《生殖细胞工程》课件

《生殖细胞工程》课件1、花药、花粉培养的基本概念及意义2、花药培养程序3、花粉及小孢子培养程序4、花药和花粉培养中雄核发育的途径及影响因素5、单倍体形成的途径6、花粉植物的倍性及染色体加倍第一节花药与花粉培养2Ovary花柱柱头花丝胚珠

子房花瓣萼片34花药是位于花丝顶端的结构,可以算做是器官；花粉是花药里的花粉母细胞(或小孢子母细胞)通过一次减数分裂产生四个花粉粒（也叫小孢子，其中三个退化，另一个再通过一次有丝分裂形成两个精细胞）。油菜成熟花药的结构花粉囊花粉囊壁成熟花粉粒花药裂口花药&花粉51)基本概念

(1)花药培养（antherculture）:指把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上中，以形成花粉胚或花粉愈伤组织进而分化成植株。由于使用的外植体是植株的雄性器官，花药培养属于器官培养的范畴。1964年Guha等首次报道从毛曼陀罗的花药培养获得了单倍体。目前，已有23个科，52个属的250多种高等植物的花药培养获得了成功（胡道芬，1996）。我国的花药培养处于世界前列－－至少有32种谷类作、蔬菜和木本植物的花药培养再生植株由我国学者首先报道，如小麦、玉米、大豆、辣椒、白菜、柑橘等。

1、花药、花粉培养的基本概念及意义花药培养&花粉培养6花粉粒(n)药隔组织(2n)药壁(2n)花丝(2n)拟南芥花药7(2)花粉培养(pollenculture)又叫小孢子培养(microsporeculture):从花药中分离出花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使药粉粒脱分化，进而发育成完整的植株的过程。

花粉的发育期：花粉母细胞－四分体期－小孢子早期、中期和晚期－有丝分裂期和双核花粉期（营养核和生殖核）一般将处于四分体到单核早期的花粉称小孢子；进入单核以后则称为花粉。生殖核再次有丝分裂，形成两个精子在花粉粒中进行，形成三细胞花粉，如白菜、小麦等在花粉管中进行，形成二细胞花粉，如烟草、棉花等892）花药、花粉培养的意义A.缩短育种年限按照常规育种，杂种从F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5-F6代才能得到基因型纯合的后代。用花药或花粉（n）培养，先得到单倍体植株，再进行染色体加倍，即可获得纯合二倍体（2n）。这样，从杂交到纯合株系，只需2个世代，即可缩短3-4个育种世代。10B.提高选择效率F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型也是多种多样的，这为选育种提供了很广泛的变异类型。特别是隐性基因也可以得到充分的表达。因此，将花药花粉培养与常规育种相结合，就能大大提高育种选择的效率。112、花药培养程序外植体的选择材料的表面灭菌接种培养与植物再生生根与移栽121）外植体的选择－直接关系到培养能否成功。－供试材料的遗传背景－供试材料的生理状态多年生植物中，幼年植株比老龄植物的花药诱导频率高；草本植物生长好、处于生殖生长高峰期的花药好，而徒长或营养不良的植物花药较差。

13减数分裂过程图解示意1.细线期2.凝线期3.染色体聚集成“花朵状”4.偶线期5.粗线期6.双线期7.终变期

8-9.中期I10.后期I11.末期I12.二分体(减数分裂间期)13.前期Ⅱ14.中期Ⅱ

15.后期Ⅱ16.末期Ⅱ17.四分体18.幼龄单核花粉粒－花粉的发育时期大多数植物而言，当花粉发育处于单核中期到单核晚期的花药较好。花粉母细胞的减数分裂(引自李扬汉)14花粉发育时期的确定－花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠展开程度之间的关系，判断花粉发育时期。（环境条件）

