±0.7,5.6±0.8vs3.6±0.4,4.0±0.3,p<0.05）。中性粒细胞变化趋势与W/D值一致。表１肺的W/D值和BALF中性粒细胞数Table1TheratiooflungW/DandneutrophilscountsinBALFGroupＡGroupＢGroupＣT1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)W/D3.6±0.44.0±0.36.7±0.8*8.9±0.9*4.5±0.7▲5.6±0.8▲Neutrophils4.5±0.34.7±0.510.7±1.2*13.9±1.9*8.6±0.9▲10.9±1.1▲(×109/L)数值以mean±SD表示，GroupA（对照组）GroupB（CPB组）GroupC（CPB+Dox组）T1，手术结束时；T2，和手术结束后6小时W/D，肺的湿/干重比值BALF，bronchoalveolarlavagefluid*p<0.01B组与A组相比；▲p<0.05C组与B组相比。２.２BALF中MMP-9和TIMP-１活性测定Western-blot法测定三组大鼠BALF中的MMP-9和TIMP-１活性（表２和图1），结果显示B组中MMP-9的活性在两个时间点均明显高于A组和C组(T11.04±0.06vs1.19±0.09,1.09±0.04p<0.01；0.86±0.01vs1.14±0.04,1.11±0.11p<0.01)。而A组和C组之间无显著差异。TIMP-１的活性改变类似于MMP-9，B组的TIMP-１活性明显高于A组和C组。表２Western-blot法测定三组大鼠BALF中的MMP-9和TIMP-１活性Table2TheactivityofMMP-9andTIMP-1inBALFbyWestern-blotanalysisgroupAgroupBgroupCT1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)MMP-91.19±0.091.14±0.041.04±0.06*0.86±0.01*1.09±0.041.11±0.11TIMP-11.15±0.081.08±0.021.11±0.12△1.01±0.09△1.13±0.120.98±0.02数值以mean±SD表示，GroupA（对照组）GroupB（CPB组）GroupC（CPB+Dox组）T1，手术结束时；T2，和手术结束后6小时MMP-9,matrixmetalloproteinase-9;TIMP-1,tissueinhibitorofmetalloproteinase-1.*p＜0.01B组与A组和C组相比;△p＜0.05B组A组和C组相比;MMP-9TIMP-1MMP-9TIMP-1AT1AT2BT1BT2CT1CT2图１Western-blot法测定大鼠BALF中的MMP-9和TIMP-１活性Figure１TheactivityofMMP-9andTIMP-1inBALFbyWestern-blotanalysisGroupA（对照组）GroupB（CPB组）GroupC（CPB+Dox组）T1，手术结束时；T2，和手术结束后6小时MMP-9,matrixmetalloproteinase-9;TIMP-1,tissueinhibitorofmetalloproteinase-1.２.３肺组织MMP-9和TIMP-１mRNA的测定对肺组织内MMP-9、TIMP-1mRNA进行RT-PCR测定，结果见图2。三组MMP-9mRNA两个时间的表达分别为0.96±0.23,1.09±0.24,4.90±0.90,10.03±1.16,3.51±0.49,和8.87±1.20。其中B组中MMP-9mRNA的表达在T2时间点与其他两组相比达到峰值(p<0.001)。三组TIMP-1mRNA的表达值分别为0.91±0.20,1.09±0.31,3.08±0.63,4.02±0.87,3.11±0.91,和4.62±0.85。其中B组和C组的TIMP-1mRNA在两个时间点均明显增强，与A组相比有显著差异，但两组之间无显著差异。MMP-9/TIMP-1mRNA表达的比值在三组中分别为1.06±0.16,1.07±0.25,1.62±0.34,2.59±0.66,1.17±0.21和1.94±0.19。其中B组中比值明显高于其他两组，有意义的是C组较B组在两个时间点均明显下降，表明在C组中MMP-9的增强得到了抑制，增长的幅度不及TIMP-1的增长，所以比值出现下降趋势。Figure2MMP-9andTIMP-1geneexpressionbyusingTR-PCT.数值以mean±SD表示，GroupA（对照组）GroupB（CPB组）GroupC（CPB+Dox组）。*p<0.01表示显著差异。T1，手术结束时；T2，和手术结束后6小时MMP-9,matrixmetalloproteinase-9；TIMP-1,tissueinhibitorofmetalloproteinase-1.３．讨论体外循环下心内直视手术开展以来，术后肺功能障碍一直受心外科医师、体外循环医师及重症监护医师的共同关注，并积极探索其发生发展的机制以及防治方法以抑制或减轻其反应程度。