农杆菌介导法课件

农杆菌介导法农杆菌介导法1农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤农杆菌2原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。原理：3

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的4农杆菌介导法课件5农杆菌介导法课件6Story冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年，Smith&Townsent

农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年，Braunetal.

证实俩者的关系，但发现有的菌株不致病。提出了假说：tumour-inducingprinciple,TIP.肿瘤诱导因子。60’s,肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine,nopaline）

总称冠瘿碱（opine)

。Petitetal.证实肿瘤组织合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)Story7Agropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.生长素和细胞分裂素；4um，分子质量为（90－150）×106Da。d)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)corbin,unpublishedresults)intranstothetiplasmidvirregion.近年来人们对农杆菌介导法机理作了深入研究，发现了酚类化合物在外源基因导入植物细胞的作用。5)

processinganddeliveryoftheT-DNA1986)，能够在T-DN

A边界重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此T-DNA往往以单链形式进入植物细胞。usugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)T37(T37chromosome,pTi37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)诱导因子。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。证实俩者的关系，但发现有的菌株不农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150kb）、不需贵重仪器等优点。当外源基因插入后，重组质粒可在辅助质粒的帮助下从大肠杆菌转移到根癌农杆菌。C58(C58chromosome,pTiC58)最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。1974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.

从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒

(tumorinducingplasmid)，称为Ti质粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，

T-DNA(transferredDNA),其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。1981年，Oomsetal.发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceregion)，Vir区。Agropine:pRi1855,pRi158Ti质粒Ti质粒9Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75.4um，分子质量为（90－150）×106Da。在温度低亍28℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。农杆菌介导法课件10Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：1赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3根癌农杆菌的寄主植物范围；4决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活.Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有111)Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类胭脂碱(nopaline)类农杆碱（agropine）类。Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti质粒的结构12农杆菌介导法课件13长度：160-250kb6大功能区：1)致癌区，这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。长度：160-250kb14T-DNAT-DNA15在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA，插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。由于T-DNA插入植物细胞染色体中的位置不相同的，因此植物染色体上可能并没有可供T-DNA插入的专一性DNA序列。在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列16脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的边界序列(bordersequence),分别称为左边界(leftborder,LB)和右边界(rightborder,RB).在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。研究表明，插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp17T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达产物催化生成的植物生长素（Tms1、Tms2

）和细胞分裂素（Tmr

）,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿.冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,构成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源.T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组18在植物转基因早期阶段，由于农杆菌转化系统即简单又不需要很多仪器设备，就成为很多科学工作者首先研究的热点。农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150kb）、不需贵重仪器等优点。可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.uphosphatestarvation证实俩者的关系，但发现有的菌株不6)T-DNAintegrationuacidicenvironment农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。Limitedinhostrange,genotype-dependent脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的边界序列(bordersequence),分别称为左边界(leftborder,LB)和右边界(rightborder,RB).总称冠瘿碱（opine)。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更

高。Table1SummaryofvirGeneProducts3)

inductionandinitiationofvirulencegenesuphenols:acetosyringone(strongerinducer)生长素和细胞分裂素；由于这些基因不能直接在植物细胞中表达，因此就把这些基因的编码区DNA插入某些植物基因的启动子后面，编码区后面则是来自植物基因的3'-端DNA顺序，其中包括终止子序列。1947年，Braunetal.Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。Vir区在植物转基因早期阶段，由于农杆菌转化系统即简单又不需要很多仪19Vir区（Vir-region），即毒性区，又称致瘤区域，其长度约为35kb。它们控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因的控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。virＥvirＤvirC

virG

virＢvirAvirＥ20植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子21目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T-DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香22最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。virA基因——virG基因最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜23其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使24农杆菌介导法课件25植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子26最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终整合进入植物核基因组。T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜27Table1SummaryofvirGeneProducts

Locus

Size(kb)

ORFsaProteinsSize(kDa)Locationb

FunctionvirA2.0190Mplantsignalsensor,proteinkinaseVirG1.0130CtranscriptionalactivatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNAborderendonuclease(VirD1andVirD2);pilotprotein?nuclearlocalization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processingofT-DNA(VirC1)VirE2.027,60.5C/M?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)

virB9.51126,12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNAtransferapparatus?Table1SummaryofvirG28Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(Yanofsky

