免疫标记技术-课件

第十一章

免疫标记技术第十一章

免疫标记技术1第一节免疫标记技术简介第一节免疫标记技术简介2

将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量的多少，间接反映被测物的存在。称做免疫标记技术（immunolabellingtechnique）。免疫标记技术概念将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧3优点:特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于观察。优点:特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于观察。4免疫标记技术的分类免疫荧光标记技术免疫酶标记技术放射免疫测定法金免疫技术、化学发光免疫技术、免疫印迹技术、流式细胞术免疫标记技术的分类免疫荧光标记技术免疫酶标记技术放射免5

一、免疫荧光标记技术

(immunofluorescence,IF)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。

免疫荧光法可用于检测多种病原体的抗原、抗体，或鉴定免疫细胞膜抗原。一、免疫荧光标记技术

(immuno6

二、免疫酶标记技术

(enzymeimmunoassay,EIA)将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。二、免疫酶标记技术

(enzymeimmun7

三、放射免疫测定法

(radioimmunoassay,RIA)用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。

常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、地高辛、IgE等。三、放射免疫测定法

(radioimmu8一、荧光基础知识简介（一）荧光的产生

一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。第二节免疫荧光标记技术一、荧光基础知识简介第二节免疫荧光标记技术9免疫标记技术-课件10免疫标记技术-课件11荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。荧光种类致荧光：光激发产生化学荧光X线荧光阴极射线荧光

可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。荧光发射的特点是：荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。荧光种类致荧光：光激12

（二）荧光效率荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量子数/

吸收光的光量子数

（二）荧光效率荧光效率＝发射荧光的光量子数/13（三）荧光的猝灭

荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射

荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长14（四）常用的免疫标记荧光物质

1、异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）

黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。最大吸收光波长为490nm～495nm，最大发射光波长520nm～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。（四）常用的免疫标记荧光物质1、异硫氰酸荧光素（f15免疫标记技术-课件16其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。其主要优点是：172、四乙基罗丹明（rhodamine,RIB200）橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595nm～600nm，呈橘红色荧光。2、四乙基罗丹明183、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。

3、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodam19与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色，其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对20二、荧光免疫标记技术原理和方法（一）原理荧光免疫技术是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。二、荧光免疫标记技术原理和方法（一）原理21（二）方法

1、直接荧光法

把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体。将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在。可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。（二）方法1、直接荧光法22抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图缺点：检查每种抗原均需制23炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测24间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光(一)间接法将抗体(一抗)与标本中的抗原结合,再用FITC标记的二抗染色。间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光(一)间接法将抗25

2、间接荧光法

将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察荧光。2、间接荧光法将组织或细胞上的抗原直接与相应26间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光优点：敏感，一种标记抗体可以检测多种抗原缺点：操作繁琐间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光优点：敏感，一种标记27免疫标记技术-课件283、免疫荧光细胞化学

先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。3、免疫荧光细胞化学先将已知的抗原或抗体标记上29

三、荧光标记抗原/抗体时非特异性

染色的主要因素微生物的原发荧光组织的原发荧光游离荧光素及其衍生物的存在抗体不纯抗原不纯染色不当三、荧光标记抗原/抗体时非特异性

30四、免疫荧光标记技术的应用（一）定性分析荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。四、免疫荧光标记技术的应用（一）定性分析31（二）定量测定荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。1、直接测定法利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定。2、间接测定法有些物质本身不能发光或荧光量子产率低，只能用间接测定法化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法（二）定量测定荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直32五、荧光免疫技术实验示例抗细胞核抗体(Antinuclear

antibody,ANA)检测对胶原性疾病(如全身性红斑性狼疮)及其他自身免疫性疾病的诊断有一定意义。五、荧光免疫技术实验示例抗细胞核抗体(Antinuclea33【原理】全身性红斑性狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，患者血清中出现ANA。以大白鼠肝细胞核作为抗原基质，加病人血清(第一抗体)，再加荧光标记的抗人IgG(第二抗体)进行间接免疫荧光试验，若患者血清中有ANA，ANA便与肝细胞核抗原结合，再与荧光标记的抗人IgG结合，在荧光镜下可见细胞核显示黄绿色特异荧光。【原理】全身性红斑性狼疮(SLE)是一种自身34【材料】1、

