天然药物化学讲义(张建超)

天然药物化学讲义张建超湖北中医学院药学院药物化学教研室天然药物化学为药学专业的专业课，根据教学大纲的要求及学校的安排，课堂讲课40学时，实验40学时，共80学时。天然药物化学内容分为总论和各论两局部。总论主要阐述了研究天然药物有效成分常用的各种色谱别离方法和各种结构鉴定方法。各论是本课程的重点，在讨论了糖和苷的一般性质和结构研究法根底上，将所有的天然产物按照其结构母核分为苯丙素类、蒽醌类、黄酮类、萜类和挥发油、三萜及其苷类、甾体及其苷类、生物碱等七个局部，详细论述了它们的结构特点、理化性质、提取别离和结构鉴定，并结合生物活性及临床应用介绍了一些有代表性的化合物。现将每章节教学的目的要求、教学时数、教学重点和难点、思考题等方面的内容具体安排如下：第一章总论目的要求：1．了解天然药物化学的开展及其重要性。2．了解天然药物的几个主要生合成途径。3．掌握天然药物有效成分的提取及各种别离方法，掌握色谱技术中洗脱剂选择的原那么。4．熟悉化合物结构研究的主要程序及主要方法。教学时数：6学时。教学重点和难点：〔主要局部〕重点、难点、疑难解析天然药物：来源于植物、动物、海洋生物的生理活性物质人类历史以来，世界各国，主要是植物据估计全球约有40万~50万种植物，我国植物记载约3万8千种。天然药物资源种类约一万多种目前应用约五六千种，常用约七八百种世界卫生组织拟订根本药物，10%直接来源于植物，30%与植物相关据美国?AnnualReportsofMedicinalChemistry?统计，1984~1995年间FDA美国药品和食品管理局批准生产的新药抗菌药78%来源于天然产物或其半和成品抗癌药61%降压药48%抗感染药63% 目前：研究论文115，000篇天然化合物129，000个研究过48，000种植物、动物、海洋生物、微生物。参考书：王宪楷?天然药物化学?88年版姚新生?天然药物化学?94年版徐任生?天然产物化学?期刊：?Phytochemistry??JournalofNaturalProducts?—?plantamedica?新期刊：?PhytochemicalAnalysis??NaturalProductsLetter??InternationalJournalofPharmacogonosy??药学学报??植物学报??化学学报??中国中药杂志??中草药?工具书:?TheDictionaryofNaturalProducts?天然药物化学研究的内容和目的一、内容天然药物化学：运用现代科学技术和方法研究天然药物中的化学成分的一门学科化学成分——活性成分〔细胞毒活性〕现代科学技术：提取技术、色谱别离技术、光谱解析技术、化学修饰改造、生物转化技术主要研究内容：A.各类天然药物中的化学成分B.化学成分的理化性质：〔1〕熔点mp.结晶，溶解度，酸碱性〔2〕显色反响，化学转化，C.提取方法、别离方法、精制方法D.化合结构测定和鉴定E.对活性成分进行结构改造、化学和生物转化概念：有效成分——具有生物活性的、单一的〔纯品〕、结构式确定的有机化合物。其有一定的物理常数。有效部位——药理和临床有效的、多种成分的混合物。其是提取过程中的某一部位。常多是某一类化合物。4．特点天然药物中常有多种有效成分例如：天然药物鸦片中吗啡镇痛作用罂粟碱解痉作用可待因止咳作用天然药物有效成分作用机理复杂多种成分的药理协同作用e。g.天然药物人参——人参皂苷类单一成分活性差，研究天然药物必须慎密、系统、全面投资大，研究周期长，风险大。二、目的1．控制天然药物及其制剂的质量天然药物受产地、采收季节、加工、贮存影响有效成分变化，制剂质量难以控制提高质量必须知道主要成分及其结构提高有效成分含量，改进工艺，改进剂型。减低原植物毒性,并提高疗效寻找有效部位或有效成分除去无效和有毒成分eg.长春花中抗癌有效成分——长春碱〔VLB〕、长春新碱(VCR)植物中含量为4/100，000和1/1，000，000粗制品毒性大，疗效差。扩大天然药物的资源确定有效成分后，寻找其他植物中是否也含有扩大药物资源eg.小檗碱首先在毛茛科植物黄连后在防己科、芸香科、罂粟科、小檗科等加兰他敏首先石蒜科石蒜属，后在水仙属寻找新结构化合物及新药开发先导化合物，开发新药普鲁卡因——古柯叶中古柯碱蒿甲醚——黄花蒿中青蒿素探索天然药物治病的原理别离出有效成分可以研究其化学构与疗效、毒性的关系天然药物化学研究的概况我国古代晋代葛洪?抱朴子?宋代沈括?梦溪笔谈?明代李时珍?本草纲目?中药炮灸欧洲1769年瑞典药师scheele制备酒石酸1804年法国药师derosne德国药师sertuner自鸦片中别离吗啡说明吗啡结构人工合成吗啡1960年代，各种色谱别离技术1970年代，光谱解析确定化合物结构技术(UV,IR,NMR,MS)1995年~计算机辅助解析结构,2-DNMR技术〔COSY,β-COSY,TOCOSY,NOESY，est.〕HPLC-MSGC-MS.ESI-MS我国植物资源丰富，开发生产了麻黄碱、芦丁、洋地黄毒苷、咖啡因、小辟碱、加兰他敏、薯芋甾苷元、银杏黄酮等生物合成一次代谢及二次代谢植物体内的物质与生物合成过程hv/叶绿素CO2+H2O葡萄糖erythrose赤藓糖malonyl-CoA丙二酸单酰辅酶Ashikimicacid莽草酸polyketide聚酮mevalonicacid甲戊二羟酸glycolysis糖酵解phosphoenolpyruvate磷酸烯醇丙酮酸葡萄糖代谢磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A丙二酸单酰辅酶A甲羟戊酸萜类、甾类、胡萝卜素类丙酮酸、乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A三羧酸循环〔TCA〕-------有氧分解---生成NADH(复原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)------ATP磷酸戊糖途径(HMP)乙醛酸循环途径糖酵解途径合成芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、核苷酸葡萄糖丙酮酸脂肪酸一次代谢过程：对维持生命活动类说是不可缺少的、几乎所有的植物中都有的过程。一次代谢产物：primarymetabolites糖、蛋白质、脂肪、核酸等对植物生命活动不可缺少的物质。一次代谢产物的进一步各种不同的代谢过程，各种植物中代谢过程不尽相同，生成产物称为二次代谢产物。Secondarymetabolites二、生物合成假说天然化合物的不断发现和结构分类，人希望了解这些产物在生物合成上的生源关系，有利于寻找新的天然药物，提出多种生物合成假说。如异戊二烯定那么。三、主要的生物合成途径天然药物各类化学成分简介一、糖类saccharide,carbohydrate糖的定义：多羟基醛或酮糖的存在形式：单糖、低聚糖、多糖、苷类常见单糖：五碳糖:核糖、木糖等六碳糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等单糖性质：有旋光性，易溶于水，有甜味，难溶于无水乙醇，不溶于乙醚、苯等极性小的溶剂常见低聚糖：蔗糖、麦芽糖、芸香糖易溶于水，难溶或不溶于非极性有机溶剂常见多糖：纤维素、淀粉、海藻酸、甲壳素多糖性质：大多不溶于水，溶于水多为胶体。二、有机酸含有羧基的一类化合物如：乙酸、丙酮酸，丁二酸，苹果酸，乳酸，脂肪酸等由糖代谢转化一般多与钾、钙、镁等离子或与生物碱成盐状态存在低级脂肪酸易溶于水、乙醇；难溶于有机溶剂高级脂肪酸、芳香酸易溶于有机溶剂；难溶于水有机酸可生成钡盐、钙盐、铅盐〔用醋酸铅或碱式醋酸铅〕沉淀三、鞣质tanin(单宁、鞣酸)一类复杂的多元酚类高分子化合物。