如:柑橘花冠露白时，大多数花药处于单核晚期；马铃薯花冠露出萼片一半时，大多数花药处于单核晚期；烟草则在花冠露出1/3-1/2时为花药的最佳培养时期。152）材料预处理和灭菌--材料预处理：不同的植物种类、品种和生理状态所要求的预处理不同。预处理方式：高温、低温、离心、预培养预处理的目的：从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分列方式和发育途径。--合适的灭菌方法：经过预处理的材料多采用70％乙醇浸泡花蕾或幼穗1min，然后在饱和漂白粉溶液中浸泡10-15min，无菌水冲洗3-5次即可。163）接种操作：在超净工作台上剥取花药，避免损伤花药，以免刺激花药壁形成愈伤组织。应尽量减少花药在空气中暴露的时间。接种密度：由培养方式而定。固体培养:三角瓶(50-100ml)接种10-20个，培养皿(9cm)接种20-40个；液体培养:每10ml液体培养基接种50个左右。培养基的选择：随植物种类不同而不同。MS、Nitsch、N6－－茄属植物；B5－－芸苔属及豆科植物；B5、N6－－禾谷类植物。174）培养与植株再生培养条件：一般在25-28℃、光照1000-2000Lx、光周期14h的条件下进行培养。植株再生：有两条途径，一是花粉诱导形成胚状体，二是花粉愈伤组织途径。培养3-8周后，可形成肉眼可见的愈伤，当愈伤长到2-3mm时，转移到分化培养基中，约10-20d即可出现芽的分化。185)生根与移栽当花粉植株长到3-5cm高时，转移至壮苗培养基上，促进根系的发育与壮苗。双子叶植物可转移至附加0.1-0.5mg/LIBA的MS培养基，而禾谷类可转移到N6培养基上，可形成大量不定根。193、花粉培养程序取材时期的确定及预处理花粉的分离花粉培养方法材料的灭菌201）取材时期的确定及预处理取材时期的确定:较花药培养的取材时期更早，大多在花粉处于四分体到单核早期。通过镜检观察花粉的发育时期，根据发育时期与花蕾大小、外观形态和颜色等指标的相关关系，选择适宜时期的花蕾。21预处理:预处理可以提高获得再生植株的频率，可采用低温、高温或预培养等方式。一般低温处理是在3-5℃处理3-10天，高温处理则在35℃处理1-3天。为避免花蕾失水，可将花蕾置于装有浸湿滤纸的培养皿中，完成温度预处理。222）花粉的分离

花药有药壁(2n)、药隔(2n)、花粉(n)等，因此，再生植株有可能来自药壁(2n)、药隔(2n)、或起源于多个花粉(n)的嵌合体。如果采用游离花粉粒进行培养，则再生植株一般为同质体。花粉分离的方法：挤压法、自然释放法和器械法。花粉粒(n)药隔组织(2n)药壁(2n)花丝(2n)23过滤（孔径比花粉直径大10µm）加入液体培养基悬浮，100-1000r/m离心1-5min，弃上清。重复2-3次计数确定接种密度，104-105个/mL将花药置于液体培养中或与培养基等渗的蔗糖溶液中，用玻璃棒或注射器内管挤压花药，使其散出花粉特点：简单易行，但可能对花粉有一定的损伤。

（1）挤压法24（2）自然释放法将花药接种于液体培养基中，1-7d后待花药自然开裂，释放出花粉。特点：对花粉无损伤，但分离出花粉数量相对较少。（3）器械法将花药接种于液体培养基中，放入磁棒，在磁力搅拌器上，低速转至花药呈透明状。特点：分离较彻底，但对花粉有不同程度的机械损伤。253）花粉培养方法

看护培养、悬浮培养（微室培养）、液体浅层培养、双层培养（1）看护培养26（2）微室培养27（3）液体浅层培养与双层培养284、花药和花粉培养中雄核发育的途径及影响因素正常条件下营养核生殖核营养细胞萌发形成花粉管进行正常的受精29花药、花粉培养中，花粉的发育可能出现的5种情况：

败育变成肥大花粉花粉发芽经愈伤组织形成不定芽直接分化产生胚状体30败育变成肥大花粉花粉发芽经愈伤组织形成不定芽直接分化产生胚状体离体条件下花粉的发育形态312）影响雄核发育的因素（1）供体植株的基因型基因型是影响花药和花粉培养形成单倍体最重要的因素之一。不同植物属间、种间或品种间均存在很大的差异。茄科、十字花科作物花药和花粉培养较易培养成功。水稻中粳稻比籼稻容易培养，粳稻的花药愈伤诱导率平均可达10％，而籼稻只有1-2％；在31个大豆栽培种中，所有的基因型都产生了愈伤组织，但诱导率的变异范围为％32（2）供体植株的生理状态供体植株的生理状态对花药培养效率有直接的影响（初花期至盛花期较好；花序年龄等）。特别是供体植株所处的环境条件会影响到花药对离体培养的反应，这些环境因子有光照强度、光周期、温度、营养条件等。