大白鼠肝组织印片。2、

病人血清。3、

荧光标记抗人IgG。4、

丙酮、PBS、缓冲甘油(PBS+等量甘油)。5、

阳性血清和阴性血清。【材料】1、大白鼠肝组织印片。35【方法】1、

将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定5分钟，PBS漂洗三次，每次3分钟，取出晾干，-20℃保存备用。2、用PBS稀释病人血清，使成1:5、1:10、1：20……1:1280稀释度。【方法】1、将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定5分钟，PB363、

将不同稀释度的病人血清10微升分别加入鼠肝印片上，放湿盒内，置37℃培养箱中30分钟。4、用PBS洗去印片上未结合的血清，然后再用PBS漂洗三次，每次3分钟，晾干。5、分别滴加适当稀释的荧光标记－抗人的IgG(1:10),放湿盒内，置37℃培养箱中30分钟。3、将不同稀释度的病人血清10微升分别加入鼠肝印片上，放湿377、

在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧光镜检。6、用PBS洗去未结合的荧光抗体，然后再用PBS漂洗三次，每次3分钟，晾干。7、在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧光镜检。6、用PBS洗去38【结果】整个肝细胞核着色发出黄绿色荧光者为阳性;不发荧光者为阴性。【结果】39免疫标记技术-课件40第三节酶免疫技术一、酶免疫技术中酶、显色底物和标记物的制备

在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点。第三节酶免疫技术一、酶免疫技术中酶、显色底物和标41表1常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ>3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色表1常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根42（二）标记物的制备标记物制备的方法两类：1、交联法

交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）。（二）标记物的制备标记物制备的方法两类：432、直接法

直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：酶-抗体（抗原）。2、直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化44二、辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)

标记抗体的制备示例

二、辣根过氧化物酶(HorseradishPero45（一）辣根过氧化物酶和底物简介HorseradishPeroxidase,HRP

比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。底物：邻苯二胺、四甲基联苯胺（一）辣根过氧化物酶和底物简介HorseradishPe46简易过碘酸盐氧化法原理：辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(氢硼化钠）(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。简易过碘酸盐氧化法原理：47

四操作步骤

（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1MNaIO４溶液，混匀，4℃静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。

四操作步骤48（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混匀，再置4℃,2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。（7）3000r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/LpH7.4的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15moL/LpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混49(二)

HRP标记抗体的方法

1、原理戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。(二)HRP标记抗体的方法1、原理502、试剂及器材

(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8g，加蒸馏水至200ml。(2)1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。2、试剂及器材(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(P51(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗IgG抗体。(9)HRP(RZ>3.0)。(10)SephadexG-25层析柱(2cm×50cm)。(11)搅拌器，分光光度计，离心机。(12)透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。523、标记步骤

(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。3、标记步骤(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二53(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1MPH9.5碳酸盐缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅54(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室

温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，

置4℃1小时。(7)

3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室55(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB564、结果判定(1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定。4、结果判定(1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)57(2)定量和克分子比值测定可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62(2)定量和克分子比值测定可用分光光度计测定(光程1cm)58(三)注意事项

1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。(三)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要593.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4.浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透60三、酶免疫技术类型和应用酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液体样品中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定（EIA）。

酶免疫测定分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。三、酶免疫技术类型和应用酶免疫技术按照抗原抗体系统是611、酶免疫增强测定技术（EMIT）2、克隆酶供体免疫分析（CEDIA）

（二）异相酶免疫测定1、酶联免疫吸附试验2、酶联免疫斑点试验3、生物素－亲和素－ELISA4、发光酶免疫测定（一）均相酶免疫测定1、酶免疫增强测定技术（EMIT）1、酶联免疫吸附试验（621、酶联免疫吸附试验

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)

是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。

将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中游离成分分离。1、酶联免疫吸附试验

(enzymelinkedi63酶标仪酶标仪64

(1)间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清，充分漂洗后加入酶标记的抗抗体，洗后即可供显色观察。(1)间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清65免疫标记技术-课件66免疫标记技术-课件67

(2)双抗体夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。(2)双抗体夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作68（3）竞争法

即可检测抗原又可检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。（3）竞争法即可检测抗原又可检测抗体。它是用酶标抗69竞争法待测样本酶标抗体底物终止液竞争法待测样本酶标抗体底物终止液702、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

