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文档简介

狂犬病实验室检测技术狂犬病实验室检测技术1(优选)狂犬病实验室检测技术2(优选)狂犬病实验室检测技术2实验室操作前的要求及准备(一)实验室条件及生物安全操作要求(二)检测标本的要求(三)实验前准备实验室操作前的要求及准备(一)实验室条件及生物安全操作要求3(一)实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人员需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。2、P2实验室操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3实验室内进行

(实验室固定毒在P2,病人或动物分离的街毒在P3)。3、P3实验室对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。

没有P3实验室,严禁从事狂犬病毒分离工作。(一)实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫44、个人防护实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套,作好技术上的准备。5、防止气溶胶扩散由于空气传播狂犬病毒已经得到证实,因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。6、实验后消毒处理实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂(肥皂水、醚、氯仿、丙酮),45~70%乙醇,碘制剂和四铵化合物敏感,操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。4、个人防护51、采集时间

(1)应尽量采集较新鲜的标本。(2)采集时无菌操作,避免标本污染2、标本保存(1)尽量低温保存(2)存放于无菌离心管中并进行编号。

3、标本类型(1)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。(2)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于病原学检测,其中以脑组织中的阳性率最高;血清和脑脊液可用于抗体的检测。(二)检测标本的要求1、采集时间(二)检测标本的要求6(三)实验前准备1、实验室及仪器的准备(略)2、各种试剂及材料的准备(略)(三)实验前准备1、实验室及仪器的准备(略)7实验室检测方法(一)DFA法(二)巢式PCR法(三)其它检测方法(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法(五)美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法实验室检测方法(一)DFA法8(一)DFA法(直接荧光抗体法)

——检测狂犬病毒抗原

免疫荧光技术Ab优点Ag(尤其是不产生细胞病变的病毒安全快速简便敏感性和特异性较高(一)DFA法(直接荧光抗体法)

9荧光抗体的染色方法可分为两类:直接法

—荧光抗体直接与标本内的抗原反应,

优点简便、快捷、有效减少非特异性染色,

只适用于检测细胞内的抗原;间接法

—荧光抗体作为第二抗体,与直接结合胞内抗原的第一抗体反应,

既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体相对直接法操作步骤增多

DFA原理:

抗体蛋白分子

++抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原

荧光素荧光抗体的染色方法可分为两类:10操作:1、材料和仪器2、操作步骤i.印片:

用酒精浸泡载玻片30分钟后取出、吹干,分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上;

ii.固定:吹干后,取冷丙酮(4℃)室温固定7~10分钟;取出吹干,进行步骤3,或置于-70℃冰箱保存;iii.加荧光抗体:将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上(如果从冰箱中取出,则待雾气散掉后再进行此步骤。);

操作:1、材料和仪器11(优选)狂犬病实验室检测技术检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;4PBS制成30%的悬液,离心取上清加1)包涵体颗粒典型,但视野不到10%,或视野大于10%,但抗原分布极-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,++:荧光明亮,且多个视野均有分布;研磨标本→制成悬液(用PBS或MEM,30%)→离心(4℃2000r/min离心20m)→取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞)→吸附(2h)→加维持液→孵育(37℃、5%C02、4~5天)→鉴定1m1,37℃中和1.注:如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑,有必要进行第三次细胞传代。分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上;3)33ulRNA液65℃水浴10min(其间准备冰盒或碎冰)观察结果(PBS洗3次,荧光显微镜观察结果)相对直接法操作步骤增多对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;作为DFA检测之外的另一种确证性检测iv.孵育:将抗原片放在湿盒中,37℃温育30分钟;v.洗片:取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,再用PBS振洗2遍,蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;vi.封片镜检:用90%甘油(PBS)封片,加盖玻片,荧光显微镜观察。

搅拌器及染色缸

(优选)狂犬病实验室检测技术iv.孵育:搅拌器及染色缸12结果判断:

仔细观察每个视野的荧光强度,并结合不同视野的荧光分布,作出荧光强度的等级判断:阴性、可疑、+~++++-:无荧光;+/-:极弱的可疑荧光;无荧光“-”

结果判断:仔细观察每个视野的荧光强度,并结合不同视野13+:荧光较弱,但清晰可见;+:荧光较弱,但清晰可见;14++:荧光明亮,且多个视野均有分布;++:荧光明亮,且多个视野均有分布;15+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;荧光强度“+++”荧光强度“++++”+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;16狂犬病实验室检测技术课件17(二)巢式PCR方法——检测狂犬病毒核酸

传统的PCR检测模式一般需要三个步骤:制备模板:对待测标本进行核酸(DNA或RNA)提取扩增过程:采用PCR或RT-PCR技术对核酸进行变性、退火、延伸扩增;检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。

SampleExtractRNAorDNAPCRElectrophoresisphotograph(二)巢式PCR方法——检测狂犬病毒核酸传统的PCR18巢式PCR(nested-PCR):巢式PCR的原理:是设计两对引物,其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上,通过二次PCR反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物,经过循环扩增后,将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。

优点:特异性、灵敏度均比常规PCR好。缺点:比常规PCR易污染。巢式PCR(nested-PCR):巢式PCR的原理:19巢式PCR方法的操作:

1、RNA提取:Trizol法

(1)以下步骤在P2生物安全柜中进行取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol

先加200μl(研磨均匀)然后加满至1000μl[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]↓-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,室温放置5分钟(此步完可-70℃保存1个月)

巢式PCR方法的操作:1、RNA提取:Trizol20(2)以下步骤可在普通实验室进行

-70℃取出,室温融化→加200μl氯仿,快速颠倒Epp管数次(30秒),使其呈淡粉红色↓室温放置3min↓4℃离心,12000rpm,15min(其间标记新的离心管,每管中加600μl异丙醇)↓取离心后水相600μl,加入新的离心管中,轻柔混匀↓室温放置10min(-20℃放置30分钟效果更佳)↓4℃离心,12000rpm,10min↓

(2)以下步骤可在普通实验室进行21缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,可见少量沉淀↓加1ml75%乙醇(DEPCH2O新鲜配制)洗涤沉淀↓4℃离心12000rpm,10min↓缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,室温干燥数分钟(加入75%乙醇至-70℃可长期贮存1~2年)↓脑组织的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2个EPP管分装)[液体(唾液、尿液等)的沉淀溶于35ulDEPCH2O中]↓直接进行逆转录或-70℃贮存缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,可见少量沉淀22取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,为疫苗免疫力程度的评判指标1ml血清和标准病毒稀释液0.-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,3)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。1、DFA——检测狂犬病毒抗原-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,在感染后,狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应(针对狂犬病毒)。3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);乳小白鼠接种法——分离病毒对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。5IU/ml血清,表示能得到有效的保护1m1,37℃中和1.检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。2、荧光灶抑制试验——检测中和抗体尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存照相:凝胶成像仪/紫外透射仪如:狂犬病样本的单克隆抗体分型6)再向反应管中加入1ulpd(N)60.(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法注意事项:

1.操作时一定戴口罩手套,保证离心管枪头无RNA酶2.一次提取核酸,样本数不要太多(10个左右)3.加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确,否则容易降低提取效率4.异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果5.加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔,加液体时贴壁缓流,以免破坏到所提核酸6.尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存7.标本及时放回-20℃或-70℃

取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,注意事项:232、逆转录合成cDNA1)pd(N)6稀释至0.2ug/ul2)水浴预热至65℃(其间标记反应管)3)33ulRNA液65℃水浴10min(其间准备冰盒或碎冰)4)冰浴2min,瞬时离心。5)将液体转移至试剂盒反应管中32ul,先不要混匀。6)再向反应管中加入1ulpd(N)60.2ug/ul或特异引物各0.5ul,使总体积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。7)37℃水浴,60min8)-20℃或-70℃保存cDNA2、逆转录合成cDNA243、巢式PCR:3、巢式PCR:25狂犬病实验室检测技术课件26琼脂糖凝胶电泳