抑菌、止血、收敛作用可水解鞣质由多元醇与没食子酸或没食子酸缩合物——酯化的产物没食子酸鞣花酸2．缩合鞣质C——C键相连的儿茶素苯核类多元酚类化合物儿茶素大多为无定形粉末，溶于极性较大的溶剂，不溶于极性较小的溶剂可与生物碱、重金属盐产生沉淀。3.鉴别：三氯化铁可水解鞣质〔蓝色或蓝黑色〕缩合鞣质〔绿色或黑绿色〕溴水无沉淀黄棕色沉淀新制石灰水青灰色沉淀棕色或红棕色沉淀四、植物色素叶绿素类叶黄素类胡萝卜素类、黄酮类、醌类五、树脂resin树脂是一类复杂的混合物，常与挥发油、树胶、有机酸等混合酸类树脂：二萜酸、三萜酸类及其衍生物醇类树脂：二萜、三萜、多萜醇或酚类脂类树脂：树脂醇与芳香酸等成脂烃类树脂：结构复杂的中性化合物六、氨基酸、蛋白质1．氨基酸aminoacids蛋白质组分氨基酸——20多种，多为α——氨基酸南瓜子氨酸使君子氨酸非蛋白质组分氨基酸——200种大多溶于水、稀醇，难溶于非极性有机溶剂。氨基酸两性，能成分子内盐，等电点时溶解度最小2．蛋白质protein氨基酸以肽键的形式结合形成的大分子化合物蛋白质结构：α---螺旋结构。每3。6个残基一圈蛋白质空间结构破坏——变性失活。加热、强酸、强碱活性蛋白质溶于水，可用乙醇、硫酸胺、氯化钠沉淀变性蛋白质不溶于水。与鞣质、三氯醋酸、苦味酸、硅钨酸等产生沉淀与多种重金属盐产生沉淀〔汞盐、铅严〕七、脂肪油、甾醇1．脂肪油fattyester一分子甘油与三分子脂肪酸形成酯。比水轻，不溶于水，溶于石油醚、苯、氯仿、醚、丙酮、热乙醇。无挥发性脂肪酸——较多C16、C18不饱和酸，较少C20、C22酸2。甾醇类steroids谷甾醇、豆甾醇、胆甾醇等，多为植物生长激素,是甾体类β—谷甾醇提取别离和鉴定的方法第一节 提取别离的方法经典方法:溶剂提取别离色谱方法：色谱技术别离一、天然药物有效成分的提取〔一〕常用溶剂的特点：环己烷，石油醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇极性：小————大亲脂性：大————小亲水性：小————大比水重的有机溶剂：氯仿与水分层的有机溶剂：环己烷~正丁醇能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮~甲醇极性最大的有机溶剂：甲醇极性最小的有机溶剂：环己烷介电常数最小的有机溶剂：石油醚常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：正丁醇溶解范围最广的有机溶剂：乙醇〔二〕各种提取方法：常见的提取方法有：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法。其中，溶剂提取法应用最广。溶剂提取法〔1〕溶剂提取法的原理：根据相似者相溶原理，选择与化合物极性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出来，同时，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其极性与溶剂极性相差较大的化合物也可溶解出来。〔2〕各种溶剂提取法溶剂提取法一般包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等，其使用范围及特点见下表。提取方法溶剂操作提取效率使用范围备注浸渍法水或有机溶剂不加热效率低各类成分，尤遇热不稳定成分出膏率低，易发霉，需加防腐剂渗漉法有机溶剂不加热—脂溶性成分消耗溶剂量大，费时长煎煮法水直火加热—水溶性成分易挥发、热不稳定不宜用回流提取法有机溶剂水浴加热—脂溶性成分热不稳定不宜用，溶剂量大连续回流提取法有机溶剂水浴加热节省溶剂、效率最高亲脂性较强成分用索氏提取器，时间长〔2〕水蒸气蒸馏法：适用于具有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水的成分的提取，如挥发油、小分子的香豆素类、小分子的醌类成分。〔3〕升华法：固体物质受热不经过熔融，直接变成蒸汽，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。中草药中有一些成分具有升华的性质，可以利用升华法直接自中草药中提取出来。如樟脑、咖啡因。二、别离与精制：〔一〕根据物质溶解度差异进行别离结晶及重结晶法利用不同温度可引起物质溶解度的改变的性质以别离物质。将不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作称结晶；将不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程称重结晶。〔1〕溶剂选择的一般原那么：不反响；冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大；对杂质溶解度很大或很小；沸点低，易挥发；无毒或毒性小。假设无理想的单一溶剂时，可以考虑使用混合溶剂。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。〔2〕结晶操作：结晶操作实际是进一步别离纯化过程，一般是应用适量的溶剂在加热至沸点的情况下将化合物溶解，制成过饱和溶液，趁热过滤去除不溶性杂质，放置冷处，以析晶。〔3〕结晶纯度的判定：结晶形态和色泽：单一化合物的结晶具有结晶形状均一和均匀的色泽。熔点和熔距：单一化合物具有一定的熔点和较小的熔距，结晶前后的熔点应一致，熔距很窄，在1℃2色谱法：单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不同的溶剂系统展开，均为一个斑点者。2．溶剂别离法：〔1〕在中草药提取液中参加另一种溶剂以改变混合物溶剂的极性，使一局部物质沉淀析出，从而实现别离。如：水—醇法除多糖、蛋白质等水溶性杂质；醇—水法除树脂、叶绿素等水不溶性杂质；醇—醚法或醇—丙酮法使苷类成分，而脂溶性树脂等杂质那么存留在母液中。〔2〕对酸性、碱性或两性有机化合物来说，通常通过参加酸、碱以调节溶液的pH，以改变分子的存在状态〔游离型或解离型〕，从而改变溶解度而实现别离。如：酸提碱沉法，碱提酸沉法等。〔3〕沉淀法：酸性或碱性化合物还可通过参加某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀等析出。如参加铅盐、雷氏铵盐等。〔二〕根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行别离。1．两相溶剂萃取法〔1〕原理：利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的不同而实现别离。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，那么别离效率越高。=1\*GB3①分配系数K值〔即分配比〕：溶质在两相溶剂中的分配比〔K〕在一定温度及压力下为一常数=2\*GB3②别离难易与别离因子：别离因子可以表示别离的难易。别离因子可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。一般情况下，≥100，仅作一次简单萃取就可实现根本别离；但100≥≥10时，那么需萃取10~12次；≤2时，要实现根本别离，需作100次以上萃取才能完成。