免疫学补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件

[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测实验三补体参与的反应T细胞数量及其功能检测PartI补体参与的反应补体的溶血反应PartIIT细胞数量及其功能检测E花环形成试验－－数量测定淋巴细胞转化试验：形态学方法3H—TDR掺入法MTT比色法功能[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测[免疫学]补体1[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件2[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件3[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件4[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件5孔号SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－6滴33滴－3滴6滴43滴－－9滴

步骤1、取24孔板，按下表加入各成分；

2、将24孔板放在37℃温箱内15-30min，观察并记录结果。结果:孔号SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－66PartIIT细胞数量及其功能检测PartIIT细胞数量及其功能检测72.E花环形成试验

原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体－E受体（CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。

检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。2.E花环形成试验原理检测T细胞数量，间接判断机体的8材料肝素抗凝血、绵羊红细胞(SRBC)淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5％戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等材料9

步骤：（动作轻柔；分清滴管及枪头！！！）⑴取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血3ml，用滴管贴管壁（倾斜30°）轻轻叠加于3ml分离液上（界面要清晰）→→→

配平后1800rpm离心13mins。

1.淋巴细胞悬液的制备：人淋巴细胞比重：1.070淋巴细胞分层液：1.077人红细胞比重：1.092步骤：（动作轻柔；分清滴管及枪头！10稀释的血液

分层液离心前稀释的血浆

单个核细胞分层液粒细胞红细胞离心后稀释的血液离心前稀释的血浆离心后11[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件12⑵另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。

(3)弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml，重复离心两次。2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液（约0.1ml）与绵羊红细胞0.1ml

、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。＊离心时要配平⑵另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的133.取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可）,室温静置2-3mins4.吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。5.取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。3.取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关146.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。正常参考值：EtRFC：64.4±6.7％；

EaRFC：23.6±3.5％；

EsRFC：3.3±2.6％6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴15

结果T淋巴细胞SRBC结果T淋巴细胞SRBC16[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件17淋巴细胞转化试验－－

原理

T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。三种方法形态学方法、3H-TdR掺入法、MTT比色法淋巴细胞转化试验－－原理18

根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1－2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；其他细胞：中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。形态学方法：〔镜下观察〕

－－－淋巴细胞转化试验根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造19淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞＋未转化的淋巴细胞×100％正常参考值：80％红细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验瑞氏染色10×40

淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞＋未转化的淋巴细20[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件213H—TDR掺入法

－－－淋巴细胞转化试验T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。3H—TDR掺入法

－－－22MTT比色法

－－－淋巴细胞转化试验

MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。

MTT比色法

－－－淋巴细胞转化试验23

MTT

Formazan

InsolubleMTTFormazanInsoluble241.补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。2.E花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察结果。3.绘制淋巴细胞转化试验（形态学法）镜下观察结果。实验报告1.补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。实验报告25第4次实验课内容免疫标记技术：ELISA免疫病理实验实验课考试第4次实验课内容免疫标记技术：ELISA2641、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹

42、只有在人群中间，才能认识自己。——德国

43、重复别人所说的话，只需要教育；而要挑战别人所说的话，则需要头脑。——玛丽·佩蒂博恩·普尔

44、卓越的人一大优点是：在不利与艰难的遭遇里百折不饶。——贝多芬

45、自己的饭量自己知道。——苏联41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。——阿卜27[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测实验三补体参与的反应T细胞数量及其功能检测PartI补体参与的反应补体的溶血反应PartIIT细胞数量及其功能检测E花环形成试验－－数量测定淋巴细胞转化试验：形态学方法3H—TDR掺入法MTT比色法功能[免疫学]补体参与反应T细胞数量及其功能检测[免疫学]补体28[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件29[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件30[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件31[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件32孔号SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－6滴33滴－3滴6滴43滴－－9滴

步骤1、取24孔板，按下表加入各成分；

2、将24孔板放在37℃温箱内15-30min，观察并记录结果。结果:孔号SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－633PartIIT细胞数量及其功能检测PartIIT细胞数量及其功能检测342.E花环形成试验

原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体－E受体（CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。

检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。2.E花环形成试验原理检测T细胞数量，间接判断机体的35材料肝素抗凝血、绵羊红细胞(SRBC)淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5％戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等材料36

步骤：（动作轻柔；分清滴管及枪头！！！）⑴取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血3ml，用滴管贴管壁（倾斜30°）轻轻叠加于3ml分离液上（界面要清晰）→→→

配平后1800rpm离心13mins。

1.淋巴细胞悬液的制备：人淋巴细胞比重：1.070淋巴细胞分层液：1.077人红细胞比重：1.092步骤：（动作轻柔；分清滴管及枪头！37稀释的血液

分层液离心前稀释的血浆

单个核细胞分层液粒细胞红细胞离心后稀释的血液离心前稀释的血浆离心后38[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件39⑵另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。

(3)弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml，重复离心两次。2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液（约0.1ml）与绵羊红细胞0.1ml

、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。＊离心时要配平⑵另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的403.取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可）,室温静置2-3mins4.吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。5.取一滴（25ul）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。3.取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关416.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。正常参考值：EtRFC：64.4±6.7％；

EaRFC：23.6±3.5％；

EsRFC：3.3±2.6％6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴42

结果T淋巴细胞SRBC结果T淋巴细胞SRBC43[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件44淋巴细胞转化试验－－

原理

T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。三种方法形态学方法、3H-TdR掺入法、MTT比色法淋巴细胞转化试验－－原理45

根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1－2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；其他细胞：中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。形态学方法：〔镜下观察〕

－－－淋巴细胞转化试验根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造46淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞＋未转化的淋巴细胞×100％正常参考值：80％红细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验瑞氏染色10×40

淋巴细胞转化率：转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞＋未转化的淋巴细47[免疫学]补体参与反应-T细胞数量及其功能检测课件483H—TDR掺入法

－－－淋巴细胞转化试验T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁计数器测