SLE病人及其子代与SLE相关基因及抗体关系研究

SLE病人及其子代与SLE相关基因及抗体关系研究sle病人及其子代与sle相关基因及抗体关系研究【本文关键词语】红斑狼疮,系统性;hla抗原;疾病遗传易感性;等位基因【内容摘要】目的讨论缓解期系统性红斑狼疮(sle)病人所生后代罹患sle的危险性。方法应用实时定量pcr技术检测14例sle病人、病人后代及18例对照者hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602的频率，免疫印迹法检测入组者ena抗体谱。结果sle病人组dqa1*0102频率显著高于对照组(rr=2.02,p0.05)，而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602频率比较差别无显著意义(p0.05);sle病人组dqb1*0602频率显著高于其后代组(rr=2.06,p0.05)，而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102频率比较差别无显著性(p0.05);sle后代组dqa1*0102频率显著高于对照组(rr=2.14，p0.05);而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602频率比较差别无显著性(p0.05)。sle病人组本身抗体ssa及dsdna出现频率明显高于对照组(p=0.019、0.015)，两组间ssb及ro52差别无显著性(p0.05);sle病人后代组所测本身抗体检出率为0。结论hladqa1*0102为sle的易感等位基因，dqa1*0102有一定的遗传倾向。经过系统治疗到达缓解期的sle病人生育的后代罹患sle的危险性无明显增长趋势。【本文关键词语】红斑狼疮,系统性;hla抗原;疾病遗传易感性;等位基因associationofslepatientsandtheirfilialgenerationwithslerelatedgenesandantibodiessunhuanxia,suhouheng,cuijiajia,etal(departmentofimmunologyandrheumatology,qingdaouniversitymedicalcollege,qingdaomunicipalhospital,qingdao266071,china);[abstract]objectivetoexploretheriskofsufferingfromsystemiclupuserythematosus(sle)inchildrenbornbypatientswithsleatparacmasis.methodsthefrequenciesofhladrb1*1501,drb1*0301,dqa1*0102anddqb1*0602allelesof14slepatientsandtheirchildren,and20healthycontrolsweredetectedbyrealtimepcrtechnologyandenaantibodyrepertoirebyimmunoblotting.resultsinslegroup,thefrequencyofdqa1*0102allelewassignificantlyhigherthanthatinthecontrols(rr=2.02,p0.05),andnosignificantdifferencesoffrequenciesofdrb1*1501,drb1*0301,anddqb1*0602allelewerenotedbetweenthetwogroups(p0.05);thefrequencyofdqb1*0602alleleinslepatientswassignificantlyhigherthanthatoftheirchildren(rr=2.06,p0.05),andnosignificantdifferencewasfoundbetweenthemintermsofdrb1*1501,drb1*0301,dqa1*0102allele(p0.05).inslechildrengroup,dqa1*0102allelefrequencywassignificantlyhigherthanthatofthehealthycontrols(rr=2.14,p0.05),andthedifferencesofdrb1*1501,drb1*0301,anddqb1*0602allelewerenotsignificantbetweenthetwogroups.thefrequenciesofautoantibodiesssaanddsdnainslepatientswerehigherthanthatofthecontrols(p=0.019,0.015),andnostatisticaldifferencesofssbandro52wererecordedbetweenthetwogroups(p0.05).thedetectionrateofautoantibodywasnilinthepatients’children.conclusionhladqa1*0102isasusceptibleallelewithgeneticpredisposition.theriskofsufferingsleinsonsordaughtersbornbyslepatients,atcatabasisaftersystematictherapy,isnotincreased.