≌1时，那么KA≌KB，意味着两者性质及其相似，即使作任意次分配也无法实现别离。实际工作中，尽量选择别离因子值大的溶剂系统，以求简化别离过程，提高别离效率。=3\*GB3③分配比与pH：对酸性、碱性及两性化合物来说，分配比还受溶剂系统的影响。因为pH的变化可以改变它们的存在状态〔游离型或解离型〕，从而影响在溶剂系统中的分配比。酚类化合物的pKa值一般为9.2~10.8，羧酸类化合物的pKa值约为5。一般pH3时，酸性物质多呈非解离状态〔HA〕、碱性物质那么呈解离状态〔BH+〕存在；但pH12，那么酸性物质多呈解离状态〔A—〕、碱性物质那么呈非解离状态〔B〕存在。据此，可采用在不同pH的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法，使酸性、碱性、中性及两性物质的以别离。〔2〕各种萃取方法：=1\*GB3①简单萃取：利用分液漏斗进行两相溶剂萃取。=2\*GB3②逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多根的萃取管。=3\*GB3③逆流分配法〔CCD〕：又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于别离具有非常相似性质的混合物效果较好。=4\*GB3④液滴逆流分配法〔DCCC〕：本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的别离效果较差，处理样品量小，并要有一定的设备，操作较繁琐。一般50时，简单萃取即可别离，50时，那么易采用逆流分溶法。2．纸色谱〔PPC〕：纸色谱的原理与液—液萃取法根本相同。原理：分配原理支持剂：纤维素固定相：水流动相：水饱和的有机溶剂Rf值：化合物极性越小，Rf值越大；反之，化合物极性越大，Rf值越小。应用：用作微量分析，特别适合于亲水性较强的成分，其层析效果往往比吸附薄层色谱效果好。但纸层析一般需要较长的时间。3．液—液分配柱色谱：原理：分配原理支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等正相分配色谱：固定相：水、缓冲溶液流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之，化合物极性越大，越后出柱。应用：通常用于别离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。反相分配色谱：固定相：石蜡油、化学键合固定相流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于别离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。4．液—液分配薄层色谱法：液—液分配色谱法也可在硅胶薄层色谱上进行。因此，液—液分配柱色谱的最正确别离条件可以根据相应的薄层色谱结果〔正相柱用正相薄层色谱，反相柱用反相薄层色谱〕进行选定。5．化学键合固定相：常用反相硅胶薄层色谱及柱色谱的填料是普通硅胶经以下方式进行化学修饰，键合上长度不同的烃基〔R〕、形成亲油外表而成。其中以硅烷化键合型最为常用，其根据烃基〔R〕长度〔—C2H5、—C8H17、—C18H37、〕分别命名为：RP—2、RP—8、RP—18。三者亲脂性强弱顺序如下：RP—18RP—8RP—2。键合固定相的作用并非只是分配，也有一定的吸附作用。5．加压相色谱法：加压相色谱法又分为：快速柱色谱〔约2.02105Pa〕，Lobar低压柱色谱〔5.05105Pa〕，中压柱色谱〔20.2105Pa〕，分析用HPLC，制备用HPLC〔20.2105Pa〕。固定相：RP—2、RP—8或RP—18流动相：水—甲醇或水—乙腈洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：通常用于别离水溶性或极性较大的成分，如苷类、酚性化合物等。〔三〕根据物质的吸附性差异进行别离其中以固—液吸附用的最多，并有物理吸附〔硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱〕、化学吸附〔黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等〕及半化学吸附〔聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间〕之分。1．物质的吸附规律：〔1〕物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱大体遵循“相似者易于吸附〞的经验规律。〔2〕被别离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。硅胶显微酸性，适于别离酸性和中性化合物，别离生物碱时需在流动相中参加适量的有机碱；氧化铝呈碱性，适于别离生物碱等碱性成分，不宜用于别离有机酸、酚性等酸性成分。均为极性吸附剂，故有以下特点：=1\*GB3①被别离物质极性越强，吸附力越强。强极性溶质将优先被吸附。=2\*GB3②溶剂极性越弱，那么吸附剂对溶质的吸附能力越强。随溶剂极性的增强，那么吸附剂对溶质的吸附力将减弱。=3\*GB3③当参加极性较强的溶剂后，先前被硅胶或氧化铝所吸附的溶质可被置换而洗脱出来。常用的非极性吸附剂：活性炭。对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。2．极性及其强弱判断：〔1〕一般化合物的极性按以下官能团的顺序增强：—CH2—CH2—，—CH2=CH2—，—OCH3，—COOR，>C=O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH〔2〕溶剂的极性可大体根据介电常数的大小来判断。介电常数越大，那么极性越大。一般溶剂的介电常数按以下顺序增大：环己烷〔1.88〕，苯〔2.29〕，无水乙醚〔4.47〕，氯仿〔5.20〕，乙酸乙酯〔6.11〕，乙醇〔26.0〕，甲醇〔31.2〕，水〔81.0〕3．吸附柱色谱法用于物质的别离：以硅胶或氧化铝为吸附剂进行柱色谱别离时：〔1〕尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，或用极性稍大的溶剂溶解样品后，以少量吸附剂拌匀挥干，上柱。〔2〕一般以TLC展开时使组分Rf值到达0的溶剂系统作为最正确溶剂系统进行洗脱。实践中多用混合的有机溶剂系统。〔3〕为防止化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝作为吸附剂进行别离。通常在别离酸性〔或碱性〕物质时，洗脱溶剂中常参加适量的醋酸〔或氨、吡啶、二乙胺〕，以防止拖尾、使斑点集中。5．聚酰胺吸附色谱法：〔1〕原理：氢键吸附。一般认为系通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。〔2〕吸附能力的强弱通常化合物在水溶剂中大致有以下规律：=1\*GB3①形成氢键的基团数目越多，那么能力越强。=2\*GB3②成键位置对吸附能力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附响应减弱。=3\*GB3③分子中芳香化程度高这，那么吸附性增强；反之，那么减弱。