原理：将抗细胞因子抗体包被固相载体，加入不同来源的细胞，细胞分泌的细胞因子与包被抗体结合，在细胞周围形成抗体-抗原（细胞因子）复合物。然后加入相应酶标记的抗细胞因子抗体，通过底物显色反应测定结合在固相载体上的细胞因子量，并可在光镜下观察分泌细胞因子的细胞。2、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)原理：将抗细71免疫标记技术-课件723、BAS-ELISA生物素（biotin）是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶R或维生素H。亲和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一种蛋白质。生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。在生物素-亲和素系统(biotinavidinsystem,BAS)中，借助所形成的亲和素-生物素-酶复合物，追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应抗体或抗原。3、BAS-ELISA生物素（biotin）是广泛分73

生物素－酶标亲合素系统反应示意图生物素－酶标亲合素系统反应示意图744、发光酶免疫测定

与一般EIA的区别是酶所催化的底物是发光剂。产物不是一般EIA的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定。常用的酶是HRP和AP，HRP的发光底物有鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸；AP的底物为3-（2­-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基伞形酮磷酸盐。4、发光酶免疫测定75四、酶免疫技术实验示例酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）——双抗体夹心法检测HBsAg四、酶免疫技术实验示例酶联免疫吸附试验76【原理】以特异性抗体(抗-HBs)致敏载体表面，然后将含有抗原的标本与致敏的载体一起孵育，洗去过量溶液。再加人酶标特异抗体(酶标抗-HBs)。酶标抗体就连接到已结合于抗体致敏的载体表面的抗原上，孵育后，洗去过量的结合物。最后加底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。【原理】以特异性抗体(抗-HBs)致敏载体表77【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹心法检测HBsAg，适用于血清或血浆标本，具有快速简便，特异性强，灵敏度高，重复性好，所需标本量少等优点。【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹78试剂盒含:

1、

包被抗-HBs反应条1板2、

酶结合物1瓶3、

HBsAg阳性对照1瓶4、

HBsAg阴性对照1瓶5、

洗涤液:用前每瓶作1：20稀释1瓶6、

显色剂（TMB）A1瓶7、

显色剂（TMB）B1瓶8、

终止液1瓶试剂盒含:1、

包被抗-HBs反应条1板2、

酶结合79【方法】

1、

加人待测标本每孔50微升，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴

(50微升、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。【方法】1、加人待测标本每孔50微升，并设HB802、

手工洗板：弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。(洗板机洗板：选择洗涤五次程序洗板，洗涤液注满每孔，浸泡时间不短于20秒，洗涤程序完成后拍干。)3、

加显色剂：先加显色剂A每孔1滴(50微升)，然后再加显色剂B每孔1滴(约50微升，混匀，37℃孵育10分钟。2、手工洗板：弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，81【结果判断】比色法：每孔加终止液1滴(50微升)，混匀，波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值样品OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。【结果判断】比色法：82【注意事项】1、

试剂盒置2℃～8℃保存。2、

使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。3、

从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。【注意事项】1、试剂盒置2℃～8℃保存。834、

待测标本不可用NaN3防腐。5、

不同批号试剂请勿通用。6、

结果判断须在10分钟内完成。7、

若浓缩洗涤液出现结晶时，请置37℃至溶解。4、待测标本不可用NaN3防腐。84

第四节放射免疫技术一、原理与方法（一）原理放射免疫分析法（radioimmunoassayRIA）

应用竞争性结合的原理，应用放射性同素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果。

本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。放射免疫标记技术常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ第四节放射免疫技术一、原理与方法放射851、液相法将待检标本（例如含胰岛素抗原）与定时的同位素标记的胰岛素（抗原）和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种（二）方法1、液相法放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种（二）方法862、固相法

将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体测定固相载体的放射活性。常用的固相载体有溴化氰（CNBr）海豹化的纸片或聚苯乙烯小管。2、固相法将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待87二、放射免疫分析加样程序（一）放射免疫分析顺序饱和加样程序1、基本原理

先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。二、放射免疫分析加样程序（一）放射免疫分析顺序饱和加样程序882、加样程序