1.电泳槽中注入缓冲液TAE2.将做好的琼脂胶放入电泳槽(加样孔在负极方向)3.Marker加5ul,样品加10ul5.电压:100V6.时间:30min

照相:凝胶成像仪/紫外透射仪琼脂糖凝胶电泳27(三)其它检测方法1、ELISA——检测抗原:包被抗体:用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG

包被96孔酶标板,4℃过夜;

封闭:用含0.3%牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟;加待检标本:将采集到的标本研磨,用pH7.4PBS制成30%的悬液,离心取上清加入酶标板孔内,同时设阴性、阳性对照,200μl/孔,37℃孵育1小时;洗板:洗板四次;加酶标抗体:后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔,37℃l小时;洗板:同上;加底物:加入酶反应底物,室温作用30分钟;终止反应:加2MH2SO4终止反应;观察结果:肉眼观察或酶标仪测定结果。(三)其它检测方法1、ELISA——检测抗原:282、荧光灶抑制试验——检测中和抗体

中和抗体:

为疫苗免疫力程度的评判指标中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清,表示能得到有效的保护快速荧光灶抑制试验(RFFIT):为WHO推荐的检测方法制备细胞悬液(1×10cells/ml的BSR细胞悬液)

稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS株)

中和血清和病毒(0.1ml血清和标准病毒稀释液0.1m1,37℃中和1.5小时)

检测剩余病毒(每孔加入50µl制备好的细胞悬液,37℃、5%C02过夜培养)

固定(弃掉培养液,PBS洗一次,丙酮固定)

荧光抗体检测(干燥后,加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体,37℃30分钟)

观察结果(PBS洗3次,荧光显微镜观察结果)

计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制≥50%的血清最高稀释倍数,即为被检血清的中和抗体滴度)

步骤2、荧光灶抑制试验——检测中和抗体中和抗体:步293、病毒分离A.细胞培养法——分离病毒研磨标本→

制成悬液(用PBS或MEM,30%)→

离心(4℃2000r/min离心20m)→

取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞)→

吸附(2h)→

加维持液→

孵育(37℃、5%C02、4~5天)→

鉴定B.乳小白鼠接种法——分离病毒研磨标本

制成悬液→

离心→取上清接种乳鼠脑内(1~2日龄)→饲养→观察发病情况(未发病的鼠保留至21天后作DFA检测)3、病毒分离A.细胞培养法——分离病毒304、ELISA——检测狂犬病毒抗体ELISA方法测定的是总抗体,不代表具有保护性的中和抗体水平其结果仅供参考。5、染色镜检——检测内基氏小体4、ELISA——检测狂犬病毒抗体31(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法1、DFA法——检测狂犬病毒抗原

意义:阳性结果,表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。2、ELISA——检测狂犬病毒抗原

意义:检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法——分离狂犬病毒

意义:阳性结果表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法1、324、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸原理:狂犬病毒为负链RNA病毒,PCR前需要经过逆转录酶作用,合成一条cDNA链(RT),再进行PCR。检测步骤:

1)病毒RNA的提取

2)逆转录合成cDNA3)PCR扩增

4)电泳意义:阳性结果表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。4、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸原理:335、狂犬病特异性抗体检测狂犬病特异性抗体:

在自然感染情况下,狂犬病毒→通过带有病毒的动物唾液→进入机体伤口→在入侵部位基本上不增殖(一般也不侵入血流)→故不能形成病毒血症。

在感染后,狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应(针对狂犬病毒)。

晚期,狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。

因此,通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低,只在临床疾病的晚期出现。5、狂犬病特异性抗体检测34A.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)——测定中和抗体意义:中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清,表示能得到有效的保护B.ELISA——检测狂犬病毒抗体意义:

1)接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/ml,表明已获得一定的保护。

2)未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/ml,且近期有4倍增高,可考虑狂犬病。

3)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。A.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)——测定中和抗体35(五)美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法

1、DFA——检测狂犬病毒抗原

当以下情况发生时,需要重复(证实性)检测:

1)包涵体颗粒典型,但视野不到10%,或视野大于10%,但抗原分布极度稀疏(如每个视野中只有1到2个包涵体颗粒);

2)包涵体颗粒典型,但染色强度较弱且缺乏特征性;

3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);

4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;

5)两种试剂的检测结果或两个技术人员的结果判定不一致。当进行重复性确证性DFA检测时,通常采用两种以上的检测试剂进行同比实验。(五)美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法1、D363)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。8)-20℃或-70℃保存cDNA快速荧光灶抑制试验(RFFIT):为WHO推荐的检测方法1ml血清和标准病毒稀释液0.细胞培养法——分离病毒中和血清和病毒(0.[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,2ug/ul或特异引物各0.既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体3.Marker加5ul,样品加10ul工作人员需要暴露前免疫晚期,狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol照相:凝胶成像仪/紫外透射仪[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。2、RT-PCR——检测核酸3、细胞培养法——分离病毒:鼠神经瘤细胞(MNA)目的:从未知的脑悬液中分离狂犬病毒,作为DFA检测之外的另一种确证性检测结果解释:

•分离到狂犬病毒,结果为阳性。

•传代2次后分离不到狂犬病毒,结果为阴性。注:如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑,有必要进行第三次细胞传代。3)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。2、RT374、直接快速免疫组化试验(DRIT)——检测狂犬病毒核蛋白(狂犬病诊断的抗生物素蛋白链菌素-生物素过氧化酶染色技术

)4、直接快速免疫组化试验(DRIT)——检测狂犬病毒核蛋385、其它方法如:狂犬病样本的单克隆抗体分型

目的:利用7种狂犬病毒单抗对一些阳性狂犬病样本进行抗原分型鉴定。5、其它方法如:狂犬病样本的单克隆抗体分型39表格表格40尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存狂犬病毒为负链RNA病毒,PCR前需要经过逆转录酶作用,合成一条cDNA链(RT),再进行PCR。(加入75%乙醇至-70℃可长期贮存1~2年)作为DFA检测之外的另一种确证性检测加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔,加液体时贴壁缓流,以免破室温放置5分钟是设计两对引物,其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上,通过二次PCR反应对某个基因进行检测。(2)存放于无菌离心管中并进行编号。取离心后水相600μl,加入新的离心管中,轻柔混匀3)PCR扩增取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套,3%牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果+:荧光较弱,但清晰可见;3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);没有P3实验室,严禁从事狂犬病毒分离工作。注:如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑,有必要进行第三次细胞传代。照相:凝胶成像仪/紫外透射仪为疫苗免疫力程度的评判指标(优选)狂犬病实验室检测技术分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上;1)病毒RNA的提取蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;特异性、灵敏度均比常规PCR好。阳性结果,表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。(一)DFA法(直接荧光抗体法)

