免疫原和抗血清制备电子教案课件

免疫原和抗血清制备

——陈雪丽陈春婉冯慧婷侯纯蓉兰州大学2010级医学检验二班免疫原和抗血清制备陈春婉冯慧婷侯纯蓉1案例一常州狂犬疫苗造假事件

该公司2008年生产的4个批次人用狂犬疫苗效价低于国家标准，可能导致疫苗接种后免疫抗体水平低，无法充分发挥疫苗应有的预防保护作用，属于不合格产品。案例一常州狂犬疫苗造假事件2什么是疫苗？抗原？抗体？作用？1234什么是疫苗？抗原？抗体？作用？12343疫苗病原微生物及其代谢产物预防疾病用于人工主动免疫的生物制剂人工减毒、灭活、利用基因工程等经过特殊处理的抗原疫苗病原微生物预防疾病用于人工主动免疫的生物制剂人工减毒、灭4免疫原和抗血清制备电子教案课件5疫苗的分类

传统

新型

传统

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新型类毒素重组抗原疫苗重组载体疫苗DNA疫苗减毒活疫苗灭活疫苗亚单位疫苗合成肽疫苗基因工程疫苗免疫原性强的病原微生物，如伤寒、霍乱等，理化方法灭活人工诱导变异或从自然界中筛选的毒力高度减弱的病原微生物用0.3%-0.4%甲醛处理，丧失毒性的外毒素去除有害成分，保留免疫原性成分，脑膜炎球菌荚膜疫苗将具有免疫原性的多肽抗原或氨基酸序列与适当载体或佐剂结合成的疫苗采用DNA重组技术制备的只含保护性抗原组分的基因工程疫苗将编码病原体免疫原性的基因插入减毒的病毒或细菌，接种到人体将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原疫苗的分类传统新型传统6疫苗大致可以分为六大类：灭活疫苗，是被彻底杀死的病原，相当于把反动分子枪毙以后曝尸示众，由于是已经死掉的阶级敌人，往往导致革命队伍警惕性不很高，常需要反复刺激；减毒活疫苗，其实就是可以改造好的黑五类后代，经过教育改造，已经减弱或丧失了危害性，进入人体后现身说法介绍反革命分子的长相，并且可以繁殖供长期围观，效果很好，但也存在突然又反叛的危险，所以在筛选确认时耗费时间极长；类毒素疫苗，是处理后的细菌外毒素，相当于阶级敌人的便便经过消毒后给革命群众作为识别特征；亚单位疫苗，是除去其他成分后提取病原体中有效免疫原所得，如多糖类疫苗等，相当于将谋逆贼子砍头后传首九边以供识别；免疫原和抗血清制备电子教案课件7上述种种，均直接来源于病原，真正像照片的，其实是基因重组疫苗和DNA疫苗，它们都是对病原体照相——找到编码免疫原的基因——这段基因相当于底片，在基因重组疫苗中，该基因被插入表达系统——比如把乙肝的HBS抗原基因植入酵母菌当中，酵母菌就是冲片机，表达出的抗原相当于冲印好的照片，经过纯化制成疫苗；DNA疫苗则是将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原相当于上级只发放底片，得自己冲洗。上述种种，均直接来源于病原，真正像照片的，其实是基因重组疫苗8免疫原疫苗抗原免疫原疫苗抗原9抗原诱导机体产生免疫应答（免疫原性）与免疫应答产物结合（抗原性）疫苗经过特殊处理诱导机体产生免疫应答免疫原诱导机体产生免疫应答抗原半抗原