一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱致强的大致顺序如下：水—甲醇—乙醇—氢氧化钠水溶液—甲酰胺—二甲基甲酰胺—尿素水溶液其中，最常应用的洗脱系统是：乙醇—水〔3〕应用：=1\*GB3①特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备和别离。=2\*GB3②脱鞣质处理=3\*GB3③对生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等其他极性与非极性化合物的别离也有着广泛的用途。6．大孔吸附树脂：通常分为极性和非极性两类。〔1〕原理：吸附性和分子筛性相结合。吸附性是由范德华引力或氢键引起的。分子筛是由于其本身多孔性结构产生的。〔2〕影响因素：=1\*GB3①一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性化合物在水中易被极性树脂吸附。糖是极性水溶性化合物，与D型非极性树脂吸附作用很弱。=2\*GB3②物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小，反之就大。〔3〕应用：广泛应用于化合物的别离与富集工作中。如：苷类与糖类的别离，生物碱的精制，多糖、黄酮、三萜类化合物的别离等。〔4〕洗脱液的选择：洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。最常用的是乙醇—水。〔四〕根据物质分子大小进行别离1．凝胶过滤法：〔1〕原理：分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行别离。〔2〕出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到别离。〔3〕常用的溶剂：=1\*GB3①碱性水溶液〔0.1mol/LNH4OH〕含盐水溶液〔0.5mol/LNaCl等〕=2\*GB3②醇及含水醇，如甲醇、甲醇—水=3\*GB3③其他溶剂：如含水丙酮，甲醇-氯仿〔4〕凝胶的种类与性质：种类很多，常用的有以下两种：=1\*GB3①Sephadex-G：只适用于水中应用，且不同规格适合别离不同分子量的物质。=2\*GB3②SephadexLH-20：为SephadexG-25经羟丙基化后得到的产物，具有以下两个特点：具有分子筛特性，可按分子量大小别离物质；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用，适合于不同类型有机物的别离。应用最广。2．膜过滤法：〔1〕概念：膜过滤法是一种用天然或人工合成的膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行别离、分级、提纯或富集的方法。〔2〕分类：膜过滤技术主要包括渗透、反渗透、超滤、电渗析、液膜技术等。3．透析法：透析法是膜过滤法中的一种。〔1〕原理：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜、而大分子物质不能透过半透膜的性质，以到达别离的目的，本质上是一种分子筛作用。〔2〕应用：对于生物大分子，一般可以通过透析法进行浓缩和精制。如药用酶的精制。别离和纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等大分子物质，可将其留在半透膜内，而将如无机盐、单糖、双糖等小分子的物质透过半透膜，进入膜外的溶液中，而加以别离精制。应用：〔五〕根据物质解离程度不同进行别离具有酸性、碱性、两性基团的化合物在水中多呈解离状态，据此可用离子交换法进行别离。原理：离子交换原理固定相：离子交换树脂流动相：水或含水溶剂洗脱液：强酸性阳离子交换树脂〔H型〕——稀氨水洗脱强碱性阴离子交换树脂〔OH型〕——稀氢氧化钠洗脱1．分类：根据交换基团不同分为：=1\*GB3①阳离子交换树脂强酸性〔—SO3-H+〕弱减性〔—COO-H+〕=2\*GB3②阴离子交换树脂强碱性[—N+〔CH3〕3Cl]弱减性〔—NH2及仲胺、叔胺基〕2．应用：=1\*GB3①用于不同电荷离子的别离，如水提取物中的酸性、碱性、两性化合物的别离。=2\*GB3②用于相同电荷离子的别离，如同为生物碱，但碱性强弱不同，仍可用离子交换树脂别离。〔六〕根据物质的沸点进行别离——分馏法1．概念：分馏法是利用中药中各成分沸点的差异进行提取别离的方法。一般情况下，液体混合物沸点相差100℃以上时，可用反复蒸馏法；沸点相差252．应用：挥发油、一些液体生物碱的提取别离常采用分馏法。三、结构研究法思考题：1．中草药有效成分的提取方法有哪些？其各自的使用范围及其优缺点是什么？别离中草药成分常用的色谱方法有哪些？他们分别适用于哪些类别化合物的别离？各自最常用的洗脱剂及洗脱顺序是什么？化合物在进行结构鉴定前应注意什么问题？进行结构鉴定常用哪些方法？这些方法可以解决结构式中的什么问题？第二章糖和苷目的要求：1．熟悉糖的结构类型，掌握糖Haworth式的端基碳构型、构象及糖的理化性质。2．熟悉苷的结构类型，掌握苷的一般性质、苷键的裂解方法及其裂解规律。3．熟悉糖和苷的提取别离方法。4．掌握苷元和糖、糖和糖之间连接位置、连接顺序以及苷键构型确实定方法。教学时数：6学时。重点和难点：一、概述糖类又称碳水化合物〔carbohydrates〕，是植物光合作用的初生产物，是一类最丰富的天然产物，其与人类关系极为密切，食用的蔗糖、粮食的主要成分淀粉、棉布的棉纤维等。糖类在中草药中分布十分广泛，常常占植物干重的80%~90%。糖类与核酸、蛋白质、脂质一起合称生命活动所必需的四大类化合物。从化学结构上看是多羟基内半缩醛〔酮〕及其缩聚物。根据其分子水解反响的情况，可以分为单糖、低聚糖和多糖。1．单糖：不能水解的最简单的多羟基内半缩醛〔酮〕。如葡萄糖等。2．低聚糖：水解后生成二、三、四、……九个单糖分子的糖。如：蔗糖〔D-葡萄糖-D果糖〕麦芽糖〔葡萄糖1→4葡萄糖〕3．多糖：水解后能生成多个单分子的，称为多糖。如：淀粉、纤维素等由一种单糖组成——均多糖由二种以上单糖组成——杂多糖苷——糖+非糖。如：黄酮苷、皂苷等。二、结构类型㈠糖的表示式单糖是多羟基醛或酮。从三碳糖至八碳糖天然界都有存在。以Fischer式表示天然常见糖如下：单糖在水溶液中形成半缩醛环状结构，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元环结构的糖——吡喃糖〔pyranose〕具有五元环结构的糖——呋喃糖〔furanose〕单糖处于环状结构时，可用Haworth式表示。如：葡萄糖〔糖处游离状态时用Fischer式表示，苷化后成环用Haworth式表示〕㈡Fischer与Haworth的转换及其相对构型单糖成环后新形成的一个不对称碳原子称为端基碳〔anomericcarbon〕。生成的一对差向异构体〔anomer〕有α、β二种构型。从Fischer式看〔C1与C5的相对构型〕C1-OH与原C5〔六碳糖〕或C4〔五碳糖〕-OH，顺式为α，反式为β。从Haworth式看C1-OH与C5〔或C4〕上取代基之间的关系：同侧为β，异侧为α。㈢糖的绝对构型〔D、L〕以α-OH甘油醛为标准，将单糖分子的编号最大的不对称碳原子的构型与甘油醛作比较而命名分子构型的方法。Fischer式中最后第二个碳原子上-OH向右的为D型，向左的为L型。Haworth式中C5向上为D型，向下为L型。