——检测狂犬病毒抗原(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法巢式PCR(nested-PCR):8)-20℃或-70℃保存cDNA6碳酸盐缓冲液封闭30分钟;稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS株)1、实验室及仪器的准备(略)对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。加待检标本:将采集到的标本研磨,用pH7.乳小白鼠接种法——分离病毒取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂(肥皂水、醚、氯仿、丙酮),45~70%乙醇,碘制剂和四铵化合物敏感,操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。3)33ulRNA液65℃水浴10min(其间准备冰盒或碎冰)尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体为疫苗免疫力程度的评判指标[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,+/-:极弱的可疑荧光;积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS株)(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法研磨标本→制成悬液(用PBS或MEM,30%)→离心(4℃2000r/min离心20m)→取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞)→吸附(2h)→加维持液→孵育(37℃、5%C02、4~5天)→鉴定蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol(优选)狂犬病实验室检测技术2.将做好的琼脂胶放入电泳槽(加样孔在负极方向)(一)实验室条件及生物安全操作要求(如果从冰箱中取出,则待雾气散掉后再进行此步骤。快速颠倒Epp管数次(30秒),使其呈淡粉红色晚期,狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。加待检标本:将采集到的标本研磨,用pH7.1、DFA——检测狂犬病毒抗原作为DFA检测之外的另一种确证性检测对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;没有P3实验室,严禁从事狂犬病毒分离工作。(如果从冰箱中取出,则待雾气散掉后再进行此步骤。8)-20℃或-70℃保存cDNA取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol相对直接法操作步骤增多3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);照相:凝胶成像仪/紫外透射仪3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,脑组织的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2个EPP管分装)尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存1m1,37℃中和1.尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存2、逆转录合成cDNA研磨标本→制成悬液(用PBS或MEM,30%)→离心(4℃2000r/min离心20m)→取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞)→吸附(2h)→加维持液→孵育(37℃、5%C02、4~5天)→鉴定3)PCR扩增1、DFA——检测狂犬病毒抗原尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一41狂犬病实验室检测技术狂犬病实验室检测技术42(优选)狂犬病实验室检测技术43(优选)狂犬病实验室检测技术2实验室操作前的要求及准备(一)实验室条件及生物安全操作要求(二)检测标本的要求(三)实验前准备实验室操作前的要求及准备(一)实验室条件及生物安全操作要求44(一)实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫工作人员需要暴露前免疫意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。2、P2实验室操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3实验室内进行

(实验室固定毒在P2,病人或动物分离的街毒在P3)。3、P3实验室对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。

没有P3实验室,严禁从事狂犬病毒分离工作。(一)实验室条件及生物安全操作要求1、暴露前免疫454、个人防护实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套,作好技术上的准备。5、防止气溶胶扩散由于空气传播狂犬病毒已经得到证实,因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。6、实验后消毒处理实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂(肥皂水、醚、氯仿、丙酮),45~70%乙醇,碘制剂和四铵化合物敏感,操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。4、个人防护461、采集时间

(1)应尽量采集较新鲜的标本。(2)采集时无菌操作,避免标本污染2、标本保存(1)尽量低温保存(2)存放于无菌离心管中并进行编号。

3、标本类型(1)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。(2)唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于病原学检测,其中以脑组织中的阳性率最高;血清和脑脊液可用于抗体的检测。(二)检测标本的要求1、采集时间(二)检测标本的要求47(三)实验前准备1、实验室及仪器的准备(略)2、各种试剂及材料的准备(略)(三)实验前准备1、实验室及仪器的准备(略)48实验室检测方法(一)DFA法(二)巢式PCR法(三)其它检测方法(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法(五)美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法实验室检测方法(一)DFA法49(一)DFA法(直接荧光抗体法)

——检测狂犬病毒抗原

免疫荧光技术Ab优点Ag(尤其是不产生细胞病变的病毒安全快速简便敏感性和特异性较高(一)DFA法(直接荧光抗体法)

50荧光抗体的染色方法可分为两类:直接法

—荧光抗体直接与标本内的抗原反应,

优点简便、快捷、有效减少非特异性染色,

只适用于检测细胞内的抗原;间接法

—荧光抗体作为第二抗体,与直接结合胞内抗原的第一抗体反应,

既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体相对直接法操作步骤增多

DFA原理:

抗体蛋白分子

++抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原

荧光素荧光抗体的染色方法可分为两类:51操作:1、材料和仪器2、操作步骤i.印片:

用酒精浸泡载玻片30分钟后取出、吹干,分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上;

ii.固定:吹干后,取冷丙酮(4℃)室温固定7~10分钟;取出吹干,进行步骤3,或置于-70℃冰箱保存;iii.加荧光抗体:将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上(如果从冰箱中取出,则待雾气散掉后再进行此步骤。);