[keywords]iupuserythematosus,systemic;hlaantigen;geneticpredispositiontodisease;allele系统性红斑狼疮(sle)是一种严重危害人类健康的难治性本身免疫性疾病。近年来，随着、实验室检测技术的发展、微卫星标记和扫描技术的应用以及医生对sle认识的不断提升，sle检出率呈上升趋势。sle固然好发于20～45岁的育龄女性，但却不影响女性病人的生育能力。如今，大多数sle病人能够成功妊娠并生育健康的孩子[1]，但其后代罹患sle的危险性一直是人们极其关注的问题。大量的研究表示清楚，遗传因素在sle的易感性及其表达方面起侧重要作用，其中hladr2、dr3等基因与sle的相关性在很大水平上已被证明。有关sle母亲带有hlaⅱdr2、dr3基因能否增长其后代患sle的危险性，经系统治疗缓解后sle病人生育的后代sle相关基因及本身抗体的研究，国内外报道较少。本研究对2003—2009年在我院住院和门诊就诊的sle病人及其后代进行研究,以探究缓解期sle病人所生后代罹患sle的危险性。现将结果报告如下。1对象与方法1.1研究对象本文14例sle病人(b组)系无血缘关系的山东汉族sle母亲，均符合1982年美国风湿病协会(acr)修正的sle诊断标准4条或4条以上，年龄26～37岁,平均32岁。14例sle后代均为sle病人经系统性治疗完全缓解后所生后代(c组),年龄1～17岁,平均6岁(其中2例sle病人后代因年龄小血样未收集到，故入组sle后代共12例)。同时，选择同种族同地域健康对照者(a组)18例,年龄23～37岁,平均26岁;均排除本身免疫性疾病及其家族史。1.2实验方法1.2.1dna抽提受试者收集外周静脉血2ml于edta抗凝管中。采取invitrigen的purelinktmgenomicdna提取试剂盒,按操作步骤提取上述实验对象全血dna,置4℃保存，备用。1.2.2pcr扩增采取实时定量pcr技术检测所有入组者的hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因。目的基因引物序列见表1，各对引物分别特异性扩增等位基因hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*0301。另外，设计一对上下游引物βaction作为内参照引物,以检测扩增体系。表1hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*0301引物序列等位基因引物序列引物源于cellmolneurobiol[2]，引物均由上海生工生物工程技术效劳设计合成。pcr反应体系20μl,各反应体系均含有下面组分：带有rox的platinumsybrgreenqpcrsupermixudg10μl，10μmol/l正向引物(f)1μl,10μmol/l反向引物(r)1μl,模板dna2μl,高压灭菌蒸馏水6μl。三步循环法pcr扩增条件:预先50℃udg孵育2min，95℃预变性2min;然后95℃变性15s，退火温度退火45s,72℃延伸30s，共进行35个循环，最后4℃保存。hladrb1*0301、drb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602基因退火温度分别为56.7℃、62.3℃、58.4℃、62.3℃。研究对象部分pcr产品经琼脂糖凝胶电泳检测等位基因扩增情况。1.2.3本身抗体ena谱的检测采取免疫印迹法检测所有研究对象本身抗体ena谱。1.3统计学处理基因频率的计算采取直接计数法,用精到准确检验四格表资料的fasher确切概率法计算确切概率p值。对基因频率的差别有统计意义的等位基因进一步做疾病相关性分析，计算相对危险度rr。2结果2.1sle病人drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因检测b组病人dqa1*0102等位基因频率显著高于a组(rr=2.02,p0.05);两组间dqb1*0602、drb1*1501、drb1*0301等位基因频率比较，差别无显著性(p0.05)。b组病人dqb1*0602频率显著高于c组，差别有显著性(rr=2.06,p0.05);而drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102等位基因两组比较差别无显著意义(p0.05)。c组dqa1*0102等位基因频率显著高于a组(rr=2.14,p0.05);而其drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602等位基因两组间比较差别无显著性(p0.05)。见表2。2.2各组本身抗体ena谱检测b组本身抗体出现频率均较a、c组高。其中，本身抗体ssa及dsdna出现频率明显高于a组(p=0.019,0.015)，而ssb及ro52频率虽高于a组，但差别无显著性(p0.05);a组除ssa、ssb、dsdna、ro52等4种本身抗体外，另外5种抗体均未测出。c组所测本身抗体均未测出。各种抗体出现频率和百分率见表3。3讨论当前，国内外对sle的研究报道重要集中于不同人种、种族的易感基因及家族同患病例。而同时将sle病人及其经系统治疗到达完全缓解后病人生育的后代，从基因和本身抗体等方面进行研究，探表2hladrb1、dqa1、dqb1基因与sle的关联情况表3各组ena谱检测情况(例)抗体究缓解期sle病人所生后代罹患sle的危险性的报道尚属罕见。本实验对sle病人、病人后代从基因及抗体等方面进行研究，探究sle后代罹患sle的危险性。