㈣环的构象呋喃糖五元环接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面，几乎是固定的结构。呋喃糖六元环有船式和椅式构象，在溶液或固体状态是都是椅式构象，不是C1便是1C。[C表示椅式〔chairform〕]。以C2、C3、C5、O四个原子构成的平面为准，C4处面上，C1处面下的标为4C1，简称C1，反之1C4简称1C。Angyal用总自由能来分析构象式的稳定性，比较二种构象式的总自由能差值，能量低的是优势构象。如：葡萄糖的二种构象式的比较：三、糖苷分类㈠糖匀体指均由糖组成的物质。如单糖、低聚糖、多糖等。1．常见单糖2．氨基糖是指单糖的伯或仲醇基置换成氨基的糖类。3．糖醇单糖的醛或酮基复原成羟基后所得的多元醇称糖醇。4．去氧糖单糖分子的一个或二个羟基为氢原子代替的糖叫去氧糖。通常在C2上无-OH，强心苷中较多见。5．糖醛酸单糖分子中伯醇基氧化成羧基的化合物。㈡糖杂体糖与非糖组成的化合物。苷的分类：1．按苷原子不同分类⑴氧苷如：红景天苷⑵氮苷：如腺苷。⑶硫苷：如萝卜苷。⑷碳苷：如牡荆素。2．按苷元不同分类如：黄酮苷、蒽醌、香豆素、强心苷、皂苷等。3．按苷键⑴醇苷：是通过醇羟基与糖端基羟基脱水而成的苷。如红景天苷。⑵酚苷：是通过酚羟基而成的苷。如天麻苷。⑶酯苷：苷元以-COOH和糖的端基碳相连接的是酯苷。如山慈菇苷A。⑷氰苷：是指一类α羟腈的苷。如野樱苷。4．按端基碳构型分α苷，多为L型；β苷，多为D型。5．按连接单糖个数分1个糖——单糖苷2个糖——双糖苷3个糖——叁糖苷6．按糖链个数分1个位置成苷——单糖链2个位置成苷——双糖链7．按生物体内存在分原级苷——在植物体内原存在的苷；次级苷——原级苷水解掉一个糖或结构发生改变。例：四、糖和苷的物理性质㈠溶解性糖——小分子极性大，水溶性好，随着聚合度增高，水溶性下降。多糖难溶于冷水，或溶于热水成胶体溶液。单糖极性>双糖极性〔与羟基和碳的分担比有关，即按-OH/C的分担情况而定〕苷——亲水性〔其大小与连接糖的数目、位置有关〕。苷元——为亲脂性。㈡味觉①单糖~低聚糖——甜味。②多糖——无甜味〔随着糖的聚合度增高，那么甜味减小〕。③苷类——苦〔人参皂苷〕、甜〔甜菊苷〕等。㈢旋光性及其在构型测定中的应用具有多个不对称碳原子——用于苷键构型的测定〔即α、β苷键〕。多数苷类呈左旋。利用旋光性→测定苷键构型方法Klyne法：将苷和苷元的分子旋光差与组成该苷的糖的一对甲苷的分子旋光度进行比较，数值上相接近的一个便是与之有相同苷键的一个。例：有一苷〔G代表苷〕，知是豆甾醇的葡萄糖苷，苷元豆甾醇[M]A=-210.04〔A代表苷元〕，求苷的构型？〔：葡萄糖甲苷α=+308.6β〕解：[M]G-[M]A=△[M]=-°与题给出的β型接近，故该苷构型为β型。五、糖的化学性质糖的化学性质在普通有机化学中已有所涉及，下面介绍的主要是一些与糖的别离和结构测定密切相关的化学反响。㈠氧化反响单糖的分子有醛〔酮〕、伯醇、仲醇和邻二醇等结构，氧化条件不同其产物也不同，如：化学反响的活泼性：端基碳原子>伯碳>仲碳〔即C1-OH、C6-OH、C2C3C以过碘酸反响为例来了解糖的氧化反响的应用。过碘酸反响主要作用于：邻二醇、α-氨基醇、α-羟基醛〔酮〕、邻二酮和某些活性次甲基等结构。反响特点：〔①~⑤〕①反响定量进行〔试剂与反响物根本是1：1〕；②在水溶液中进行或有水溶液〔否那么不反响〕；③反响速度：顺式>反式〔因顺式易形成环式中间体〕；④游离单糖，产物及消耗过碘酸用Fischer式计算；成苷时糖，产物及消耗过碘酸用Haworth式计算；⑤在异边而无扭转余地的邻二醇不起反响，如：用途：〔①~④〕①推测糖中邻二-OH多少；〔试剂与反响物根本是1：1〕；②对同一分子式的糖来说，推测吡喃糖还是呋喃糖；③推测低聚糖和多聚糖的聚合度；④推测1,3连接还是1,4连接〔糖与糖连接位置〕〔糖与糖连接都是半缩醛-OH连接，即端基碳连接〕㈡糠醛形成反响〔Molish反响〕Molish反响：样品+浓H2SO4+α-萘酚→棕色环*多糖、低聚糖、单糖、苷类，与Molish反响均为〔+〕。㈢羟基反响糖的-OH反响：醚化、酯化和缩醛〔酮〕化。活性最高的半缩醛羟基〔C1-OH〕，其次是伯醇基〔C6-OH〕，仲醇次之。〔伯醇因其处于末端的空间，对反响有利，因此活性高于仲醇。〕1．醚化反响〔甲基化〕除苷键上甲氧基外，其余甲醚键对稀酸碱都很稳定，须用浓氢碘酸或氢溴酸才能开裂。〔①~④〕①Haworth法〔不常用〕含糖样品+Me2SO4+30%NaOH→醇-OH全甲基化〔需反复6~8次〕〔硫酸二甲酯〕〔浓碱〕〔甲基化物可用红外光谱测试直到无-OH吸收峰为止〕制备成甲苷——用限量试剂，即克分子比1∶1时，可得甲苷。②Purdie法样品+MeI+Ag2O→全甲基化〔醇-OH〕只能用于苷，不宜用于复原糖〔即有C1-OH的糖〕。因Ag2O有氧化作用，可使C1-OH氧化。③Hakomori法〔箱守法〕样品+DMSO+NaH+MeI→全甲基化〔一次即可〕该反响是在非水溶剂中，即二甲基亚砜〔DMSO〕溶液中进行反响。④重氮甲烷法〔CH2N2〕样品+CH2N2/Et2O+MeOH→局部甲基化〔-COOH、-CHO等〕2．酰化反响〔酯化反响〕羟基活性与甲基化反响相同〔C1-OH、C6-OH、C3最难〕[由于C2位取代后，引起的空间障碍，使得C3最难被酰化。]利用酰化可判断糖上-OH数目、保护-OH等。3．缩酮和缩醛化反响酮或醛在脱水剂如矿酸、无水ZnCl2、无水CuSO4等存在下可与多元醇的二个有适当空间位置的羟基易形成环状缩酮〔ketal〕和缩醛〔acetal〕。酮类易与顺邻-OH生成——五元环状物醛类易与1,3-双-OH生成——六元环状物糖+丙酮→五元环缩酮——称：异丙叉衍生物，即丙酮加成物。糖+丙酮→六元环缩酮——双异丙叉衍生物。例：当糖具有顺邻-OH时：当糖结构中无顺邻-OH时：易转变为呋喃糖结构。▲当单糖制成缩醛或缩酮之后，氧环大小不一定和原来游离糖相同。糖+苯甲醛→六元环状缩醛〔称：苯甲叉衍生物〕例：葡萄糖甲苷〔具有1,3双-OH结构〕+苯甲醛→苯甲叉衍生物分：顺式、反式顺式有两种构象——O内位〔C1式〕——较稳定H-内位〔1C式〕——稳定性差如：半乳吡喃糖甲苷利用缩醛或缩酮反响可以保护游离的羟基。例如：制备3-O-甲基葡萄糖的反响总之，以上方法主要目的是保护-OH。例如确定苷元与糖、糖与糖之间的连接位置方法如下：可将糖进行-OH保护后，经水解，再通过光谱分析，游离-OH为糖与糖与苷元的连接位置。㈣羰基反响复原糖+苯肼→糖腙〔多为水溶性的〕复原糖+3分子苯肼→糖脎〔较难溶于水〕▲2-去氧糖不能成脎〔因C2上无-OH〕。应用——糖的鉴定、别离和纯化。㈤硼酸络合反响糖的邻二-OH可与许多试剂生成络合物，借生成络合物的某些物理常数的改变，可以有助于糖的别离、鉴定和构型推定。重要的如：硼酸络合物、钼酸络合物、铜氨离子络合物等。糖+硼酸→络合物〔酸性增加、可离子化〕H3BO3是接受电子对的Lewis酸。1．络合反响分二步进行①先生成1：1的络合物，易失水而成平面形的中性酯。②二个-OH地位适宜，那么继续生成2：1的螺环状络合物，四面体结构固定，增加酸性。以上I、II、III三种状态在硼酸溶液中同时存在，彼此间处于平衡状态。2．对二-OH的空间要求⑴开环化合物：碳链上-OH越多，越易造成有利地位〔顺邻二-OH〕；〔如：乙二醇，二个-OH互相排斥成180°角，而不利于反响〕⑵环上的二-OH：〔①~③〕①芳环-OH——邻位易，间、对位次之；②五元、六元脂环——顺易，反邻二-OH不作用；③α-羟酸〔HO-C-COOH〕可络合〔-COOH水化成-C(OH)3后再络合〕；β-羟酸无作用。