仅具有抗原性抗原诱导机体产生免疫应答（免疫原性）疫苗经过特殊处理免疫原诱10疫苗都是免疫原？免疫原都是疫苗？免疫原都是抗原？抗原都是免疫原？疫苗都是免疫原？11疫苗免疫原抗原疫苗免疫原抗原12合格疫苗？安全性有效性专一性可获得性适合大批量生产易保存经济合格疫苗？安全性13如何制备？疫苗的制造过程，大体上可以分成4部分：1.筛选种毒；2.扩繁病原；3.处理纯化；4.验证批签。如何制备？疫苗的制造过程，大体上可以分成4部分：14如何制备？颗粒性抗原的制备（细胞、细菌、寄生虫等）灭活疫苗细胞抗原（绵羊红细胞）经生理盐水等溶液洗净，配制成一定浓度；细菌抗原纯菌增菌后处理制备菌体(O)抗原置于100℃水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；制备H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛处理；制备细菌毒素抗原，杀菌后用0.5%-1%氯化钙处理。如何制备？颗粒性抗原的制备（细胞、细菌、寄生虫等）15可溶性抗原亚单位疫苗包括：蛋白质、核酸、多糖、脂蛋白等来源：组织和细胞步骤：提取和纯化可溶性抗原亚单位疫苗16粗提组织、细胞破碎，取上清组织匀浆：必须为新鲜或低温保存高速组织捣碎机法；研磨法（脑、胰腺）2.细胞破碎：冻融法，缓慢融化，适用于细胞超声破碎法，间歇进行，适用于细胞酶法，不易破坏内含物成分，适用于微生物表面活性剂处理法，多用于细菌提取核酸粗提组织、细胞破碎，取上清17纯化（以蛋白为例）超速离心法差速离心法分离大小和密度差异较大的颗粒

差速离心法原理示意图纯化（以蛋白为例）超速离心法差速离心法原理示意图18纯化密度梯度离心法将样品放在惰性介质（梯度液）中进行离心沉淀蔗糖、甘油、氯化铯等纯化密度梯度离心法19纯化特点适用于少数大分子抗原及某些比重较小的抗原纯化20纯化选择性沉淀法盐析法纯度不高，适合初步纯化，常用33%-35%饱和度的硫酸铵有机溶剂沉淀法必须在0℃下进行，常用乙醇和丙酮聚合物沉淀法PEG，分子量越大，PEG浓度越低核酸沉淀剂法硫酸鱼精蛋白、核酸酶等去除核酸纯化选择性沉淀法21免疫原和抗血清制备电子教案课件22纯化层析法1.凝胶层析法分子量不同2.离子交换柱层析法蛋白质的等电点不同3.亲和层析法生物分子结合的特异性和可逆性纯化层析法23纯化-凝胶层析法纯化-凝胶层析法24纯化-凝胶层析法纯化-凝胶层析法25纯化-离子交换层析1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大纯化-离子交换层析1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；26纯化-亲和层析纯化-亲和层析27纯化电泳法分子量电荷数量纯化电泳法28纯化

粗分级一般采用盐析、有机溶剂分级等方法；

细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等方法。

必要时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。纯化粗分级一般采用盐析、有机溶剂分级等方法；29细胞破碎固液分离粗分级细分级GoingUp细胞破碎固液分离粗分级细分级GoingUp30纯化抗原的鉴定含量双缩脲法、比浊法、酚试剂法、直接紫外吸收法等分子量SDS纯度SDS、HPLC免疫活性双向免疫扩散、ELISA等纯化抗原的鉴定含量31琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳32琼脂糖凝胶电泳-模式图琼脂糖凝胶电泳-模式图33SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，34人工抗原人工结合抗原（半抗原）人工合成抗原基因工程抗原人工抗原人工结合抗原（半抗原）35人工结合抗原半抗原（>=20）载体(1)蛋白质牛血清蛋白多肽类聚合物多聚赖氨酸大分子聚合物羧甲基纤维素完全抗原物理化学羧甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮某些功能基团鉴定吸收光谱分析法放射性核素标记法人工结合抗原半抗原（>=20）载体(1)蛋白质牛血清蛋36人工合成抗原……化学方法……化学方法合成肽疫苗人工合成抗原……化学方法……化学方法合成肽疫苗37基因工程抗原——基因工程疫苗提取、纯化、鉴定基因工程抗原——基因工程疫苗提取、纯化、鉴定38毒性试验（安全性试验）

通常包括杀菌剂的残留，防腐剂的含量，热源含量，有无微生物污染，培养基残留等，例如因为可能有人对鸡蛋过敏，所以所有鸡胚培养的疫苗必须严格监控卵清蛋白残留；而怀疑牛血清中可能有对人体不利的物质，凡添加了牛血清培养细胞的，必须监控牛血清白蛋白残留量；对于灭活疫苗，还要检测其灭活程度，通常是把成品或处理后的原液接种到细胞或实验动物，动物或细胞没有感染迹象才算过关，对于弱毒疫苗，还要用动物做毒力测定，以保证疫苗没有复壮成致病株。毒性试验（安全性试验）通常包括杀菌剂的残留，防腐39效力试验（免疫保护实验）