以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例

（直接测定）。（1）加样（单位μl；总反应体600μl）。（2）孵育：4℃，24h。（3）分离B与F。无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共两管，离心、去上清。血浆5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡10min，再离心，取上清，即无肽血浆。2、加样程序以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例89（二）放射免疫分析平衡饱和加样程序1、基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到即不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。（二）放射免疫分析平衡饱和加样程序1、基本原理902、加样程序

一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。2、加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清91以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：（1）加样（单位μl；总反应体积500μl）。（2）孵育：4℃，24h。（3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的cpm数。以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：92三、放射免疫分析的质量控制（一）质量控制的目的和内容1、在一个测定方法内产生的误差。2、在同一实验室内不同方法之间产生的误

差。这两种情况属于内部质量控制。3、用同一测定方法，在各实验室之间产生

的误差。4、采用不同方法，在各实验室之间产生的

误差。后两种情况属于外部质量控制。三、放射免疫分析的质量控制（一）质量控制的目的和内容93（二）产生测量误差的因素（三）放射免疫分析中测量误差的控制1、选择准确性高的方法2、建立方法对比3、建立各种类型的标准。如规定标准品的

纯度、制备方法、使用年限及使用条件4、建立操作规程，按规程操作5、建立可靠的检查制度（二）产生测量误差的因素（三）放射免疫分析中测量误差的控制194四、标记抗原的放射免疫技术（RIA）（一）原理

将标记抗原和未标记抗原一起加入相应的抗体时则两种抗原产生相互的竞争，而生成有标记抗原和抗体复合物以及非标记抗原和抗体复合物。二者含量在一定限度内呈反比，利用此法可测定未知抗原或抗体。抗体为限量的四、标记抗原的放射免疫技术（RIA）（一）原理抗95（二）放射免疫抗原的制备1、完全抗原

为了保证免疫反应的特异性，放射免疫抗原纯度必须在90%以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。2、半抗原

要获得较好的免疫原性，必须将半抗原与蛋白质大分子的载体结合起来形成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血清白蛋白、球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等（二）放射免疫抗原的制备1、完全抗原

2、半抗原

96（三）抗体的制备与提纯

（四）抗原的标记1、放射性同位素的选择

选择同位素的原则：⑴方法简单、经济、便于推广应用。⑵易于防护。⑶同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。⑷对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。⑸具有较高的计数效率。目前常用的同位素有3H、125I，其它还有14C、35S和32P等。（三）抗体的制备与提纯

（四）抗原的标记1、放射性同位素97表1各种标记同位素的性质比较同位素毒性分类半衰期3H14C131I125I35S32P低毒低毒高毒低毒中毒中毒12.26年5730年8.07天60.20天67.48天14.26天表1各种标记同位素的性质比较同位素毒性分类半衰期3H低毒1982、标记方法

目前常用的是碘标记法。

（氯胺T

）

⑴将蛋白质抗原以0.5Mol/LpH7.5PB液稀释为20μg/μl，取5μl～10μl。⑵取Na125I5μl(含2mci～3mci)。⑶将1mg氯胺T溶于0.5Mol/LpH7.5PB液0.1ml中。⑷再将Na125I和氯胺T分别缓缓加入蛋白质液中，于冰浴中边加边搅拌，加完后再搅拌5min。2、标记方法

目前常用的是碘标记法。

（氯胺T99⑸加0.1ml(含3mg)偏重硫酸钠(以PB液配制)。⑹再加1%碘化钾液1滴，看液体是否完全透明。如仍呈棕色，应继续加少许的偏重硫酸钠。⑺过SephadexG50柱，取第一峰，即为碘标记的蛋白质抗原。⑸加0.1ml(含3mg)偏重硫酸钠(以PB液配制)。1003、标记的最佳条件（1）放射性碘比活性要高（2）反应体积要小（3）标记反应的pH值以7.5为宜（4）氯胺T的用量必须事先测定3、标记的最佳条件（1）放射性碘比活性要高1014、标记物的鉴定

⑴放射性化学纯度⑵免疫化学活性鉴定⑶放射强度

4、标记物的鉴定⑴放射性化学纯度102（五）B、F分离

1、盐析法2、双抗体法

3、清蛋白(或葡聚糖衣)活性炭吸附法

（五）B、F分离1、盐析法103（一）原理

IRMA是采用过量的标记抗体与待测抗原的非竞争性结合反应，然后加入固相的抗原吸附剂以结合游离的标记抗体，离心去沉淀，测定上清液中的放射性强度，从而推算出待测样品的抗原含量。五、标记抗体的免疫放射技术(IRMA)（一）原理五、标记抗体的免疫放射技术(IRMA)104表2