3．应用〔①~④〕①络合后，中性可变为酸性，因此可进行酸碱中和滴定；②可进行离子交换法别离；③可进行电泳鉴定；④在混有硼砂缓冲液的硅胶薄层上层析。六、苷键的裂解研究苷类的化学结构，必须了解苷元结构、糖的组成、糖和糖的连接方式，以及苷元和糖的连接方式等。为此必先使用某种方法使苷键切断。㈠酸催化水解反响苷键属于缩醛结构，易为稀酸催化水解。水解反响是苷原子先质子化，然后断键生成阳碳离子或半椅型的中间体，在水中溶剂化而成糖。反响机制说明，苷原子的碱度，亦即苷原子上的电子密度，以及它的空间环境，对水解难易有很大关系。酸水解的规律：⑴苷原子不同，酸水解难易顺序为：N>O>S>C〔C-苷最难水解，从碱度比较也是上述顺序〕⑵呋喃糖苷较吡喃糖苷易水解。因五元呋喃环的颊性使各取代基处在重叠位置，形成水解中间体可使张力减小，故有利于水解。⑶酮糖较醛糖易水解酮糖多为呋喃结构，而且酮糖端基碳原子上有-CH2OH大基团取代，水解反响可使张力减小。⑷吡喃糖苷中：①吡喃环C5上取代基越大越难水解，水解速度为：五碳糖>甲基五碳糖>六碳糖>七碳糖②C5上有-COOH取代时，最难水解〔因诱导使苷原子电子密度降低〕。⑸有氨基取代的糖较-OH糖难水解，-OH糖又较去氧糖难水解。2,3-二去氧糖>2-去氧糖>3-去氧糖>羟基糖>2-氨基糖⑹在构象相同的糖中：a键〔竖键〕-OH多那么易水解。⑺芳香属苷较脂肪属苷易水解。如：酚苷>萜苷、甾苷〔因苷元局部有供电结构，而脂肪属苷元无供电结构〕⑻苷元为小基团——苷键横键比竖键易水解，即e>a〔横键易质子化〕苷元为大基团——苷键竖键比横键易水解，即a>e〔苷的不稳定性促使其易水解〕㈡乙酰解反响1．常用试剂：醋酐+酸所用酸如：H2SO4、HClO4、CF3COOH或Lewis酸〔ZnCl2、BF3〕等。2．反响条件：一般是在室温放置数天。3．反响机理：与酸催化水解相似，以CH3CO+〔即乙酰基，Ac〕为进攻基团。▲注意：乙酰解反响易发生糖的端基异构化。4．反响速率：⑴苷键邻位有电负性强的基团〔如环氧基〕可使反响变慢。⑵β-苷键的葡萄糖双糖的反响速率：〔乙酰解易难程度〕〔1→6〕>>〔1→4〕>>〔1→3〕>>〔1→2〕5．用途⑴酰化可以保护苷元上的-OH，使苷元增加亲脂性，可用于提纯和鉴定。⑵乙酰解法可以开袭一局部苷键而保存另一局部苷键。㈢碱催化水解和β消除反响一般苷键对稀碱是稳定的，但某些特殊的苷如：酯苷、酚苷、烯醇苷、β-吸电子基取代的苷——易为碱水解C1-OH与C2-OH：反式易水解，其产物为1,6-葡萄糖酐；顺式产物为正常的糖。利用水解产物可判断苷键构型β-消除反响：苷键的β-位有吸电子基团者，使α-位氢活化，在碱液中与苷键起消除反响而开裂，称β-消除反响。作用机理：在1→3或1→4连接的聚糖中，复原端的游离醛〔或酮〕邻位氢活化而与3-O-或4-O-苷键起消除反响。这样碱能使多糖复原端的单糖逐个被剥落，对非复原端那么无影响。剥落生成的是——α-羟基糖酸。用途：可从多糖剥落反响生成的糖酸中了解复原糖的取代方式。3-O-代的糖可形成——3-脱氧糖酸4-O-代的糖可形成——3-脱氧-2-羟甲基糖酸二个以上取代的复原糖——难生成糖酸㈣酶催化水解反响用酶水解苷键可以获知苷键的构型，可保持苷元结构不变的真正苷元。酶的专属性高，选择性地催化水解某一构型的苷。如：苦杏仁酶〔emulsin〕——水解——β-葡萄糖苷键纤维素酶〔cellulase〕——同上。麦芽糖酶〔maltase〕——水解——α-葡萄糖苷键转化糖酶〔invertase〕——水解——β-果糖苷键㈤氧化开裂法〔Smith降解法〕可得到原苷元。〔除酶解外，其它方法可能得到的是次级苷元〕试剂：过碘酸〔HIO4〕、四氢硼钠〔NaBH4〕、稀酸反响过程：以上简要介绍了主要苷键的水解方法，对于一些特殊的苷键，要采取一些特殊的水解方法。如：糖醛酸的苷键——很难用稀酸水解可采用特殊的选择性水解反响——紫外光照射法、四醋酸铅分解法等。值得注意的是：有些苷键极不稳定，在较弱的酸性或在水或稀醇液中稍长时间加热即能水解。因此，在保存苷时，要注意环境，防止水解。七、糖的提取别离㈠提取主要为溶剂法——水、稀醇〔单糖、低聚糖、多糖〕糖类的提取可根据它们对乙醇和水的溶解度不同，而采用冷热水、冷热稀醇等条件。苷类分子的极性随着糖基的增多而增大。可根据其极性大小，来选择相适应的溶剂。由于植物体内有水解酶共存，必须采用适当的破坏或抑制酶的方法，才能提制出原存形式的糖和苷类。方法：采集新鲜材料——迅速加热枯燥——冷冻保存等。㈡别离1．活性炭柱色谱⑴概述用途——别离水溶性物质较好，如：氨基酸、糖类及某些苷类。特点——对于活性炭柱色谱来说：①样品上柱量大，别离效果较好，适合大量制备；②来源容易，价格廉；③缺点：无测定其吸附力级别的理想方法。分类：①粉末状活性炭——颗粒细，总外表积大，吸附力及吸附量大。②颗粒状活性炭——颗粒较上者大，吸附力及吸附量也较上者次之。③绵纶-活性炭——以锦纶为粘合剂，将粉末状活性炭制成颗粒，吸附力最弱。⑵活性炭对物质的吸附规律活性炭因为是非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对该类物质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，那么活性炭对该类物质的吸附能力也随之降低。活性炭在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。吸附规律：〔①~③〕①对极性基团〔如-COOH、-NH2、-OH等〕多的化合物吸附力大于极性基团少的化合物。〔指分子量相当的两个化合物的比较〕②对芳香族化合物吸附力大于脂肪族化合物。〔极性基团相同〕③对分子量大的化合物吸附力大于分子量小的化合物，即：多糖>单糖。对于糖的吸附力：多糖>低聚糖>单糖⑶活性炭的预处理一般预处理：活性炭→〔加热150℃，4~5小时〕——严格预处理：①枸橼酸缓冲液洗涤——后用蒸馏水反复洗②2~3mol/LHCl煮沸几次——后用蒸馏水反复洗目的——除去混杂的金属离子，如：Fe+++、Ca++、Na+等，使活力增强。⑷柱色谱①装柱：活性炭+蒸馏水→〔浸泡1小时〕→搅拌〔排除气泡〕活性炭/H2O→倒入柱中〔假设流速慢，那么需与硅藻土〔1：1〕混合后，再用蒸馏水调成糊状装柱。〕②上样：样品/H2O，浓度——25~50%〔可适当增加或减少，如为10%浓度〕；上样量适情况而定，一般1克糖用100克活性炭。③洗脱：洗脱顺序为——H2O、10%、20%、30%、50%、70%的乙醇液无机盐→二糖→三糖→多糖单糖等2．纤维素色谱原理与PC相同，属分配层析。溶剂系统：水、丙酮、水饱和的正丁醇等。用水溶性的溶剂如HAc：H2O进行展开时，其原理属吸附层析。3．离子交换柱色谱①除水提液中的酸、碱性成分和无机离子；②制成硼酸络合物——强碱性阴离子交换树脂〔不同浓度硼酸盐液洗脱〕4．凝胶柱色谱⑴葡聚糖凝胶的性质及其类型葡聚糖+交联剂〔环氧氯丙烷〕→交联葡聚糖〔醚桥形式，交联成网状结构〕为水不溶性的白色球状颗粒。在酸性环境中能水解，在碱中稳定。凝胶颗粒的外表有许多孔隙，孔隙大小决定于葡聚糖与交联剂的配比及反响条件。交联度大→网状结构紧密→孔隙小→吸水膨胀少小→疏松→大→大常用商品名称及型号：葡聚糖凝胶〔商品名：SephadexG〕[G——代表葡聚糖凝胶]G-10[10—表示吸水量乘以10，即G-151.0ml/g的吸水量]G-200等琼脂糖凝胶〔Sepharose，Bio-GelA〕聚丙烯酰胺凝胶〔Bio-GelP〕▲羟丙酰基交联葡聚糖凝胶〔SephadexLH-20〕〔为亲脂性的，可在有机溶剂中进行别离的分子筛〕⑵操作过程除葡聚糖凝胶LH-20外，均在H2O中进行。