有效性检测，最基本的，是用抗血清检查疫苗中确实含有目的抗原，然后做效力测定，给实验动物注射疫苗，检查有无产生促发特异的免疫应答产生特定抗体，或者，比较倒霉的实验动物会被接种致病菌观察疫苗的保护效应。效力试验（免疫保护实验）有效性检测，最基本的，是40我的疑问抗原到疫苗，到底要怎么处理？我的疑问抗原到疫苗，到底要怎么处理？41参考：三枪拍案说疫苗·生产——科学松鼠会蛋白质分离纯化——生物秀论坛嗜水气单胞菌亚单位疫苗的研制——孙建和、严亚贤等从乙肝疫苗的制备看疫苗纯化技术的发展——张国强、赵铠参考：42经验概念：1.看书2.wikipedia3.科学松鼠会方法技术：1.文献2.论坛丁香园生物秀小木虫经验概念：43本次课程结束，谢谢大家本次课程结束，谢谢大家44免疫原和抗血清制备

——陈雪丽陈春婉冯慧婷侯纯蓉兰州大学2010级医学检验二班免疫原和抗血清制备陈春婉冯慧婷侯纯蓉45案例一常州狂犬疫苗造假事件

该公司2008年生产的4个批次人用狂犬疫苗效价低于国家标准，可能导致疫苗接种后免疫抗体水平低，无法充分发挥疫苗应有的预防保护作用，属于不合格产品。案例一常州狂犬疫苗造假事件46什么是疫苗？抗原？抗体？作用？1234什么是疫苗？抗原？抗体？作用？123447疫苗病原微生物及其代谢产物预防疾病用于人工主动免疫的生物制剂人工减毒、灭活、利用基因工程等经过特殊处理的抗原疫苗病原微生物预防疾病用于人工主动免疫的生物制剂人工减毒、灭48免疫原和抗血清制备电子教案课件49疫苗的分类

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新型类毒素重组抗原疫苗重组载体疫苗DNA疫苗减毒活疫苗灭活疫苗亚单位疫苗合成肽疫苗基因工程疫苗免疫原性强的病原微生物，如伤寒、霍乱等，理化方法灭活人工诱导变异或从自然界中筛选的毒力高度减弱的病原微生物用0.3%-0.4%甲醛处理，丧失毒性的外毒素去除有害成分，保留免疫原性成分，脑膜炎球菌荚膜疫苗将具有免疫原性的多肽抗原或氨基酸序列与适当载体或佐剂结合成的疫苗采用DNA重组技术制备的只含保护性抗原组分的基因工程疫苗将编码病原体免疫原性的基因插入减毒的病毒或细菌，接种到人体将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原疫苗的分类传统新型传统50疫苗大致可以分为六大类：灭活疫苗，是被彻底杀死的病原，相当于把反动分子枪毙以后曝尸示众，由于是已经死掉的阶级敌人，往往导致革命队伍警惕性不很高，常需要反复刺激；减毒活疫苗，其实就是可以改造好的黑五类后代，经过教育改造，已经减弱或丧失了危害性，进入人体后现身说法介绍反革命分子的长相，并且可以繁殖供长期围观，效果很好，但也存在突然又反叛的危险，所以在筛选确认时耗费时间极长；类毒素疫苗，是处理后的细菌外毒素，相当于阶级敌人的便便经过消毒后给革命群众作为识别特征；亚单位疫苗，是除去其他成分后提取病原体中有效免疫原所得，如多糖类疫苗等，相当于将谋逆贼子砍头后传首九边以供识别；免疫原和抗血清制备电子教案课件51上述种种，均直接来源于病原，真正像照片的，其实是基因重组疫苗和DNA疫苗，它们都是对病原体照相——找到编码免疫原的基因——这段基因相当于底片，在基因重组疫苗中，该基因被插入表达系统——比如把乙肝的HBS抗原基因植入酵母菌当中，酵母菌就是冲片机，表达出的抗原相当于冲印好的照片，经过纯化制成疫苗；DNA疫苗则是将编码抗原的基因转入真核表达载体后注入人体，它需要人体细胞来利用这段基因自己表达抗原相当于上级只发放底片，得自己冲洗。上述种种，均直接来源于病原，真正像照片的，其实是基因重组疫苗52免疫原疫苗抗原免疫原疫苗抗原53抗原诱导机体产生免疫应答（免疫原性）与免疫应答产物结合（抗原性）疫苗经过特殊处理诱导机体产生免疫应答免疫原诱导机体产生免疫应答抗原半抗原