M．F.可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。TGGATATATTGNPuGTGTAAAT1)hostperceptionTGGATATATTGNPuGTGTAAATuphenols:acetosyringone(strongerinducer)homologybetweenplantjunctionsandT-DNAsequences?可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。在这个载体中，有来自Ti质粒的T-DNA两个末端的片段TL和TR，其中有适合于植物细胞的标记基因新霉素抗性基因Neor和供外源基因插入的多克隆位点区（MCS）。发现Ti质粒上有致瘤区(virulence发现Ti质粒上有致瘤区(virulence5)

processinganddeliveryoftheT-DNATGGATATATTGNPuGTGTAAATA208(C58chromosome,Pti37)ulowpH(optimum,approximately5.由于大肠杆菌和根癌农杆菌之间的DNA转移频率可达100%，因而整个基因组文库或cDNA文库可以全部转移到农杆菌中。4um，分子质量为（90－150）×106Da。hotspots(activelytranscribed)?1981年，Oomsetal.thesefindingsformfhebasisofthedesignofmodifiedandsimplifiedt-dnamoleculesfhatareusefulasvectorstotransformplantcellswithcloneddnafragmentsofinterest(57,72,113).nuclearlocalization?(VirD2)它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。rhizogenes:provokeshairroots.发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceusugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)4um，分子质量为（90－150）×106Da。证实俩者的关系，但发现有的菌株不农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150kb）、不需贵重仪器等优点。uacidicenvironment插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。pre-infectionattachmentLimitedinhostrange,genotype-dependent植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。TGGATATATTGNPuGTGTAAAT可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。超声波予处理植物组织，可以提高转化效率。在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整1977年，Chiltonetal.(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.T-DNA单链

的5’端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更

高。③T-DNA加工和转移

Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(Yanofsky

M．F.

1986)，能够在T-DN

A边界重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此T-DNA往往以单链形式进入植物细胞。但是在植物细胞中也发现双链T-DNA分子。Strains:AgrobacteriumStrains29切刻位点(nick

site)可作为DNA从5’向3'合成的起始位点，新的DNA链合成后，T-DNA单链即被替换(displacement)释放出来(图2)。当然这种缺刻也可通过重组系统把T-DNA双链从Ti质粒上解离下来。切刻位点(nick

site)可作为DNA从5’向3'合成的30缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移，而左边界重复序列的缺失会稍稍降低T-DNA转移频率(Timmerman

B．1988)，这进一步说明T-DNA单链是在从右边界到左边界5’向3‘替换合成中释放出来的。缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移，而31右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能释放，所以T-DNA不能转移到植物细胞。而左边界的缺失，仅会影响DNA合成过程的终止，可能会降低导致T-DNA单链释放，而不会明显影响T-DNA单链的形成。右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能释放32可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。这种不同不是由于左右边界的24bp重复序列核苷酸不同，而是由于靠近右边界位置有一个转移增强子(transfer

enhancer；overdriver．Peralta

EG．1986)存在。这个T-DNA转移增强序列能极其明显的增加农杆菌中T-DNA链形成，并且这种作用与它的位置、方向及距离均无关系。增强子的缺失能够使农杆菌对宿主植物的毒性降低。Toro等人发现VirC1蛋白能特异性的结合这个增强子，VirC操纵元的突变也能导致农杆菌的毒性减弱。农杆菌介导法课件33当T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DNA？Paul等

人利用电转移法把单链DNA转化到烟草原生质体中，结果表明，在植物细胞中，

单链DNA迅速转变成双链DNA分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更

高。然而T-DNA分子并非以裸露的单链DNA形式进入植物细胞的。T-DNA单链

的5’端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。VirE2蛋白

质是一种单链结合蛋白质，能够包裹T-DNA单链，和其它T-DNA结合蛋白质共

同构成了T-复合体。当T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DN34冠瘿碱分解区冠瘿碱分解区35冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,被冠瘿碱分解基因分解成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源。冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,被冠瘿碱分解基因分解成36载体载体37植物是人类和所有动物赖以生存的基础，因此开展植物基因工程的研究，建立起转基因植物新材料是十分重要的。象其它生物一样，植物的克隆载体对于开展植物基因工程是必须，然而十分遗憾的是，至今仍未建立起植物的自主复制型载体。植物是人类和所有动物赖以生存的基础，因此开展植物基因工程的研38Ti质粒载体