①将凝胶在适当的溶液中浸泡〔一般为洗脱剂〕；②待充分膨胀后装入层析柱；③用洗脱液洗脱；④收集、回收溶液，枯燥。洗脱溶剂的选择——别离中性物质——水及电解质溶液〔酸、碱、盐溶液及缓冲液〕。阻滞较大的组分——水+有机溶液〔水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮等〕。LH-20可用有机溶液进行溶胀〔如：CHCl3、丁醇、二氧六环等〕〔适用于：有机物质的别离，如：脂类、固醇类等。〕5．季铵氢氧化物沉淀法季铵氢氧化物是一类乳化剂。6．分级沉淀或分级溶解法在糖的水溶液中，逐步参加乙醇，即逐渐增大EtOH浓度，可得到各局部的沉淀物。7．蛋白质除去法用分级沉淀法得到的多糖，常夹杂有较多的蛋白质，为除之，通常选择能使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如：酚、三氯乙酸、鞣酸等。注意：处理时间要短，温度要低——防止多糖降解。三氟三氯乙烷法和Sevag法〔用氯仿：戊醇或丁醇4：1混合〕在防止降解上有较好效果。多糖液〔含蛋白质〕↓〔加蛋白质水解酶如：胰蛋白酶、胃蛋白酶等〕↓使蛋白质大分子进行降解Sevag法㈢糖的提取别离实例地黄根中单糖和低聚糖的别离[详见教材〔第四版〕P101实例一]取鲜根热EtOH、H2O提阴阳离子交换树脂〔除酸碱成分〕中性成分活性炭柱〔15%HOAc处理〕以H2O、稀EtOH——5、10、15、25%顺次洗脱，经PC检定，合并D-葡萄糖D-半乳糖D-果糖蔗糖棉子糖甘露三糖水苏糖毛蕊糖〔双糖〕〔三糖〕〔四糖〕〔五糖〕

八、糖的鉴定和糖链结构的测定㈠糖的鉴定在中草药成分别离工作中，或在苷和多糖的水解产物中，常常会得到一些单糖成分，须要加以证明。目前发现新单糖须要进行结构决定的时机较少，多数工作为进行糖的印证。糖的水溶性很大，且不易获得结晶，有些物理常数不易测定，给印证工作带来困难，以往用化学方法制成衍生物，再作别离鉴定，手续繁复。现多采用各种色谱技术，对糖类进行鉴定。1．纸层析展开系统：常用水饱和的有机溶剂展开。如：正丁醇：醋酸：水〔4：1：5上层〕BAW正丁醇：乙醇：水〔4：1：2.2〕BEW水饱和苯酚等溶剂系统。展开方式：上行、下行、径向显色剂：可利用糖的复原性或形成糠醛后引起的一些呈色反响。如：邻苯二甲酸苯胺硝酸银试剂〔使复原糖显棕黑色〕三苯四氮唑盐试剂〔单糖和复原性低聚糖呈红色〕3,5-二羟基甲苯盐酸试剂〔酮糖呈红色〕过碘酸-联苯胺〔糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑〕。2．薄层层析可采用——〔硼酸液+无机盐〕+硅胶→制板吸附剂：硅胶〔用硼酸液或无机盐的水液代水制板〕常用的无机盐——0.3M乙酸钠硼酸盐缓冲液亚硫酸氢钠/H2O特点——增加糖在固定相中的溶解度，使硅胶薄层吸附能力下降，利于斑点集中，又可增加样品的承载量。显色剂：除纸层析应用的以外，还有——H2SO4/H2O或乙醇液茴香醛-硫酸试剂苯胺-二苯胺磷酸试剂等3．气相层析将糖制备成三甲基硅醚〔增加其挥发性〕醛糖用NaBH4复原成多元醇〔制成乙酰化物或三氟乙酰化物〕↖〔防止形成端基异构体〕4．离子交换层析糖的硼酸络合物——可进行离子交换层析优：不必制成衍生物，而直接用水溶液进行别离〔与气相比较〕仪器——糖自动分析仪〔automaticcarbohydrateanalyzer〕显色：3,5-二羟基甲苯-浓硫酸波长：425nm上样量：每种组成不超过1mg洗脱剂：四硼酸钾的缓冲溶液5．液相色谱填充材料——化学修饰的硅胶优：不必制备成衍生物。适合分析对热不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。分析单糖和低聚糖，其灵敏度不及气相层析。㈡糖链结构的测定主要解决三个问题——单糖的组成、糖之间的连接位置和顺序、苷键构型1．单糖的组成低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成，各种单糖之间的比例如何。一般是将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比。也可用GLC或HPLC对单糖定性定量。GLC常以甘露醇或肌醇为内标，用单糖作标准。2．单糖之间连接位置的决定①将糖链全甲基化→水解→甲基化单糖的定性和定量〔气相层析〕〔甲基化单糖中游离-OH的部位就是连接位置〕②13C-NMR测定：主要归属各碳信号，以确定产生苷化位移的碳。3．糖链连接顺序的决定①缓和水解法——将糖链水解成较小的片段，然后分析这些低聚糖的连接顺序。②质谱分析。4．苷键构型的决定糖与糖之间的苷键和糖与非糖局部之间的苷键，本质上都是缩醛键，也都存在端基碳原子的构型问题。苷键构型测定方法如下：⑴分子旋光差〔klyne法〕前以述叙。⑵酶催化水解方法前以述叙。⑶1H-NMR判断糖苷键的相对构型在糖的1H-NMR中——端基质子——δ5.0ppm左右其它质子——δ3.5~4.5ppm间可通过C1-H与C2-H的偶合常数，来判断苷键构型〔α、β〕如：D-葡萄糖用1H-NMR可判断一些糖的相对构型，但还有一些糖由于其结构上的原因，而无法利用1H-NMR来判断相对构型。如：⑷其它IR——α葡萄糖苷在770、780cm-1MS——葡萄糖苷乙酰化物，331碎片峰强度：α>β5．13C-NMR在糖链结构测定中的应用端基碳——δ97~106ppm例：D-葡萄糖苷C1——α型97~101ppmβ型103~106ppmCH-OH(C2、C3、C4)70~85ppmCH2-OH(C6)62左右CH3<20ppm一般在13C-NMR谱中：用门控去偶技术，可判断呋喃糖的端基碳与端基质子的偶合常数。α苷键JC-H≈170Hzβ苷键JC-H≈160Hz苷化位移〔glycosidationshift〕糖苷化后，端基碳和苷元α-C化学位移值均向低场移动，而邻碳稍向高场移动〔偶而也有向低场移动的〕，对其余碳的影响不大，这种苷化前后的化学变化，称苷化位移。例：端基碳、苷元α碳→向低场苷元β-碳——向高场位移苷元β位有取代时的苷化位移：①苷元α-碳手性和糖端基手性都为R〔或S〕时，苷化位移规律同上。例：②苷元α-碳和糖端基碳手性不同时，端基碳和α-碳的苷化位移值比苷元为β-无取代的相应碳的苷化位移值大约为。例：▲酯苷、酚苷的苷化位移：当糖与-OH形成酯苷键或酚苷键时，其苷化位移值较特殊，端基碳和苷元α-碳均向高场位移。例：(在吡啶-d5中测)〔在甲醇-d5中测〕`思考题：1．苷键裂解常用哪些方法？其各具有哪些优缺点？各适用于哪些类别的化合物？2．进行酸水解催化时，各类化合物水解的难易程度如何？3．简述苷类化合物中糖链的鉴定方法。第三章苯丙素类目的要求：1．了解苯丙素类化合物的结构特点。熟悉苯丙酸类的结构特点及特性。2．掌握香豆素的结构特点和分类情况，熟悉香豆素类化合物的提取别离方法。3．掌握香豆素类化合物的理化性质及其波谱学特性。4．了解木脂素的结构类型、理化性质及结构鉴定方法教学学时：2学时。教学重点和难点：重点：苯丙素和香豆素根本的结构特征和性质难点：香豆素的化学性质和波谱特征概述概念：天然成分中有一类苯环和3个直链碳连在一起为单位〔C6-C3〕构成的化合物，统称苯丙素类〔phenylpropanoids〕。类别：包括苯丙烯、苯丙醇、苯丙酸及其缩脂、香豆素、木脂素、木质素。