操作:1、材料和仪器52(优选)狂犬病实验室检测技术检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;4PBS制成30%的悬液,离心取上清加1)包涵体颗粒典型,但视野不到10%,或视野大于10%,但抗原分布极-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,++:荧光明亮,且多个视野均有分布;研磨标本→制成悬液(用PBS或MEM,30%)→离心(4℃2000r/min离心20m)→取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞)→吸附(2h)→加维持液→孵育(37℃、5%C02、4~5天)→鉴定1m1,37℃中和1.注:如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑,有必要进行第三次细胞传代。分别取不同部位的脑组织剖面,均匀的涂印在载玻片上;3)33ulRNA液65℃水浴10min(其间准备冰盒或碎冰)观察结果(PBS洗3次,荧光显微镜观察结果)相对直接法操作步骤增多对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;作为DFA检测之外的另一种确证性检测iv.孵育:将抗原片放在湿盒中,37℃温育30分钟;v.洗片:取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,再用PBS振洗2遍,蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;vi.封片镜检:用90%甘油(PBS)封片,加盖玻片,荧光显微镜观察。

搅拌器及染色缸

(优选)狂犬病实验室检测技术iv.孵育:搅拌器及染色缸53结果判断:

仔细观察每个视野的荧光强度,并结合不同视野的荧光分布,作出荧光强度的等级判断:阴性、可疑、+~++++-:无荧光;+/-:极弱的可疑荧光;无荧光“-”

结果判断:仔细观察每个视野的荧光强度,并结合不同视野54+:荧光较弱,但清晰可见;+:荧光较弱,但清晰可见;55++:荧光明亮,且多个视野均有分布;++:荧光明亮,且多个视野均有分布;56+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;荧光强度“+++”荧光强度“++++”+++~++++:荧光闪亮,可见尼基氏小体清晰,且范围广泛;57狂犬病实验室检测技术课件58(二)巢式PCR方法——检测狂犬病毒核酸

传统的PCR检测模式一般需要三个步骤:制备模板:对待测标本进行核酸(DNA或RNA)提取扩增过程:采用PCR或RT-PCR技术对核酸进行变性、退火、延伸扩增;检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。

SampleExtractRNAorDNAPCRElectrophoresisphotograph(二)巢式PCR方法——检测狂犬病毒核酸传统的PCR59巢式PCR(nested-PCR):巢式PCR的原理:是设计两对引物,其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上,通过二次PCR反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物,经过循环扩增后,将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。

优点:特异性、灵敏度均比常规PCR好。缺点:比常规PCR易污染。巢式PCR(nested-PCR):巢式PCR的原理:60巢式PCR方法的操作:

1、RNA提取:Trizol法

(1)以下步骤在P2生物安全柜中进行取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol

先加200μl(研磨均匀)然后加满至1000μl[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]↓-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,室温放置5分钟(此步完可-70℃保存1个月)

巢式PCR方法的操作:1、RNA提取:Trizol61(2)以下步骤可在普通实验室进行

-70℃取出,室温融化→加200μl氯仿,快速颠倒Epp管数次(30秒),使其呈淡粉红色↓室温放置3min↓4℃离心,12000rpm,15min(其间标记新的离心管,每管中加600μl异丙醇)↓取离心后水相600μl,加入新的离心管中,轻柔混匀↓室温放置10min(-20℃放置30分钟效果更佳)↓4℃离心,12000rpm,10min↓