利用Ti质粒构建的植物载体种类很多，常用的是双元载体(binaryvector)，这是一类能在大肠杆菌和根癌农杆菌中进行复制的广谱宿主载体。这类载体所使用的复制起点来自细胞质粒RK2，携带着两个T-DNA边界顺序和各种标记基因。当外源基因插入后，重组质粒可在辅助质粒的帮助下从大肠杆菌转移到根癌农杆菌。这种农杆菌内存在着一种T-DNA已全部丢失的Ti质粒(pAL4404)，它可以帮助重组双元质粒上的T-DNA转移到植物细胞中。由于大肠杆菌和根癌农杆菌之间的DNA转移频率可达100%，因而整个基因组文库或cDNA文库可以全部转移到农杆菌中。

农杆菌介导法课件39

在这个载体中，有来自Ti质粒的T-DNA两个末端的片段TL和TR，其中有适合于植物细胞的标记基因新霉素抗性基因Neor和供外源基因插入的多克隆位点区（MCS）。用于植物转化细胞的选择标记基因主要是来自细菌的某些抗药性基因，因为植物细胞对某些抗生素十分敏悉，比如卡那霉素、潮霉素、新霉素等。由于这些基因不能直接在植物细胞中表达，因此就把这些基因的编码区DNA插入某些植物基因的启动子后面，编码区后面则是来自植物基因的3'-端DNA顺序，其中包括终止子序列。

40农杆菌介导法课件41早在上世纪初Smith等人就发现作为自然存在的遗传工程，土壤中生存的根癌农杆菌可以将外源基因转入植物而导致根肿瘤的生成。农杆菌的致病基因在酸性条件和酚类诱导物（如乙酰丁香酮）的存在下，微生物DNA分子的一部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。这类酚类诱导物是大多数双子叶植物在受到伤害时产生的。在植物转基因早期阶段，由于农杆菌转化系统即简单又不需要很多仪器设备，就成为很多科学工作者首先研究的热点。1977年Chilton等人证明根癌农杆菌的Ti质粒的一部分转入植物细胞，整合进植物基因组使植物产生肿瘤。农杆菌转入植物的DNA片段称为转移DNA（T-DNA）。Ti质粒可以将外源基因转入植物的能力引起人们的广泛兴趣，早期的植物转基因工作既是用它作为植物转基因的载体，进行大量转基因研究。早在上世纪初Smith等人就发现作为自然存在的遗传工程，土42农杆菌介导法目前以根癌农杆菌使用的较多，尤其在早期的双子叶植物的遗传转化研究中上发挥了重要作用。近年来人们对农杆菌介导法机理作了深入研究，发现了酚类化合物在外源基因导入植物细胞的作用。尤其是日本烟草公司的Hiei等人在水稻遗传转化上应用农杆菌介导法获得了明显的进展，使这一转化方法在单子叶植物中也有了成功的应用。农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150kb）、不需贵重仪器等优点。农杆菌介导法目前以根癌农杆菌使用的较多，尤其在早期的双子叶植43Ti质粒可以将外源基因转入植物的能力引起人们的广泛兴趣，早期的植物转基因工作既是用它作为植物转基因的载体，进行大量转基因研究。1)hostperceptiond)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.6)T-DNAintegration③T-DNA加工和转移早在上世纪初Smith等人就发现作为自然存在的遗传工程，土壤中生存的根癌农杆菌可以将外源基因转入植物而导致根肿瘤的生成。pre-infectionattachment它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羟基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。T37(T37chromosome,pTi37)发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceCleanerinsertsTi质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.integrationsites:random?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)Nopaline:pTiC58,pTi1D135,pTi223DisadvantagesMoloecularmechanismsofT-DNAtransferintotheplantgenomeT-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.nuclearlocalization?(VirD2)5,25,32,48,38cel:cellulosesynthesizinggenes.在双子叶植物的转化研究中，可以用植物的叶片、幼茎、悬浮培养物、及发芽的种子等作为外植体进行农杆菌转化试验。在进行农杆菌转化试验中常常要对不同的农杆菌菌株、农杆菌和植物外植体共培养的时间和温度及选择压力进行优化，以获得更高的转化效率。根据Escudero等人研究结果，在自然条件下农杆菌可以渗入植物细胞，因而在作农杆菌转化时，没有必要对植物组织制造伤口。超声波予处理植物组织，可以提高转化效率。在用农杆菌进行葡萄转化试验时，用抗氧化剂如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫苏糖醇处理可以提高转化效率。

