卷柏降糖作用的实验研究(精)

卷柏降糖作用的实验研究李玉洁a,郑晓珂b，冯卫生a(河南中医学院a.药学院；b.基础医学院，河南，郑州450008)摘要：目的：研究了不同提取方法对卷柏降糖活性的影响，并进一步探讨了卷柏降糖作用的有效部位。方法：首先，采用HepG2细胞体外细胞筛选方法，观察卷柏醇提物和卷柏水提物两种不同提取方法对 HepG2细胞培养液中葡萄糖消耗量的影响，并用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测HepG2细胞的增殖；同时结合整体动物实验的方法，比较了醇提物和水提物对高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素( STZ)造成的大鼠糖尿病模型的降糖活性，以及对糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影响。进而将卷柏醇提物上聚酰胺柱所得不同部位流份，以HepG2细胞葡萄糖消耗实验作为指标对降糖的有效部位进行了探讨，并采用MTT法检测受试药物对HepG2细胞增殖的影响。结果：体外实验结果显示：醇提物和水提物在一定的浓度范围内均能显著促进 HepG2细胞的葡萄糖消耗，醇提物比水提物作用活性强；整体动物实验结果显示：卷柏醇提物和水提物均能降低糖尿病大鼠的血糖，并能在一定程度升高糖尿病大鼠的葡萄糖耐量，且卷柏醇提物降糖作用明显优于卷柏水提物；卷柏活性部位的的筛选结果显示：卷柏50%EtOH部位能够显著促进培养液中HepG2细胞的葡萄糖消耗，与正常组比较有极显著性差异(P<0.01)，水部位和80%EtOH部位次之，95%EtOH部位作用不明显。结论：细胞实验结合动物实验结果提示醇提物比水提物具有更好的降糖效果；卷柏醇提物上聚酰胺柱所得50%EtOH部位体外降糖活性最高。关键词：卷柏；HepG2细胞；糖尿病大鼠；葡萄糖消耗；血糖AntihyperglycemicactivityofSelaginellaTamariscinaa b aLIYu-jiea，ZHENGXiao-keb，FENGWei-shenga(HenanCollegeofTraditionalChineseMedicinea.SchoolofPharmacy；b.BasicMedicalCollege，zhengzhou450008)ABSTRACT:OBJECTIVE:ToinvestigatethehypoglycemiceffectsofSelaginellaTamariscinaextractedbytwomethods,andtoobservetheactivepartsofofSelaginellatamariscina.METHODS:HereweinvestigatedtheeffectsofSelaginellaTamariscinaextractedbytheEtOHandH2OonglucoseconsumptioninHepG2,andMTTassaywasusedtomonitortheproliferationoftheHepG2cells.Inaddition,thehypoglycemiceffectsoftheEtOHextractandH2Oextractinvivowereevaluatedinstreptozotocin(STZ)andahigh-fatdietinduceddiabeticrats.Serumglucoseandoralglucosetolerancetest(OGTT)wasobservedafterthetreatmentoftheannimals.Furthermore,thedifferentpartsoftotalSelaginellatamariscinaextractedbyEtOHfrompolyamidecolumnonglucoseconsumptioninHepG2wereevaluated,andMTTassaywasusedtomonitortheproliferationoftheHepG2cells.RESULTS:TheresultsinvitroindicatethatboththeEtOHandH2OextractscanincreasetheglucoseconsumptiononHepG2cellswithincertainconcentration,andtheeffectsofEtOHextractwerehigherthanH2Oextract;TheresultsinvivoindicatethatboththeEtOHandH2Oextractscanlowerthefastingbloodglucoselevelsandimproveoralglucosetoleranceondiabeticrats,andtheEtOHextracthadabetterremarkablehypoglycemiceffectsondiabeticrats.TheactivityofdifferentrefactionsweretestedagainstHepG2cells.Andtheresultsshowthatthe50%EtOHportionexhibitsastrongerhypoglycemiceffectthanthewaterportionand80%EtOHportionfrompolyamidecolumninHepG2.Thereweresigniferentdifferencescomparedwithsolventcontrolgroup(P<0.01).95%EtOHportiondidnotsigniferentlyaffecttheglucoseconsumptioninHepG2.CONCLUSION:TheresultssuggestedthattheEtOHextracthadabetterhypoglycemiceffectthantheH2OextractinHepG2cellsanddiabeticrats.The50%EtOHportionfrompolyamidecolumnhadastronghypoglycemicactivityinHepG2.KEYWORDS:SelaginellaTamariscina;HepG2cell;diabeticrats;glucoseconsumption;bloodglucose.卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)为多年生草本植物，为蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物卷柏的全草。早在《本经》中即有记载，注明其性辛平，功能破血散瘀，活血止血，主治腹痛、闭经、癥瘕淋结以及吐血便血尿血等症，将其列为上品。历代名家对其也有论述和研究，对卷柏的功能主治记为活血通经。2005年版中华人民共和国药典将卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)和垫状卷柏(Selaginellapulvinata(HooketGrev.)Maxim.)收载，作为临床规范药材使用[1]。现代药理及临床研究表明卷柏具有防癌治癌、抗炎、抗病毒、镇痛、降血压等作用 [2]。本实验室前期对卷柏化学成分进行了全面系统的研究，从中分离得到大量的黄酮类、木脂素类、核苷类和其他多酚类化合物成分[3-6]。本实验室前期实验在采用去卵巢大鼠模型研究卷柏降血脂作用时，意外发现该模型血脂升高的同时出现了高血糖症状，而卷柏组在降低血脂的同