(2)以下步骤可在普通实验室进行62缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,可见少量沉淀↓加1ml75%乙醇(DEPCH2O新鲜配制)洗涤沉淀↓4℃离心12000rpm,10min↓缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,室温干燥数分钟(加入75%乙醇至-70℃可长期贮存1~2年)↓脑组织的沉淀溶于70ulDEPCH2O中(2个EPP管分装)[液体(唾液、尿液等)的沉淀溶于35ulDEPCH2O中]↓直接进行逆转录或-70℃贮存缓缓倒掉上清,用枪头轻轻吸去残存液体,可见少量沉淀63取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,为疫苗免疫力程度的评判指标1ml血清和标准病毒稀释液0.-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,3)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。1、DFA——检测狂犬病毒抗原-70℃过夜或颠倒Epp管30~40次以便充分混匀内容物,在感染后,狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应(针对狂犬病毒)。3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);乳小白鼠接种法——分离病毒对动物标本进行狂犬病毒分离时,必须在P3以上条件的专业实验室中进行。5IU/ml血清,表示能得到有效的保护1m1,37℃中和1.检测过程:通过电泳等方法对PCR产物进行检测。2、荧光灶抑制试验——检测中和抗体尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存照相:凝胶成像仪/紫外透射仪如:狂犬病样本的单克隆抗体分型6)再向反应管中加入1ulpd(N)60.(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法注意事项:

1.操作时一定戴口罩手套,保证离心管枪头无RNA酶2.一次提取核酸,样本数不要太多(10个左右)3.加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确,否则容易降低提取效率4.异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果5.加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔,加液体时贴壁缓流,以免破坏到所提核酸6.尽量缩短RNA在空气及室温的暴露时间,水溶的RNA一定要低温保存7.标本及时放回-20℃或-70℃

取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,注意事项:642、逆转录合成cDNA1)pd(N)6稀释至0.2ug/ul2)水浴预热至65℃(其间标记反应管)3)33ulRNA液65℃水浴10min(其间准备冰盒或碎冰)4)冰浴2min,瞬时离心。5)将液体转移至试剂盒反应管中32ul,先不要混匀。6)再向反应管中加入1ulpd(N)60.2ug/ul或特异引物各0.5ul,使总体积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。7)37℃水浴,60min8)-20℃或-70℃保存cDNA2、逆转录合成cDNA653、巢式PCR:3、巢式PCR:66狂犬病实验室检测技术课件67琼脂糖凝胶电泳

1.电泳槽中注入缓冲液TAE2.将做好的琼脂胶放入电泳槽(加样孔在负极方向)3.Marker加5ul,样品加10ul5.电压:100V6.时间:30min

照相:凝胶成像仪/紫外透射仪琼脂糖凝胶电泳68(三)其它检测方法1、ELISA——检测抗原:包被抗体:用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG

包被96孔酶标板,4℃过夜;

封闭:用含0.3%牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟;加待检标本:将采集到的标本研磨,用pH7.4PBS制成30%的悬液,离心取上清加入酶标板孔内,同时设阴性、阳性对照,200μl/孔,37℃孵育1小时;洗板:洗板四次;加酶标抗体:后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔,37℃l小时;洗板:同上;加底物:加入酶反应底物,室温作用30分钟;终止反应:加2MH2SO4终止反应;观察结果:肉眼观察或酶标仪测定结果。(三)其它检测方法1、ELISA——检测抗原:692、荧光灶抑制试验——检测中和抗体

中和抗体:

为疫苗免疫力程度的评判指标中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清,表示能得到有效的保护快速荧光灶抑制试验(RFFIT):为WHO推荐的检测方法制备细胞悬液(1×10cells/ml的BSR细胞悬液)

稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS株)

中和血清和病毒(0.1ml血清和标准病毒稀释液0.1m1,37℃中和1.5小时)

检测剩余病毒(每孔加入50µl制备好的细胞悬液,37℃、5%C02过夜培养)

固定(弃掉培养液,PBS洗一次,丙酮固定)

荧光抗体检测(干燥后,加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体,37℃30分钟)

观察结果(PBS洗3次,荧光显微镜观察结果)

计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制≥50%的血清最高稀释倍数,即为被检血清的中和抗体滴度)