本实验sle相关基因研究结果显示，sle病人dqa1*0102等位基因频率较a组显著增高，差别具有显著性，因而以为dqa1*0102等位基因可能为sle的易感基因，这与国内外dqal*0102对sle有遗传易感倾向的结论相一致[3];b组与a组dqb1*0602等位基因的出现频率比较差别无显著意义，提示无法确定dqb1*0602等位基因能否为sle的风险基因。本实验drb1*1501、drb1*0301等位基因频率b组与a组比较差别无显著意义,而对上海等地区的研究表示清楚，dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*1501、drb5*0101为汉族的sle易感基因型。b组dqa1*0102等位基因频率与c组比较差别无显著性，而c组dqa1*0102等位基因频率显著高于a组,这提示sle母亲增长了sle易感等位基因dqa1*0102在其后代中出现的危险性，dqa1*0102有一定的遗传易感性。c组等位基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602与a组比较差别无显著意义，这表示清楚经系统性治疗到达缓解期的sle病人所生育的后代与健康者相比携带sle相关基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602的危险无明显增长的趋势。sle的特征是产生大量致病性ena[4]。本实验结果显示，sle病人多种本身抗体同时出现的频率高。其中抗sm抗体和ssb抗体阳性率分别为14.3%、7.1%，较sle病人上述2种抗体阳性率分别为29.6%、15%的报道低[5]，可能与病例数较少有关。抗dsdna抗体具有较高特异性,几乎仅发现于sle病人中。文献报道sle病人抗dsdna抗体阳性率为52.7%[4]，而本实验抗dsdna抗体阳性率为71.4%，可能与入组sle病人病情处于活动期有关。抗dsdna抗体是sle病情活动的指标，抗体效价随病情缓解而下降。本文抗ssa抗体阳性率57.1%，较抗ssa抗体在sle中阳性率35%的报道高[6];许多研究证明抗ssa抗体可造成新生儿狼疮及先天性房室传导阻滞，本文sle病人后代9种本身抗体中的5种均未测出，这从一定水平上说明经系统性治疗到达缓解期的sle病人所生育的后代，固然有携带sle易感基因的危险，但出现sle本身抗体的概率很低。sle本身抗体与其相关基因有关联。olsen等[7]报道，碧眼儿sle的抗dsdna抗体与hladr3、dr2、dq2、dq6相关;国内文献报道，江苏汉族sle病人抗dsdna抗体与hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602相关，云南汉族sle病人抗dsdna抗体的产生与dqb1*0602相关，与drb1*1501*1502dqa1*0102dqb1*0602单倍型相关，这提示不同种族、地区sle病人本身抗体与hla的关联存在等位基因差别。本实验由于病例数较少,未做本身抗体与基因的相关分析,b组抗dsdna抗体与等位基因dqa1*0102、dqb1*0602检出率均相当高。hladrb1*0301、dqa1*0102以及dqb1*0602均阳性的sle母亲，其所生子代出现本身抗体ssa()、ro52()、ssb(+)、dsdna()、nu(+)的频率高，这提示sle母亲存在多个sle相关基因、多种本身抗体，十分是ssa、ssb、ro52高滴度可能是sle病人子代罹患sle的高度危险因素，这与抗ro/ssa和抗la/ssb抗体与新生儿狼疮高度相关的报道结果相符[8]。buyon[9]的研究也证明，chb病人的母亲血清中均含抗ro抗体和(或)抗la抗体。本实验从hladr、dq基因和ena抗体谱等方面进行分析，结果显示完全缓解期sle病人生育后代罹患sle的危险性无明显增长趋势，与sle病人病情控制稳定后能够安全妊娠的报道相符[10]。但有研究报道7～16岁的sle病人后代的学习无能发病率增长，其中诵读困难最普遍，与诵读困难相关的抗体分别为抗ro/ssa抗体和抗磷脂抗体[11]。因而，采集sle病人所生后代的资料,进行神经功能检测等远期随访是很需要的，但当前这方面的资料尚少见。【以下为参考文献】[1]doriaa,tincania,lockshinm.challengesoflupuspregnancies[j].rheumatology,2008,47ⅲ9ⅲ12.[2]ghabaeem,bayatia,sadeghianh,etal.analysisofhladr2dq6(drb1*1501,dqa1*0102,dqb1*0602)haplotypesiniranianpatientswithmultiplesclerosis[j].cellmolneurobiol,2009,29:109114.[3]schreuderg,hurleyck,marshge,etal.thehladictionary2001:asummaryofhlaa,b,c,dqa1/3/4/5,dqb1allelesandtheirassociationwithserologicallydefinedhlaa,b,c,dr,anddqantigens[j].eurjimmunogenet,2001,28:565596.[4]刘丰海,原江水,宋卫青.系统性红斑狼疮病人本身抗体的变化及意义[j].青岛大学医学院学报,2009,45(1):30.[5]nijd,yaox,panhf,etal.clinicalandserologicalcorrelatesofantismautoantibodi