33（3）花粉发育的时期选择合适的花粉发育时期是培养成功的关键因素之一。不同基因型，最适宜培养的花粉发育时期有差别，总体上看，以单核早期到单核晚期较为适宜。

烟草花粉发育时期与胚状体诱导频率花粉发育时期胚状体诱导频率％减数分裂期0单核早期14单核晚期40双核早期5.534（4）预处理将花粉或花药从植株上取下来直接培养，往往诱导率很低。而采用低温、高温、离心等预处理，则可以促进花粉细胞的启动，显著提高再生频率。A.低温处理：一般将欲接种的材料置于0-10℃的条件下处理3-10d。低温预处理的作用机理：a.引起花药花粉中内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的正常发育过程（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。b.提高了小孢子的生活力，延缓衰老速度，从而提高诱导率。c.引起小孢子的孤立化，即小孢子从花药中分离出来。因为在低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断了与小孢子之间的联系。35B.热处理：通常在30-35℃处理1-3d。芸苔属中的某些植物，将花芽或完整植株在30℃下处理24h或40℃下处理1h，能够刺激花粉胚胎的发生。马铃薯中也有类似的情况。36（5）培养条件－－培养基成份和环境条件培养基成份无机盐：特别是硝态氮和氨态氮的浓度和比值，是影响花药培养形成愈伤组织的重要因素；如N6培养基(高硝态氮)。碳源：蔗糖是较好的碳源，还起着调节渗透压的重要作用。不同的作物要求的蔗糖浓度不同，早期通常使用5-10％。高浓度（6-12％）对禾谷类作物有利，十字花科芸薹属作物要求13-16％。培养基形态：一般液体培养好于固体培养。37激素：在花药的诱导培养期间，需要有较适宜的细胞分裂素和生长素配比，从而有效地诱导细胞启动分裂。但同时又要控制二倍体细胞的分裂（要求较高浓度的激素）。激素种类及浓度对花药花粉培养起着决定作用，并且因植物不同而不同。生长素类，2,4-D最常用。2,4-D浓度较高时，诱导胚胎发生；浓度较低时，诱导器官形成。除2,4-D外，IAA、NAA也能诱导胚胎发生和器官形成。细胞分裂素类中，KT、BA比较常用。38活性炭：有利于花粉胚状体或愈伤组织的发生，从而提高花粉植物的诱导。在烟草、马铃薯、玉米、小麦的花药培养中，加入％的活性炭可以有效提高花粉植株的数量。环境条件温度：对温度较为敏感。大多数植物而言，25-28的温度下进行花药和花粉培养是适宜的。早期短时间的高温培养能提高某些植物胚和愈伤诱导率。光照：分阶段进行调控。如禾谷类作物，在愈伤诱导阶段以暗培养或弱光培养效果好，而分化培养阶段，光照则有利于绿苗的分化。培养密度：芸薹属和番茄1-10万粒/ml，苹果1-3万粒/ml。39(6)药壁因子小孢子的启动发育对药壁组织有相当大的依赖性。经许多试验已证实，花药壁组织对诱导愈伤和胚状体的形成，甚至绿苗的分化起着重要作用（看护培养）。药壁的作用： 药壁组织组织可以向花粉提供必要的营养物质通过药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质，药壁起着花粉代谢库的作用。405、单倍体形成的途径

不管发育初期花粉细胞通过何种途径发育，其结果均是形成一个细胞团，随后这个细胞团撑破花药壁再继续发育，细胞团继续发育的方式决定了单倍体植株的形成途径。1)通过胚状体的途径形成单倍体植株即细胞团从花药壁中释放出来之后，按照合子胚的途径发育，经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚的发育过程。一个花粉粒只形成一个胚状体，一个胚状体萌发出一个植株。412）通过愈伤组织形成单倍体植株

细胞团保持无序的分裂状态，就会形成多细胞的愈伤组织，愈伤再经过分化形成完整的植株。通过愈伤得到植株的倍性常不只是单倍体，也有二倍体，有时还有多倍体、混倍体等。形成原因：二倍体组织由单个花粉粒形成的细胞团发生融合。42花药培养再生植株形成的途径4344花粉与花药的培养456、花药及花粉植物的倍性及染色体加倍