Ti质粒可以将外源基因转入植物的能力引起人们的广泛兴趣，早期44Agrobacterium-mediatedtransformation

Advantages:1.

Cleanerinserts2.

Higherco-expression3.

Moreflexibleintissuetypes(inplantatransformation)

almostanytypeoftissuesorcells4.Mostlywidelyusedsystem,bothmonocotanddicot5.Easyinmanipulation,Disadvantages1.

Onlygoodfornucleartransformation2.

Limitedinhostrange,genotype-dependent3.

DetrimentaltosometissuesAgrobacterium-mediatedtransfo45IntroductiontoAgrobacteriumMoloecularmechanismsofT-DNAtransferintotheplantgenomeFactorsinfluencingtheT-DNAdeliveryRegenerationandselectionoftransgenicplantsIntroductiontoAgrobacterium46TypesA.tumefaciens:thecausativeagentofplantdiseasecrownggall.rhizogenes:provokeshairroots.Bothcrowngallandroothairareneoplasticdiseases(planttumors),bothgram-negativesoilbacterium.Basedontheopinesproducedinthetumors,Tiplasmidsaredividedinfourgroups,whiletheRiplasmidsfallinthreegroups.Tiplasmidsu

Octopine:pTiAch5,pTiAg57,orpTi19955Nopaline:pTiC58,pTi1D135,pTi223Leucinnopine:pTi542,pTiAT4D,L-succinamopine:pTiEU6,pTiAT181

Riplasmidsu

Mannopine:pRi8196,pRiTR7Agropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4Cucumopine:pRi1659Types47Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)Examples:C58(C58chromosome,pTiC58)ABI(C58chromosome,pTiMp90RK,disarmedTiC58)GV3850(C58chromosome,pTiGV3850,disarmedTiC58)A281(C58chromosome,pTiBo542)EHA101(C58chromosome,pTiEHA101,disarmedpTiBo542EHA105(C58chromosome,pTiEHA105,disardisarmedpTiBo542)T37(T37chromosome,pTi37)A208(C58chromosome,Pti37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)LBA4404(Ach5chromosome,TiAL4404,disarmedpTiAch5)Strains:48

Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)Examples:C58(C58chromosome,pTiC58)ABI(C58chromosome,pTiMp90RK,disarmedTiC58)GV3850(C58chromosome,pTiGV3850,disarmedTiC58)A281(C58chromosome,pTiBo542)EHA101(C58chromosome,pTiEHA101,disarmedpTiBo542EHA105(C58chromosome,pTiEHA105,disardisarmedpTiBo542)T37(T37chromosome,pTi37)A208(C58chromosome,Pti37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)LBA4404(Ach5chromosome,TiAL4404,disarmedpTiAch5)Strains:AgrobacteriumStrain49MolecularmechanismsofT-DNAtransferintoplantgenomeStepsinT-DNAdelivery1)hostperception2)

pre-infectionattachment3)

inductionandinitiationofvirulencegenes4)synthesisandassemblyofthepromiscuouspilus5)

processinganddeliveryoftheT-DNA6)T-DNAintegrationMolecularmechanismsofT-DNA501)hostperception:

chemicalsignalsproducednaturallybyplantrootsservechemoattractantssuchassucrose,glucoseandfructoseaswellasaminoacidslikevalineandargininearegoodchemoattractants.plantisofolavomoidssuchasformonetonandcoumestrolinitiatingthetranscriptionofchromosomalgenesofAgrobacteriuminvolvedinfacilitatingrootcolonization.mostoftheVirgenesexceptforgenesofthevirbandvireoperonsarerequiredforAgrobacteriummotility.1)hostperception:512).pre-infectionattachment

a)AgrobacteriummustattachtoitshostcellsbeforetheT-DNAisprocessedandreadiedfortransfer,followingchemotaxistothehostplant.b)

attachmentisindependentofTiorRiplasmid.c)