IRMA与RIA的区别

区别IRMARIA标记物质抗体抗原标记物用量过量限量反应方式直接结合竞争性结合B、F分离方式固相抗原免疫吸附剂第二抗体等（二）放射免疫检测与免疫放射检测的区别表2IRMA与RIA的区别

区别IRMARIA标记物质抗105（三）标记抗体的制备

特异性抗体的制备，质量要求及125I标记方法与RIA基本相同。抗体IgG分子中含有多个氨基酸残基，经过碘化反应后，不影响其免疫学活性，并能结合上较多的碘原子，标记物的比放性高，克服了RIA中某些抗原不易标记，或在标记过程中容易发生化学或放射性损伤等缺点。（三）标记抗体的制备特异性抗体的制备，质量要求及1106（四）免疫吸附剂的制备

免疫吸附剂是将高纯度的抗原连接在固相载体上而制成。所用固相载体要求对抗原的结合力强，对非特异性蛋白质的吸附性能低，且具有高度的分散性，这样才能大量地结合特异性抗体。一般采用重氮化的纤维素、溴化氰化的纤维素、琼脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶和玻璃粉等作为抗原吸附剂的固相载体。（四）免疫吸附剂的制备免疫吸附剂是将高纯度的抗原107（五）测定方法1、直接IRMA法2、双抗体夹心IRMA法3、间接IRMA法4、BAS-IRMA法（五）测定方法1、直接IRMA法108复习题1、简述三大免疫标记技术（内容、观点）2、直接荧光免疫标记与间接荧光免疫标

记各有何特点？3、如何排出非特异荧光？4、简述简易过碘酸钠酶免疫标记。5、简述ELISA。6、酶免疫标记常用何种酶？7、放射免疫标记常用何种核素？复习题1、简述三大免疫标记技术（内容、观点）109

第十一章

免疫标记技术第十一章

免疫标记技术110第一节免疫标记技术简介第一节免疫标记技术简介111

将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量的多少，间接反映被测物的存在。称做免疫标记技术（immunolabellingtechnique）。免疫标记技术概念将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧112优点:特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于观察。优点:特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于观察。113免疫标记技术的分类免疫荧光标记技术免疫酶标记技术放射免疫测定法金免疫技术、化学发光免疫技术、免疫印迹技术、流式细胞术免疫标记技术的分类免疫荧光标记技术免疫酶标记技术放射免114

一、免疫荧光标记技术

(immunofluorescence,IF)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。

免疫荧光法可用于检测多种病原体的抗原、抗体，或鉴定免疫细胞膜抗原。一、免疫荧光标记技术

(immuno115

二、免疫酶标记技术

(enzymeimmunoassay,EIA)将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（OD）值可反映抗原含量，灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。二、免疫酶标记技术

(enzymeimmun116

三、放射免疫测定法

(radioimmunoassay,RIA)用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵敏度达pg水平。常用于标记的放射性核素为125I和131I，分为液相和固相两种方法。

常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、地高辛、IgE等。三、放射免疫测定法

(radioimmu117一、荧光基础知识简介（一）荧光的产生

一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。第二节免疫荧光标记技术一、荧光基础知识简介第二节免疫荧光标记技术118免疫标记技术-课件119免疫标记技术-课件120荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。荧光种类致荧光：光激发产生化学荧光X线荧光阴极射线荧光

可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。荧光发射的特点是：荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。荧光种类致荧光：光激121

（二）荧光效率荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量子数/

吸收光的光量子数

（二）荧光效率荧光效率＝发射荧光的光量子数/122（三）荧光的猝灭

荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射

荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长123（四）常用的免疫标记荧光物质

1、异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）

黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。最大吸收光波长为490nm～495nm，最大发射光波长520nm～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。（四）常用的免疫标记荧光物质1、异硫氰酸荧光素（f124免疫标记技术-课件125其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。其主要优点是：1262、四乙基罗丹明（rhodamine,RIB200）橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595nm～600nm，呈橘红色荧光。2、四乙基罗丹明1273、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。