花粉植株的倍性－－复杂多变，影响因素也多。通过花药、花粉培养获得的植株，常常有单倍体、二倍体、三倍体、四倍体和非整倍体。再生植株的倍性鉴定:可用镜检检查根尖染色体数目，或根据气孔周围保卫细胞的大小以及细胞中叶绿体数目来初步鉴别。46染色体的加倍：秋水仙素处理％)：浸泡、涂抹或滴液法；处理部位因植物种类不同而不同，如双子叶植物多处理生长点、顶芽、腋芽等部位。用秋水仙素处理，可在培养阶段处理，也可在移栽后处理：培养阶段处理，在培养基中加入50-250mg/L秋水仙素。移栽后处理，用0.2%秋水仙素涂抹或浸泡生长点1-3天，或每日傍晚在生长点处点滴数滴，连续进行5-6天。二甲基亚砜(DMSO)(1-2％

)：禾本科则多用含有1-2％DMSO的秋水仙素浸泡分蘖节。47水稻单倍体植株的培育及加倍48愈伤组织加倍法：将单倍体的叶、茎、叶柄、和根等器官切成小块后置于合适的培养基上，诱导形成愈伤组织，经分化培养之后，能得到一定数量染色体加倍的植株。49花粉培养过程（油菜）50花粉培养及发育过程51白菜花粉分化不定芽52第二节植物胚胎培养胚培养胚乳培养胚珠子房培养535455一、胚胎培养我们知道，植物的胚胎是从精卵结合形成合子开始的，合子经过分裂形成胚柄和胚体，胚体进一步分裂和分化，逐渐形成具有一定形态结构的胚。当种子发芽时，胚就长成植株。

第二节植物胚胎培养胚的发育种子的结构56胚胎培养是指采用人工方法把植物的胚胎与母体分离，放在无菌培养基上，让其继续生长发育，一直到形成完整植株的过程。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。57①克服远缘杂种的不育性；②使胚胎发育不完全的植株获得后代；③打破种子的休眠状态，缩短育种年限，提高育种效率；④克服种子生活力低下和自然不育等，对于植物界物种的进化具有重要意义。二、胚胎培养的意义：58三、胚胎培养的类型

胚胎培养的对象，可以是胚胎发育过程中不同阶段的胚体。根据胚胎发育对营养的要求，可分为两个阶段：异养期，处于这一时期的幼小胚胎完全依赖周围组织提供的营养物质。自养期，在此时期，胚胎能吸收培养基中的营养物质，经过自身的代谢作用合成其生长所必需的物质。59培养基:培养条件：糖类、附加成分、光照、培养方式：A.幼胚培养适于液体培养，B.成熟胚适于固体培养

胚胎培养的基本技术601、胚培养胚培养可以分为两大类型：成熟胚培养和幼胚培养胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。611）胚培养的意义(1)在远缘杂交育种中:克服杂种胚不能正常发育；(2)克服珠心胚的干扰,提高育种效率；(3)缩短育种周期；(4)测定休眠种子的萌发率；(5)用于快速繁殖：幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生的途径产生大量的体细胞胚；(6)利用幼胚培养诱发变异，选育新品种；(7)为原生质体培养、细胞融合及遗传转化提供实验材料；(8)理论研究中的应用。62（1）成熟胚培养A.成熟胚是指子叶已经成熟的种胚。培养时只需提供一定的温度和湿度条件就可以萌发并长成植株。B.培养方法：将接近成熟的果实或种子（带表皮）进行表面灭菌后，剥取种胚接种于培养基上，使裸露的胚在人工控制的条件下萌发和生长，直接形成完整的植株。2）胚培养过程：63实例（玉米成熟胚培养）a.取玉米种子，放在95％的酒精中消毒10s，然后用蒸馏水冲洗。检查果皮是否完整，若有水进入果皮中而呈透明斑块的种粒，应丢弃。保留那些果皮完整、外貌无改变的种子。在无菌条件下，将种子放入75％乙醇中消毒15s，用无菌水冲洗3次，用0.1%升汞浸泡10-20分钟，用无菌水冲洗3次；b.把种子放置到有一张湿润的无菌滤纸的培养皿,于25℃的黑暗条件下培育6h,种子将吸水膨胀并变软；64c.胚的剥离：取一粒种子放在无菌培养皿中，用镊子夹住，用另一把镊子轻轻剥去种皮，用解剖刀沿着胚胎的边缘小心切去胚乳，暴露出位于其下方的种胚的一部分，即盾片。分离出胚胎后，用无菌水冲洗3次，然后接种于MS＋0.5mg/l细胞分裂素培养基上；d.于25℃黑暗环境中培养；e.大约2天后出现胚根，3-4天后出现胚芽，7-9天后出生根和生长，并出现一些不定根，10天后即长成小苗。652)幼胚培养幼胚培养：对胚龄处于原胚期（即多细胞原胚）、球形胚、心型胚、鱼雷型胚及早期子叶型胚的胚进行的培养。在这几个时期，幼胚在生理及形态上均还未发育成熟，仅仅提供温度和湿度条件并不能使其萌发成株。高等植物的合子胚发育过程：合子→球状胚→心形胚→鱼雷胚→子叶胚→成熟胚（完整的种子）66671）幼胚培养过程：取子房常规表面消毒解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。固体培养2）幼胚的发育方式：（1）胚性发育；（2）早熟发育；（3）产生愈伤组织683）幼胚培养的方法（1）远缘杂种的幼胚培养A.杂交B.取材C.消毒D.剥取幼胚及接种E.培养F.驯化移栽及染色体的加倍69BACK远缘杂交培育杂种后代（白蓝）子房受精胚胚发育胚败育胚培养种间杂交70A.杂交