A.tumefaciensadherencetoplantcellsissaturable.d)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.e)

Eachplantcellhasenoughattachmentsitesforseveralbacterlum,butplantcellsaretransformedbyonlyoneorafewbacterium.Nolossofcompetenceofplantcellcausesbythefirsrtagrobacteruminfection.f)

Chromosomalgenesinvolvedinattachment

chva,chcb,exoc:synthesisofacyclicβ-1,2-glucan,implicatedinplantcellbinding.cel:cellulosesynthesizinggenes.agrobacteriumcellsformslargeaggregatesmicroscopically,seenasclumpstethetedbycellulosefibrils.pscA:exopolisaccharidesysthesisandsecretionleadingtothesysthesisofcellulosefibrils.att:rootcolonization2).pre-infectionattachment523)inductionandinitiationofvirulencegenesa)virA:autophosphorilatingproteinrespondtotheenvironmentalsignalsbytransferringaphosphategrouptoVirGprotein.Theinductionofvirgenesexpressionissensitivetotemperature(<28℃).ThreetypesofsignalsarerecognizedbyvirA:

uphenols:acetosyringone(strongerinducer)

usugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)andsugarderivatives(galacturonicacid)ulowpH(optimum,approximately5.3)b)VirG:transcriptionalactivator.Rate-limitingproteinforvirgeneinduction,anditstranscriptionincreasesinresponsetothepresenceof:

uinducingphenolics

uacidicenvironmentuphosphatestarvationc)chvE:sugar-bindingprotein3)inductionandinitiationof534)synthesisandassemblyofthepromiscuouspilus

uponinductionofthevirgenes,asystematicsetofmoleculareventsleadingtothesynthesisandassemblyoftheconjugativepilustakeplace(seetableorfigureshownlocationandfunctionofVirBproteins)lowtemperatureat19℃isoptimal4)synthesisandassemblyofth545)

processinganddeliveryoftheT-DNA

T-DNA

leftandrightbordersimperfectdirect21-25bprepeatsVirD1andVirD2:T-DNAborderendonuclease;pilotprotein?nuclearlocalization,nuclearlocalizationsignal(nls)?(vird2)overdrive(24bpDNAsequence):anenhancer,stimulatesT-DNAtransfer,enhancest-dnacopynumberSSDNAVirE2:ssbprotein,nls,enhancestheefficincyoft-strandtransportintothenucleusVirC:Virc1andVirc2bindtooverdrive5)

processinganddelivery55twoconserveddomainsof13and5to7bpasfollows:TGGATATATTGNPuGTGTAAATNCCTTCOnlythese25bpdirectrepeatsattheendsoftheT-DNAarerequiredincisforitsmobilizationtotheplantcell.Becauseitstransferisunaffectedby(a)deletionsoftheinternalportionofnativeT-DNAsor(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.satchel,d.corbin,unpublishedresults)intranstothetiplasmidvirregion.thesefindingsformfhebasisofthedesignofmodifiedandsimplifiedt-dnamoleculesfhatareusefulasvectorstotransformplantcellswithcloneddnafragmentsofinterest(57,72,113).furthermore,deletionofthefirst6bporthelast10bpofthe25bpsequencesblockst-dnatransfer(101).twoconserveddomainsof13an56SSDNA由于这些基因不能直接在植物细胞中表达，因此就把这些基因的编码区DNA插入某些植物基因的启动子后面，编码区后面则是来自植物基因的3'-端DNA顺序，其中包括终止子序列。总称冠瘿碱（opine)。致病。Petitetal.在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。4um，分子质量为（90－150）×106Da。Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(Yanofsky