3、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodam128与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色，其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对129二、荧光免疫标记技术原理和方法（一）原理荧光免疫技术是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。二、荧光免疫标记技术原理和方法（一）原理130（二）方法

1、直接荧光法

把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体。将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在。可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。（二）方法1、直接荧光法131抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图缺点：检查每种抗原均需制132炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测133间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光(一)间接法将抗体(一抗)与标本中的抗原结合,再用FITC标记的二抗染色。间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光(一)间接法将抗134

2、间接荧光法

将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察荧光。2、间接荧光法将组织或细胞上的抗原直接与相应135间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光优点：敏感，一种标记抗体可以检测多种抗原缺点：操作繁琐间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光优点：敏感，一种标记136免疫标记技术-课件1373、免疫荧光细胞化学

先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。3、免疫荧光细胞化学先将已知的抗原或抗体标记上138

三、荧光标记抗原/抗体时非特异性

染色的主要因素微生物的原发荧光组织的原发荧光游离荧光素及其衍生物的存在抗体不纯抗原不纯染色不当三、荧光标记抗原/抗体时非特异性

139四、免疫荧光标记技术的应用（一）定性分析荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。四、免疫荧光标记技术的应用（一）定性分析140（二）定量测定荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。1、直接测定法利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定。2、间接测定法有些物质本身不能发光或荧光量子产率低，只能用间接测定法化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法（二）定量测定荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直141五、荧光免疫技术实验示例抗细胞核抗体(Antinuclear

antibody,ANA)检测对胶原性疾病(如全身性红斑性狼疮)及其他自身免疫性疾病的诊断有一定意义。五、荧光免疫技术实验示例抗细胞核抗体(Antinuclea142【原理】全身性红斑性狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，患者血清中出现ANA。以大白鼠肝细胞核作为抗原基质，加病人血清(第一抗体)，再加荧光标记的抗人IgG(第二抗体)进行间接免疫荧光试验，若患者血清中有ANA，ANA便与肝细胞核抗原结合，再与荧光标记的抗人IgG结合，在荧光镜下可见细胞核显示黄绿色特异荧光。【原理】全身性红斑性狼疮(SLE)是一种自身143【材料】1、

大白鼠肝组织印片。2、

病人血清。3、

荧光标记抗人IgG。4、

丙酮、PBS、缓冲甘油(PBS+等量甘油)。5、

阳性血清和阴性血清。【材料】1、大白鼠肝组织印片。144【方法】1、

将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定5分钟，PBS漂洗三次，每次3分钟，取出晾干，-20℃保存备用。2、用PBS稀释病人血清，使成1:5、1:10、1：20……1:1280稀释度。【方法】1、将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定5分钟，PB1453、

将不同稀释度的病人血清10微升分别加入鼠肝印片上，放湿盒内，置37℃培养箱中30分钟。4、用PBS洗去印片上未结合的血清，然后再用PBS漂洗三次，每次3分钟，晾干。5、分别滴加适当稀释的荧光标记－抗人的IgG(1:10),放湿盒内，置37℃培养箱中30分钟。3、将不同稀释度的病人血清10微升分别加入鼠肝印片上，放湿1467、

在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧光镜检。6、用PBS洗去未结合的荧光抗体，然后再用PBS漂洗三次，每次3分钟，晾干。7、在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧光镜检。6、用PBS洗去147【结果】整个肝细胞核着色发出黄绿色荧光者为阳性;不发荧光者为阴性。【结果】148免疫标记技术-课件149第三节酶免疫技术一、酶免疫技术中酶、显色底物和标记物的制备

在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点。第三节酶免疫技术一、酶免疫技术中酶、显色底物和标150表1常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ>3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色表1常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根151（二）标记物的制备标记物制备的方法两类：1、交联法

交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）。（二）标记物的制备标记物制备的方法两类：1522、直接法

直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：酶-抗体（抗原）。2、直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化153二、辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)

标记抗体的制备示例

二、辣根过氧化物酶(HorseradishPero154（一）辣根过氧化物酶和底物简介HorseradishPeroxidase,HRP

比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。底物：邻苯二胺、四甲基联苯胺（一）辣根过氧化物酶和底物简介HorseradishPe155简易过碘酸盐氧化法原理：辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(氢硼化钠）(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。简易过碘酸盐氧化法原理：156

四操作步骤

（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1MNaIO４溶液，混匀，4℃静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜。