仅具有抗原性抗原诱导机体产生免疫应答（免疫原性）疫苗经过特殊处理免疫原诱54疫苗都是免疫原？免疫原都是疫苗？免疫原都是抗原？抗原都是免疫原？疫苗都是免疫原？55疫苗免疫原抗原疫苗免疫原抗原56合格疫苗？安全性有效性专一性可获得性适合大批量生产易保存经济合格疫苗？安全性57如何制备？疫苗的制造过程，大体上可以分成4部分：1.筛选种毒；2.扩繁病原；3.处理纯化；4.验证批签。如何制备？疫苗的制造过程，大体上可以分成4部分：58如何制备？颗粒性抗原的制备（细胞、细菌、寄生虫等）灭活疫苗细胞抗原（绵羊红细胞）经生理盐水等溶液洗净，配制成一定浓度；细菌抗原纯菌增菌后处理制备菌体(O)抗原置于100℃水浴2-2.5h去除鞭毛(H)抗原；制备H抗原，菌液用0.3%-0.5%甲醛处理；制备细菌毒素抗原，杀菌后用0.5%-1%氯化钙处理。如何制备？颗粒性抗原的制备（细胞、细菌、寄生虫等）59可溶性抗原亚单位疫苗包括：蛋白质、核酸、多糖、脂蛋白等来源：组织和细胞步骤：提取和纯化可溶性抗原亚单位疫苗60粗提组织、细胞破碎，取上清组织匀浆：必须为新鲜或低温保存高速组织捣碎机法；研磨法（脑、胰腺）2.细胞破碎：冻融法，缓慢融化，适用于细胞超声破碎法，间歇进行，适用于细胞酶法，不易破坏内含物成分，适用于微生物表面活性剂处理法，多用于细菌提取核酸粗提组织、细胞破碎，取上清61纯化（以蛋白为例）超速离心法差速离心法分离大小和密度差异较大的颗粒

差速离心法原理示意图纯化（以蛋白为例）超速离心法差速离心法原理示意图62纯化密度梯度离心法将样品放在惰性介质（梯度液）中进行离心沉淀蔗糖、甘油、氯化铯等纯化密度梯度离心法63纯化特点适用于少数大分子抗原及某些比重较小的抗原纯化64纯化选择性沉淀法盐析法纯度不高，适合初步纯化，常用33%-35%饱和度的硫酸铵有机溶剂沉淀法必须在0℃下进行，常用乙醇和丙酮聚合物沉淀法PEG，分子量越大，PEG浓度越低核酸沉淀剂法硫酸鱼精蛋白、核酸酶等去除核酸纯化选择性沉淀法65免疫原和抗血清制备电子教案课件66纯化层析法1.凝胶层析法分子量不同2.离子交换柱层析法蛋白质的等电点不同3.亲和层析法生物分子结合的特异性和可逆性纯化层析法67纯化-凝胶层析法纯化-凝胶层析法68纯化-凝胶层析法纯化-凝胶层析法69纯化-离子交换层析1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大纯化-离子交换层析1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；70纯化-亲和层析纯化-亲和层析71纯化电泳法分子量电荷数量纯化电泳法72纯化

粗分级一般采用盐析、有机溶剂分级等方法；

细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等方法。

必要时，还可采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步骤。纯化粗分级一般采用盐析、有机溶剂分级等方法；73细胞破碎固液分离粗分级细分级GoingUp细胞破碎固液分离粗分级细分级GoingUp74纯化抗原的鉴定含量双缩脲法、比浊法、酚试剂法、直接紫外吸收法等分子量SDS纯度SDS、HPLC免疫活性双向免疫扩散、ELISA等纯化抗原的鉴定含量75琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳76琼脂糖凝胶电泳-模式图琼脂糖凝胶电泳-模式图77SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，78人工抗原人工结合抗原（半抗原）人工合成抗原基因工程抗原人工抗原人工结合抗原（半抗原）79人工结合抗原半抗原（>=20）载体(1)蛋白质牛血清蛋白多肽类聚合物多聚赖氨酸大分子聚合物羧甲基纤维素完全抗原物理化学羧甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮某些