生源途径：莽草酸途径〔莽草酸为桂皮酸的前体，但同时也是酪氨酸、色氨酸的前体，后两者与生物碱的合成密切相关，命名为莽草酸途径将无法限定为仅由桂皮酸而来的苯丙素类化合物，故现多称为桂皮酸途径〕第一节、苯丙酸类具有C6-C3结构的芳香羧酸。结构特点是苯环有羟基取代，数目、排列方式、甲基化程度有所不同，常与不同的醇、氨基酸、糖、有机酸结合成酯存在。如绿原酸〔咖啡酸与奎宁酸结合成的酯〕，具有抗菌、保肝活性。绿原酸别离：苯丙酸类及其衍生物大多具有一定水溶性，常与其它一些酚酸、鞣质、黄酮苷等混在一起，一般要经纤维素、硅胶、大孔树脂、聚酰胺等反复层析才能纯化。鉴别：利用酚羟基的性质〔1〕1-2%的FeCl3甲醇溶液或铁氰化钾-三氯化铁试剂。〔2〕紫外光下呈兰色荧光，氨水处理后呈兰色或绿色荧光。〔酚羟基解离〕紫外光谱的测定有利于苯丙酸类的鉴定。中性溶液中，游离的苯丙酸的UV与其酯或苷相似，碱性溶剂中，酚酸的谱带与它的酯光谱有明显差异。结构鉴定：例1：丹参素甲的波谱特征丹参素甲三氯化铁呈黄绿色，红外显示羧基〔1732，2750-2550〕和羟基〔3450-3150〕的存在。1HNMR数据如下：例2：三个芳香质子7.02，1H，两个亚甲基质子3.04，2H，第二节、香豆素〔coumarins〕概念：邻羟基桂皮酸的内酯，具有芳香气味。1、香豆素的结构类型香豆素是由苯丙酸经氧化、环合而成，异戊烯基活泼双键结合位置不同，氧化情况不同而产生了不同的氧环结构，根据其取代基和连接方式的不同可分为以下几类：〔1〕简单香豆素类只在苯环有取代的香豆素，取代基包括羟基、甲氧基、亚甲二氧基、异戊烯基。〔2〕呋喃香豆素香豆素核上的异戊烯基与邻位酚羟基环合成呋喃环者称为呋喃香豆素。分为角型和线型。〔3〕吡喃香豆素香豆素核上的异戊烯基与邻位酚羟基环合成2，2-二甲基-α-吡喃环者称为呋喃香豆素。分为角型和线型。〔4〕其它香豆素类α-吡喃酮环上有取代基的香豆素类。2、香豆素的化学性质〔1〕内酯性质和碱水解反响一般顺邻羟桂皮酸不易获得，长时间碱液放置或UV照射，可转变为稳定的反邻羟桂皮酸。某些具有特殊结构的香豆素，如C8取代基的适当位置上有羰基、双键、环氧等结构者，和水解新生成的酚羟基发生缔合、加成等作用，可阻碍内酯的恢复，保存了顺邻羟桂皮酸的结构。〔2〕酸的反响①环合反响异戊烯基与相邻酚羟基成氧环。②烯醇醚键开裂如：东茛菪内酯的烯醇醚③双键加水反响酸接触下可使双键加水。如：黄曲霉素〔3〕显色反响①异羟肟酸铁反响〔鉴别内酯结构〕异羟肟酸铁试剂〔盐酸羟胺甲醇液+氢氧化钾甲醇液+三氯化铁甲醇液〕，红色②Gibb’s反响和Emerson反响〔酚羟基对位即6位无取代者〕Gibb’s试剂2，6二溴苯醌氯亚胺的乙醇液+1%氢氧化钾乙醇液，呈深兰色。Emerson试剂2%4-氨基安替匹林乙醇液+8%铁氰化钾水液，呈红色。3、香豆素的别离方法〔1〕酸碱别离法原理：利用内酯加碱皂化，加酸恢复的性质别离香豆素。方法：乙醚萃取液先以NaHCO3去除酸性成分，再以稀和冷的NaOH抽出酚性成分〔包括酚性香豆素〕，剩余中性局部碱水解后，以乙醚抽去不水解的中性成分，碱液中和，再以乙醚抽出香豆素内酯成分。缺点：对酸碱敏感的香豆素，拿不到原存物质。〔2〕层析方法硅胶、氧化铝〔酸性、中性〕层析最为常用。洗脱剂己烷-乙醚，乙醚-乙酸乙酯。4、香豆素的波谱学特性〔1〕紫外光谱紫外光下出现兰色荧光，7位引入羟基，荧光增强，羟基醚化荧光减弱。紫外图谱在274nm〔苯环〕和311nm〔α-吡喃酮环〕呈现两个吸收峰，引入烷基最大吸收值改变甚微，当母核引入含氧取代基时，最大吸收向红位移。〔2〕红外光谱〔3〕核磁共振谱①特点：1HNMR中，香豆素母核上的质子由于受内酯羰基吸电子共扼效应影响，3，6，8位质子信号位于较高场；4，5，7位质子信号位于较低场。C3、C4未取代的香豆素在芳香质子区可见一对双峰，分别位于芳香质子区的两端，C3-Hδ6.1-6.4，C4-Hδ7.5-8.3，J3，4Hz。迫位效应：假设分子中两个迫位质子之一被取代〔如香豆素母核的4，5位质子〕，将对另一迫位质子产生较大的去屏蔽，使其向低场位移，即迫位效应。如5位被取代，4位H向低场位移约0.3。②简单香豆素③呋喃香豆素④吡喃香豆素C3、C4位未取代时：当C3或C4位取代时：当C7-OR氧代时：由于7-OR氧代后向苯环供电而引起C3-H受屏蔽，导致向高场位移约。当C5、C7二氧代时：当C7-OR氧代，C8或C6烷基取代时：5、香豆素的结构鉴定实例例：xanthogalol的1H-NMR(CDCl3)⑤碳谱：母核的9个碳原子，多数在100—160区域内，取代基效应明显。香豆素母核上九个碳原子的化学位移值：当-OR取代时：连接的碳——+30ppm邻位碳——-13ppm对位碳——-8ppm6、香豆素的生物活性植物生长调节剂：低浓度刺激植物发芽、生长；高浓度抑制植物发芽、生长光敏作用：治疗白斑病抗菌、抗病毒作用：秦皮中的七叶内酯及其苷治疗痢疾；蛇床子中的奥斯脑可抑制乙肝外表抗原。平滑肌松弛作用：冠状动脉扩张和解痉利胆抗凝血作用：防止血栓形成肝毒性：黄曲霉素致肝癌。第三节、木脂素〔lignans〕1、木脂素的结构类型木脂素是一类由苯丙素氧化聚合而成的天然产物，通常所指是其二聚物，少数为三聚物和四聚物。定义：两分子苯丙素以侧链中β〔8-8’〕许多木脂素并非以β碳原子相连，称为新木脂素。木脂素还有一些新的类型〔1〕苯丙素低聚体，包括三聚体和四聚体，三聚体常称为倍半木脂素，四聚体称为二木脂素；〔2〕杂木脂素，系由一分子苯丙素与黄酮、香豆素或萜类等结合而成的天然化合物，根据结合分子的不同称为黄酮木脂素、香豆素木脂素。〔3〕去甲木脂素，根本母核只有16—17个碳原子，比一般木脂素少1—2个。木脂素的组成单体主要有四种：肉桂醇肉桂酸丙烯基酚烯丙基酚木脂素由双分子苯丙素缩合成各种碳架后，侧链γ碳原子上的含氧官能团如羟基、羰基、羧基等相互脱水缩合，再形成半缩醛、内酯、四氢呋喃等环状结构，使木脂素的结构类型更加多样。常见以下类型：①二芳基丁烷类②二芳基丁内酯类③芳基萘类芳基萘芳基二氢萘芳基四氢萘芳基萘类木脂素常以氧化的γ碳原子缩合形成内酯，以内酯环合方向分上向和下向1-苯代萘内酯4-苯代萘内酯④四氢呋喃类⑤双四氢呋喃类⑥联苯环辛烯类⑦苯骈呋喃类⑧双环辛烷类⑨苯骈二氧六环类⑩螺二烯酮类⑾联苯类⑿倍半木脂素2、木脂素的理化性质多为无色结晶，新木脂素难结晶。多呈游离型，脂溶性，能溶于苯、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、乙醇等。有多个不对称因素，显光学活性，遇酸异构化。无共同特征反响，一些非特征性试剂可用于薄层层析显色，如5%磷钼酸乙醇液，30%硫酸乙醇液，有亚甲二氧基可用变色酸-浓硫酸显色。3、木脂素的提取别离〔1〕提取木脂素多呈游离型，在植物体内常与大量树脂状物共存，本身在处理过程中也易树脂化。游离木脂素易溶于氯仿、乙醚，在石油醚、苯中溶解度较小。〔2〕别离吸附层析：硅胶吸附，石油醚-乙酸乙酯，石油醚-乙醚，苯-乙酸乙酯，氯仿-甲醇梯度洗脱。分配层析：纸层析水饱和的硅藻土，乙酸乙酯-水分配4、木脂素的结构鉴定〔1〕化学反响费米盐氧化：费米盐〔亚硝基亚硫酸钾〕可将对位有氢原子的酚羟基氧化成对醌。〔2〕紫外光谱芳环为发色团，两个取代芳环是两个孤立的发色团，两者紫外吸收位置相近，吸收强度是两者之和，立体构型对紫外光谱没有影响。紫外光谱可用于区别芳基四氢萘、芳基二氢萘和芳基萘型木脂素，还可确定芳基二氢萘B环上的双键位置，通过鉴定失水物双键位置，还可确定B环上取代羟基的位置。α-失水苦鬼臼脂素β-失水苦鬼臼脂素λmaxnm