目前国内外学者对其基本病理改变的比较共同的认识是体外循环过程激活了各种炎症因子继而损伤肺泡毛细血管基底膜，从而引起肺泡内液体增多，肺内分流增加，影响气体交换[6]。在本研究中，大鼠经CPB后肺水增加，支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞明显增多，存在不同程度的急性肺损伤。肺泡基底膜的成份包括有Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等，致其损害必须有蛋白水解酶的参与，因此MMPs作为具有降解基底膜功能的酶类在各种原因所致急性肺损害的作用越来越受人们的关注。本研究中CPB后大鼠的BALF中MMP-9的活性明显增加，肺内MMP-9mRNA的表达亦明显增强。表明CPB通过各种途径激活了MMP-9的表达并促进中性粒细胞肺内迁移和肺泡毛细血管通透性增加[7]。作为MMPs的内源性抑制剂，TIMPs最初被认为主要调节MMPs活性，抑制细胞外基质更新，而目前研究发现其具有多重功能，可以直接通过细胞表面受体或间接通过调节蛋白酶活性而起作用，如TIMP-2结合于整合素α3β1是TIMP家族成员首次作用于细胞表面受体的描述；TIMP-1则结合于CD63而抑制细胞生长和凋亡[8]。在本研究中发现CPB后大鼠肺内TIMP-1的活性和基因表达均明显增强。通过采用多西环素作为外源性MMPs抑制进行干预，发现治疗组支气管肺泡灌洗液MMP-9活性及肺组织内MMP-９基因表达受到抑制，说明多西环素可以抑制CPB后肺组织内MMP-9蛋白水平和mRNA的表达。肺组织内TIMP-1mRNA的表达在CPB组内两时间点未见显著差异,但在治疗组内可见CPB结束后6小时较CPB结束时TIMP-1mRNA的表达明显增强，两者间有显著差异，说明多西环素可能促进大鼠肺内TIMP-1mRNA的表达，提高CPB后肺内TIMP-1的含量，从而间接抑制MMP-9的活性和表达。通过对MMP-9和TIMP-1mRNA表达的比值进一步分析，在CPB组和治疗组内相比，CPB后MMP-9/TIMP-1均有显著增大，表明两组内CPB后肺内MMP-9mRNA表达的增长幅度明显大于TIMP-1mRNA的增长，CPB过程对MMP-9的刺激或激活作用远大于TIMP-1，造成MMP-9和TIMP-1表达的比例严重失衡。CPB组和治疗组在CPB结束时MMP-9/TIMP-1差异不明显，而在CPB结束后6小时治疗组的MMP-9/TIMP-1较CPB组有显著下降，说明治疗组在CPB结束以后肺内MMP-9表达受到抑制，而同时TIMP-1表达反而上调，MMP-9/TIMP-1比值的下降说明MMP-9/TIMP-1的比例严重失衡得到有效控制或逆转。通过本研究证实多西环素在大鼠CPB过程中具有明显的MMP-9的抑制作用，结合文献[9、10、11、12]分析其可能机制：1、通过对MMP-9的金属离子的络合作用直接抑制MMP-9活性；2、减少中性粒细胞肺内扣押，减少MMP-9的释放；3、可能通过上调内源性抑制剂如TIMP-1的水平而抑制MMP-9活性及表达；4、通过抑制细胞因子的转录，间接抑制MMP-9的转录、活化、激活；5、可能通过上调肺内其他蛋白或细胞因子水平而抑制MMP-9。众多研究已经证实，多西环素对MMP-9的抑制可能并非通过单一途径进行，而是多种途径的综合作用。具体机制尚需进一步深入研究，尤其要充分认识MMPs前体的激活和锚合等机制，也许能够提供一种方法来抑制潜在而有害的MMPs激活相关过程而保留其有益功能。参考文献：LevyJH,TanakaKA.Inflammatoryresponsetocardiopulmonarybypass.AnnThoracSurg.2003Feb;75(2):S715-20M.Corbel,E.BoichotandV.LagenteRoleofgelatinasesMMP-2andMMP-9intissueremodelingfollowingacutelunginjury.BrazilianJournalofMedicalandBiologicalResearch.2000,33(7):749-754SochorM,RichterS,SchmidtA,etal.Inhibitionofmatrixmetalloproteinase-9withdoxycyclinereducespancreatitis-associatedlunginjury.Digestion，2009,80(2):65-73.ChircoR,LiuXW,JungKK,etal.NovelfunctionsofTIMPsincellsignaling.CancerMetastasisRev.2006,25(1):99-113.Guo-HuaDong,Chang-TianWang,YunLi,etal.Cardiopulmonarybypassinducedmicrocirculatoryinjuryofthesmallbowelinrats.WorldJGastroenterol2009July7;15(25):3166-3172.M.Corbel,E.BoichotandV.Lagente.RoleofgelatinasesMMP-2andMMP-9intissueremodelingfollowingacutelunginjury.BrazilianJournalofMedicaland