步骤2、荧光灶抑制试验——检测中和抗体中和抗体:步703、病毒分离A.细胞培养法——分离病毒研磨标本→

制成悬液(用PBS或MEM,30%)→

离心(4℃2000r/min离心20m)→

取上清接种细胞(鼠神经瘤细胞、Vero细胞或BHK21细胞)→

吸附(2h)→

加维持液→

孵育(37℃、5%C02、4~5天)→

鉴定B.乳小白鼠接种法——分离病毒研磨标本

制成悬液→

离心→取上清接种乳鼠脑内(1~2日龄)→饲养→观察发病情况(未发病的鼠保留至21天后作DFA检测)3、病毒分离A.细胞培养法——分离病毒714、ELISA——检测狂犬病毒抗体ELISA方法测定的是总抗体,不代表具有保护性的中和抗体水平其结果仅供参考。5、染色镜检——检测内基氏小体4、ELISA——检测狂犬病毒抗体72(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法1、DFA法——检测狂犬病毒抗原

意义:阳性结果,表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。2、ELISA——检测狂犬病毒抗原

意义:检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法——分离狂犬病毒

意义:阳性结果表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。(四)狂犬病诊断标准(WS281-2008)中的检测方法1、734、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸原理:狂犬病毒为负链RNA病毒,PCR前需要经过逆转录酶作用,合成一条cDNA链(RT),再进行PCR。检测步骤:

1)病毒RNA的提取

2)逆转录合成cDNA3)PCR扩增

4)电泳意义:阳性结果表明有狂犬病毒感染,有确诊意义。4、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸原理:745、狂犬病特异性抗体检测狂犬病特异性抗体:

在自然感染情况下,狂犬病毒→通过带有病毒的动物唾液→进入机体伤口→在入侵部位基本上不增殖(一般也不侵入血流)→故不能形成病毒血症。

在感染后,狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应(针对狂犬病毒)。

晚期,狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。

因此,通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低,只在临床疾病的晚期出现。5、狂犬病特异性抗体检测75A.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)——测定中和抗体意义:中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清,表示能得到有效的保护B.ELISA——检测狂犬病毒抗体意义:

1)接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/ml,表明已获得一定的保护。

2)未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/ml,且近期有4倍增高,可考虑狂犬病。

3)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。A.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)——测定中和抗体76(五)美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法

1、DFA——检测狂犬病毒抗原

当以下情况发生时,需要重复(证实性)检测:

1)包涵体颗粒典型,但视野不到10%,或视野大于10%,但抗原分布极度稀疏(如每个视野中只有1到2个包涵体颗粒);

2)包涵体颗粒典型,但染色强度较弱且缺乏特征性;

3)包涵体颗粒不典型,但染色强度好(如结构大小均匀、形态规则);

4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;

5)两种试剂的检测结果或两个技术人员的结果判定不一致。当进行重复性确证性DFA检测时,通常采用两种以上的检测试剂进行同比实验。(五)美国CDC狂犬病实验室操作手册中的检测方法1、D773)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。8)-20℃或-70℃保存cDNA快速荧光灶抑制试验(RFFIT):为WHO推荐的检测方法1ml血清和标准病毒稀释液0.细胞培养法——分离病毒中和血清和病毒(0.[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]取出后,用缓流冲洗抗原片3~5秒,2ug/ul或特异引物各0.既可检测胞内抗原,也可以检测体液中的特异抗体3.Marker加5ul,样品加10ul工作人员需要暴露前免疫晚期,狂犬病→破坏血脑屏障→大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。4)非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色;取不同位置的少量脑组织(50-100mg)+1000μlTrizol照相:凝胶成像仪/紫外透射仪[液体(唾液、尿液等)取250μl+750μlTrizolLS]蒸馏水振洗1遍,每次2分钟,吹干;积达到33ul,室温1min,混匀,瞬时离心。2、RT-PCR——检测核酸3、细胞培养法——分离病毒:鼠神经瘤细胞(MNA)目的:从未知的脑悬液中分离狂犬病毒,作为DFA检测之外的另一种确证性检测结果解释:

•分离到狂犬病毒,结果为阳性。

•传代2次后分离不到狂犬病毒,结果为阴性。注:如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑,有必要进行第三次细胞传代。3)部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。2、RT784、直接快速免疫组化试验(DRIT)——

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