四操作步骤157（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混匀，再置4℃,2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。（7）3000r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/LpH7.4的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15moL/LpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混158(二)

HRP标记抗体的方法

1、原理戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。(二)HRP标记抗体的方法1、原理1592、试剂及器材

(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8g，加蒸馏水至200ml。(2)1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。2、试剂及器材(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(P160(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗IgG抗体。(9)HRP(RZ>3.0)。(10)SephadexG-25层析柱(2cm×50cm)。(11)搅拌器，分光光度计，离心机。(12)透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。1613、标记步骤

(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。3、标记步骤(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二162(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1MPH9.5碳酸盐缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅163(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室

温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，

置4℃1小时。(7)

3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室164(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB1654、结果判定(1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定。4、结果判定(1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)166(2)定量和克分子比值测定可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62(2)定量和克分子比值测定可用分光光度计测定(光程1cm)167(三)注意事项

1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。(三)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要1683.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4.浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透169三、酶免疫技术类型和应用酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液体样品中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定（EIA）。

酶免疫测定分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。三、酶免疫技术类型和应用酶免疫技术按照抗原抗体系统是1701、酶免疫增强测定技术（EMIT）2、克隆酶供体免疫分析（CEDIA）

（二）异相酶免疫测定1、酶联免疫吸附试验2、酶联免疫斑点试验3、生物素－亲和素－ELISA4、发光酶免疫测定（一）均相酶免疫测定1、酶免疫增强测定技术（EMIT）1、酶联免疫吸附试验（1711、酶联免疫吸附试验

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)

是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。

将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中游离成分分离。1、酶联免疫吸附试验

(enzymelinkedi172酶标仪酶标仪173

(1)间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清，充分漂洗后加入酶标记的抗抗体，洗后即可供显色观察。(1)间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清174免疫标记技术-课件175免疫标记技术-课件176

(2)双抗体夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。(2)双抗体夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作177（3）竞争法

即可检测抗原又可检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。（3）竞争法即可检测抗原又可检测抗体。它是用酶标抗178竞争法待测样本酶标抗体底物终止液竞争法待测样本酶标抗体底物终止液1792、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

原理：将抗细胞因子抗体包被固相载体，加入不同来源的细胞，细胞分泌的细胞因子与包被抗体结合，在细胞周围形成抗体-抗原（细胞因子）复合物。然后加入相应酶标记的抗细胞因子抗体，通过底物显色反应测定结合在固相载体上的细胞因子量，并可在光镜下观察分泌细胞因子的细胞。2、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)原理：将抗细180免疫标记技术-课件1813、BAS-ELISA生物素（biotin）是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶R或维生素H。亲和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一种蛋白质。生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。在生物素-亲和素系统(biotinavidinsystem,BAS)中，借助所形成的亲和素-生物素-酶复合物，追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应抗体或抗原。3、BAS-ELISA生物素（biotin）是广泛分182

生物素－酶标亲合素系统反应示意图生物素－酶标亲合素系统反应示意图1834、发光酶免疫测定

与一般EIA的区别是酶所催化的底物是发光剂。产物不是一般EIA的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定。常用的酶是HRP和AP，HRP的发光底物有鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸；AP的底物为3-（2­-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基伞形酮磷酸盐。4、发光酶免疫测定184四、酶免疫技术实验示例酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）——双抗体夹心法检测HBsAg四、酶免疫技术实验示例酶联免疫吸附试验185【原理】以特异性抗体(抗-HBs)致敏载体表面，然后将含有抗原的标本与致敏的载体一起孵育，洗去过量溶液。再加人酶标特异抗体(酶标抗-HBs)。酶标抗体就连接到已结合于抗体致敏的载体表面的抗原上，孵育后，洗去过量的结合物。最后加底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。【原理】以特异性抗体(抗-HBs)致敏载体表186【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹心法检测HBsAg，适用于血清或血浆标本，具有快速简便，特异性强，灵敏度高，重复性好，所需标本量少等优点。【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹187试剂盒含:

1、

包被抗-HBs反应条1板2、

酶结合物1瓶3、

HBsAg阳性对照1瓶4、

HBsAg阴性对照1瓶5、

洗涤液:用前每瓶作1：20稀释1瓶6、

显色剂（TMB）A1瓶7、