M．F.3)

inductionandinitiationofvirulencegenesAgropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4Nopaline:pTiC58,pTi1D135,pTi223Ti=TIPpre-infectionattachment在用农杆菌进行葡萄转化试验时，用抗氧化剂如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫苏糖醇处理可以提高转化效率。Petitetal.anditstranscriptionincreasesinresponsetothepresenceof:2赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。Limitedinhostrange,genotype-dependentT-DNA单链

的5’端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。T-DNAtransferapparatus?6)T-DNAintegration

integrationsites:random?hotspots(activelytranscribed)?homologybetweenplantjunctionsandT-DNAsequences?

Model:illegitimaterecombinationSSDNA6)T-DNAintegration57农杆菌介导法农杆菌介导法58农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤农杆菌59原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。原理：60

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的61农杆菌介导法课件62农杆菌介导法课件63Story冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年，Smith&Townsent

农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年，Braunetal.

证实俩者的关系，但发现有的菌株不致病。提出了假说：tumour-inducingprinciple,TIP.肿瘤诱导因子。60’s,肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine,nopaline）

总称冠瘿碱（opine)

。Petitetal.证实肿瘤组织合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)Story64Agropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.生长素和细胞分裂素；4um，分子质量为（90－150）×106Da。d)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)corbin,unpublishedresults)intranstothetiplasmidvirregion.近年来人们对农杆菌介导法机理作了深入研究，发现了酚类化合物在外源基因导入植物细胞的作用。5)

processinganddeliveryoftheT-DNA1986)，能够在T-DN

A边界重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此T-DNA往往以单链形式进入植物细胞。usugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)T37(T37chromosome,pTi37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)诱导因子。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。证实俩者的关系，但发现有的菌株不农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150kb）、不需贵重仪器等优点。当外源基因插入后，重组质粒可在辅助质粒的帮助下从大肠杆菌转移到根癌农杆菌。C58(C58chromosome,pTiC58)最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。1974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.

从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒

(tumorinducingplasmid)，称为Ti质粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，

T-DNA(transferredDNA),其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。1981年，Oomsetal.发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceregion)，Vir区。Agropine:pRi1855,pRi1565Ti质粒Ti质粒66Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75.4um，分子质量为（90－150）×106Da。在温度低亍28℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。农杆菌介导法课件67Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：1赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3根癌农杆菌的寄主植物范围；4决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活.Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有681)Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类胭脂碱(nopaline)类农杆碱（agropine）类。Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti质粒的结构69农杆菌介导法课件70长度：160-250kb6大功能区：1)致癌区，这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。长度：160-250kb71T-DNAT-DNA72在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA，插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。由于T-DNA插入植物细胞染色体中的位置不相同的，因此植物染色体上可能并没有可供T-DNA插入的专一性DNA序列。在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列73脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的边界序列(bordersequence),分别称为左边界(leftborder,LB)和右边界(rightborder,RB).在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。研究表明，插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp74T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达产物催化生成的植物生长素（Tms1、Tms2

）和细胞分裂素（Tmr

）,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿.冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,构成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源.T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组75在植物转基因早期阶段，由于农杆菌转化系统即简单又不需要很多仪器设备，就成为很多科学工作者首先研究的热点。农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以转入大的DNA片段（可达150kb）、不需贵重仪器等优点。可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.uphosphatestarvation证实俩者的关系，但发现有的菌株不6)T-DNAintegrationuacidicenvironment农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。Limitedinhostrange,genotype-dependent脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的边界序列(bordersequence),分别称为左边界(leftborder,LB)和右边界(rightborder,RB).总称冠瘿碱（opine)。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更

高。Table1SummaryofvirGeneProducts3)

inductionandinitiationofvirulencegenesuphenols:acetosyringone(strongerinducer)生长素和细胞分裂素；由于这些基因不能直接在植物细胞中表达，因此就把这些基因的编码区DNA插入某些植物基因的启动子后面，编码区后面则是来自植物基因的3'-端DNA顺序，其中包括终止子序列。1947年，Braunetal.Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表