根据育种目标，选择亲本，人工授粉（包括：母本去雄、套袋、授粉）切断花柱后在断面进行授粉－百合71B.取材在远缘杂种幼胚败育前，将其从母体取下进行培养。注意：不同的植物幼胚败育的时间往往不相同。C.消毒

由于幼胚包被在子房或种子内，消毒时间可以比其它组织稍长一些。

D.剥取幼胚及接种在超净工作台内，用解剖针或解剖刀将幼胚从液体胚乳中挑出，接种于培养基上。如果幼胚太小，则需要在解剖镜下操作。72E.培养

如果杂种胚败育较晚，胚已经发育得比较大，则往往不进入脱分化就直接发育长成幼苗。此种情况称为“早熟萌发”，小苗的质量往往不佳。如果杂种胚败育较早，胚还相当幼小，就需要在培养基中添加各种激素和丰富的营养物质。根据植物种类和再生途径的不同，添加的物质也有所不同。如果是通过胚状体发生再生植株，一般会使用2,4-D，如果是通过不定芽再分化，则可使用生长素和分裂素。F.驯化移栽与染色体加倍

染色体加倍，如白菜2n=20，甘蓝2n=18，二者杂交杂种为19，不能进行正常减数分裂，必须进行染色体加倍才能产生种子。73Ｆ．应用

利用幼胚培养克服远缘杂种不育性已在许多植物上成功，如西红柿、茄子、辣椒、油菜、南瓜、大豆、花生、水稻、小麦、大麦、大葱、萝卜等与其近缘野生种，白菜×甘蓝，以及百合等花卉。通过“芥菜×甘蓝”的杂种胚培养，育成了“千宝菜1号”和“千宝菜2号”。74白蓝75梨和苹果的杂种植株76(2)非远缘杂交情况下的幼胚培养

用于加快繁殖、诱导胚性愈伤组织及诱发突变等。A.取材：取材时间因植物种类不同而异，一般在开花授粉后12-50天取幼胚。过早，幼胚太小，不容易操作；过晚，幼胚发育太大，不容易脱分化。下图示白蓝作父本时白菜和甘蓝杂种胚的发育时期和胚胎大小的关系。7778B.消毒、剥取幼胚及接种（方法同前）C.培养幼胚培养时，一般通过诱导胚性愈伤组织或胚状体再生植株，因为幼胚比较容易形成胚性愈伤组织或胚状体。可用培养基MS附加适量生长素（如2,4-D），其浓度因植物不同而不同，一般用0.1-2.0mg/L左右。7980如果为了大量增殖，可在胚状体形成之前，将胚性愈伤组织悬浮培养。即将胚性愈伤组织切碎，在含有同样成分的液体培养基中振荡培养，胚性愈伤组织长大后，再切碎培养，可以达到大量增殖的目的。将增殖的胚性愈伤组织转移到固体培养基上后，形成体胚，再生植株。81振荡培养旋转培养82胚乳培养是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。二、胚乳培养831、胚乳培养的意义1）胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。2）胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。84胚乳外植体制备:种子消毒--取出胚乳培养:White或MS诱导培养基--25-27℃--暗或弱光发育:诱导形成愈伤组织--再分化形成胚状体或不定芽--生根培养--植株。2、胚乳培养过程85胚乳培养过程胚乳胚状体发育成苗不定芽苗