(NGS)-DNA序列分析技术-Thermo-Fisher-Scientific课件

孙宏钰中山大学中山医学院法医学系法庭科学新技术应用高峰论坛（2016年11月17日佛山）NGS-STR分型在个体识别和亲子鉴定中的应用初探孙宏钰法庭科学新技术应用高峰论坛（2016年11月17日佛山前言PartI前言PartI基于CE平台的PCR-STR检测是现阶段法医DNA实验室的金标准ForensicDNACaseworkDNADatabasesMassDisastersMissingPersonsParentageandKinshipTestingGeneticGenealogy&AnsweringHistoricalQuestionsAuthenticatingHumanCellLinesMonitoringTransplants……更多Loci组合的有限性长度多态性检测：未充分利用遗传标记信息

法医STR分型中国法庭DNA数据库已有3877.1（4400）万条数据已认定比中391.9万次现场生物物证入库比中率35.34%基于CE平台的PCR-STR检测是现阶段法医DNA实验室的金DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）Massively

parallelsequencing(MPS)DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）MassivelyDNA序列分析技术—下一代测序（NGS）DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）基于NGS平台的法医STR分型长度多态性序列多态性基于NGS平台的法医STR分型长度多态性材料和方法PartII材料和方法PartII实验材料样本：42个广东汉族个体血痕样本（3.0mm血片）包含14个父母子二代家系已采用Goldeye20A体系进行19个STR基因座荧光标记复合扩增和毛细管电泳检测，每个家系都包含1～2个STR突变位点阳性对照：007(ThermoFisher)9947A(Promega)实验材料样本：实验方法DNA提取：AutoMateExpressTM自动化提取系统PrepFiler®BTAForensicDNAExtractionKitQubit®3.0定量DNA浓度实验方法DNA提取：实验方法文库构建：样本文库构建EarlyAccessSTRKit（24个STR基因座）11个CODIS核心位点：

CSF1PO,D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D21S11,TH01,TPOX,vWA5个CODIS补充核心位点：

D1S1656,D2S1338,D2S441,D10S1248,D19S4338个非CODIS核心位点：

D14S1434,D1S1677,D2S1776,D4S2408,D5S2500,D6S1043,D6S474,D9S2157样本文库纯化磁珠Agencourt®AMPure®XPReagent(BeckmanCoulter)实验方法文库构建：实验方法模板制备：文库定量

qPCR定量到40-60pM乳化PCRIonPGM™Hi‑Q™ChefKit（ThermoFisher）阳性珠子的富集IonChef实验方法模板制备：IonChef实验方法测序反应：半导体测序IONPGM™Hi-Q™SequencingKit（ThermoFisher）Ion318™芯片：1GIon316™芯片：100MIonPGM通过检测pH值变化来进行测序，直接将化学信号转换为电信号。实验方法测序反应：IonPGM通过检测pH值变化来进行测序实验方法数据分析：PGM测序数据分析HIDSTRGenotyperPluginv3.1BAM文件用IGV_2.3.72分析FASTQ文件用STRaitRazorv2.6分析PGM分型数据和CE分型数据比较PGM家系数据分析实验方法数据分析：实验结果和讨论PartIII实验结果和讨论PartIII分型结果NGS-STR基因座分型所有样本的分型结果总览等位基因的核心序列简式等位基因及其Stutter峰图分型结果NGS-STR基因座分型所有样本的分型结果总览等位基分型结果输出格式NGS-STR基因座分型分型结果输出格式NGS-STR基因座分型分型结果输出格式NGS-STR基因座分型分型结果输出格式NGS-STR基因座分型PGM检测平台的STR基因座分型阳性对照结果PGM检测平台的STR基因座分型阳性对照结果测序覆盖深度（depthofcoverage,DoC）NGS-STR检测的数据质量测序覆盖深度（depthofcoverage,DoCPGM检测平台的数据质量Stutter占主峰的峰面积比：Stutter出现比率：PGM检测平台的数据质量Stutter占主峰的峰面积比：St等位基因的杂合峰高比PGM检测平台的数据质量等位基因的杂合峰高比PGM检测平台的数据质量CE和NGS平台的STR分型一致性：42个样本和2个阳性对照DNA样本（9947A，007），共1232个等位基因，分型一致率为98.13%。不一致原因分析等位基因丢失D21S11基因座X.1、X.2、X.3结构多一个重复单位NGS-STR与CE-STR的一致性研究CE和NGS平台的STR分型一致性：NGS-STR与CE-S各个基因座的等位基因个数等位基因（Isoallele）各个基因座的等位基因个数等位基因（Isoallele）等位基因（Isoallele）等位基因（Isoallele）Goldeneye20A和EarlyAccessSTRKit重叠基因座共14个：CSF1PO,D2S1338,D3S1358,D5S818,D6S1043,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D19S433,D21S11,TH01,TPOXandvWA14个三联体二代家系：3个：母源突变（其中2个是多步突变）3个：父源突变3个：突变来源不明3个：有突变，但未涵盖在重合的14个基因座中亲子鉴定Goldeneye20A和EarlyAccessSTR(NGS)-DNA序列分析技术---Thermo-Fisher-Scientific课件小结PartIV小结PartIVNGS-STR分型的优点检测序列多态性——信息更充分利用，提高多态性；可组合的STR基因座的个数不受荧光种类限制；每个STR基因座的扩增片段长度不受荧光组合限制；对等位基因亲本来源的识别能力；对混合样本潜在的检测能力。NGS-STR分型的优点检测序列多态性——信息更充分利用，提NGS-STR分型尚需解决的问题可读序列的评价标准等位基因的命名标准与CE数据的可兼容性群体数据结果评判依据和标准检测时间和成本NGS-STR分型尚需解决的问题可读序列的评价标准(NGS)-DNA序列分析技术---Thermo-Fisher-Scientific课件孙宏钰中山大学中山医学院法医学系法庭科学新技术应用高峰论坛（2016年11月17日佛山）NGS-STR分型在个体识别和亲子鉴定中的应用初探孙宏钰法庭科学新技术应用高峰论坛（2016年11月17日佛山前言PartI前言PartI基于CE平台的PCR-STR检测是现阶段法医DNA实验室的金标准ForensicDNACaseworkDNADatabasesMassDisastersMissingPersonsParentageandKinshipTestingGeneticGenealogy&AnsweringHistoricalQuestionsAuthenticatingHumanCellLinesMonitoringTransplants……更多Loci组合的有限性长度多态性检测：未充分利用遗传标记信息

法医STR分型中国法庭DNA数据库已有3877.1（4400）万条数据已认定比中391.9万次现场生物物证入库比中率35.34%基于CE平台的PCR-STR检测是现阶段法医DNA实验室的金DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）Massively

parallelsequencing(MPS)DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）MassivelyDNA序列分析技术—下一代测序（NGS）DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）基于NGS平台的法医STR分型长度多态性序列多态性基于NGS平台的法医STR分型长度多态性材料和方法PartII材料和方法PartII实验材料样本：42个广东汉族个体血痕样本（3.0mm血片）包含14个父母子二代家系已采用Goldeye20A体系进行19个STR基因座荧光标记复合扩增和毛细管电泳检测，每个家系都包含1～2个STR突变位点阳性对照：007(ThermoFisher)9947A(Promega)实验材料样本：实验方法DNA提取：AutoMateExpressTM自动化提取系统PrepFiler®BTAForensicDNAExtractionKitQubit®3.0定量DNA浓度实验方法DNA提取：实验方法文库构建：样本文库构建EarlyAccessSTRKit（24个STR基因座）11个CODIS核心位点：

CSF1PO,D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D21S11,TH01,TPOX,vWA5个CODIS补充核心位点：

D1S1656,D2S1338,D2S441,D10S1248,D19S4338个非CODIS核心位点：

D14S1434,D1S1677,D2S1776,D4S2408,D5S2500,D6S1043,D6S474,D9S2157样本文库纯化磁珠Agencourt®AMPure®XPReagent(BeckmanCoulter)实验方法文库构建：实验方法模板制备：文库定量

qPCR定量到40-60pM乳化PCRIonPGM™Hi‑Q™ChefKit（ThermoFisher）阳性珠子的富集IonChef实验方法模板制备：IonChef实验方法测序反应：半导体测序IONPGM™Hi-Q™SequencingKit（ThermoFisher）Ion318™芯片：1GIon316™芯片：100MIonPGM通过检测pH值变化来进行测序，直接将化学信号转换为电信号。实验方法测序反应：IonPGM通过检测pH值变化来进行测序实验方法数据分析：PGM测序数据分析HIDSTRGenotyperPluginv3.1BAM文件用IGV_2.3.72分析FASTQ文件用STRaitRazorv2.6分析PGM分型数据和CE分型数据比较PGM家系数据分析实验方法数据分析：实验结果和讨论PartIII实验结果和讨论PartIII分型结果NGS-STR基因座分型所有样本的分型结果总览等位基因的核心序列简式等位基因及其Stutter峰图分型结果NGS-STR基因座分型所有样本的分型结果总览等位基分型结果输出格式NGS-STR基因座分型分型结果输出格式NGS-STR基因座分型分型结果输出格式NGS-STR基因座分型分型结果输出格式NGS-STR基因座分型PGM检测平台的STR基因座分型阳性对照结果PGM检测平台的STR基因座分型阳性对照结果测序覆盖深度（depthofcoverage,DoC）NGS-STR检测的数据质量测序覆盖深度（depthofcoverage,DoCPGM检测平台的数据质量Stutter占主峰的峰面积比：Stutter出现比率：PGM检测平台的数据质量Stutter占主峰的峰面积比：St等位基因的杂合峰高比PGM检测平台的数据质量等位基因的杂合峰高比PGM检测平台的数据质量CE和NGS平台的STR分型一致性：42个样本和2个阳性对照DNA样本（9947A，007），共1232个等位基因，分型一致率为98.13%。不一致原因分析等位基因丢失D21S11基因座X.1、X.2、X.3结构多一个重复单位NGS-STR与CE-STR的一致性研究CE和NGS平台的STR分型一致性：NGS-STR与CE-S各个基因座的等位基因个数等位基因（Isoallele）各个基因座的等位基因个数等位基因（Isoallele）等位基因（Isoallele）