时还有非常好的降糖作用[7]。文献报道及现代研究表明卷柏亦具有降血糖作用：卷柏对四氧嘧啶和链脲佐菌素高血糖模型鼠具有显著的降血糖作用, 并可较好地恢复其体质[8,9]。为研究卷柏的降糖作用及其物质基础,我们前期主要采用HepG2细胞体外降糖活性筛选模型,对卷柏水提物上D101大孔吸附树脂柱,用不同浓度含水乙醇梯度洗脱,对各部位降糖作用进行了系统的研究,研究发现卷柏50%乙醇部位可能是其降糖活性部位,同时结合HPLC指纹图谱,发现卷柏50%乙醇部位含有大量的卷柏黄酮。同时还发现卷柏乙醇提取物比卷柏水提物黄酮含量高[10]。本实验是在前期实验的基础上,进一步通过体外细胞筛选结合整体动物实验的方法,探讨不同提取方法对卷柏降糖活性的影响,以期优化提取方法,为下一步的新药研发奠定基础。为进一步探讨卷柏降糖成分所在部位,考虑工业化大生产的工艺,本实验选用聚酰胺柱,采用不同浓度含水乙醇梯度洗脱,得卷柏不同部位流份,利用HepG2细胞,建立体外降糖活性筛选模型,从细胞水平上比较卷柏醇提物不同部位降糖作用,以期筛选出卷柏降糖活性部位,为卷柏的有效部位的进一步提取、醇化和分离提供实验依据。1实验材料与仪器实验材料DMEM培养基、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、小牛血清为美国Gibco公司产品；MTT、DMSO为Amresco公司产品；葡萄糖检测试剂盒(葡萄糖氧化酶法)为中生北控生物科技股份有限公司产品；链脲佐菌素,为sigma公司产品；其他各种化学试剂均为市售分析纯。基础饲料为郑州大学实验动物中心提供,高糖高脂饲料配方[11]：10%猪油、20%蔗糖、10%蛋黄、60%基础饲料,由郑州大学动物实验中心加工制成。实验药物卷柏采自河南西峡,经河南中医学院陈随清教授、董诚明教授鉴定为卷柏属植物卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)。卷柏8.98kg70%乙醇回流提取3次,过滤,合并滤液,减压浓缩,真空干燥得卷柏醇提物823.5g(EtOHextract)；卷柏40kg加10倍量水煎煮3次，过滤，合并滤液，减压浓缩，真空干燥得卷柏水提物6.5kg(H2Oextract),卷柏水提物提取由河南中医研究院协助完成。取醇提物350g上聚酰胺柱,依次以水和50%、80%、95%乙醇梯度洗脱,洗脱液减压浓缩、干燥得各洗脱部位，干重分别为100.78、66.34、86.06、33.26g。水部位、50%乙醇部位水溶解，80%、95%部位DMSO溶解，经0.22m微孔滤膜过滤除菌， 4C保存。临用前以DMEM培养基配制成各用药浓度,终浓度DMSO含量小于0.1%。实验仪器倒置显微镜(NIKONECLIPSETS100)；KDC-160HR高速低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；酶标仪(BIO-RADModel680)；超净工作台(江苏苏净集团)；电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)等。细胞和动物SD大鼠80SD大鼠80只，体重实验方法HepG2细胞的培养HepG2实验方法HepG2细胞的培养HepG2细胞复苏后用含10%灭活小牛血清的H-DMEM培养液转入100ml培养瓶中，在

C,5%CO2条件下培养。当细胞贴壁长满后，倾去培养基，用 0.25%胰蛋白酶消化，每3d22.137按1:3比例传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。2.2葡萄糖消耗实验[12,13]将对数生长期的HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基转入96孔板中,细胞贴壁后，更换无血清的DMEM培养液继续孵育12h待细胞适应无血清的环境后再将培养基移出，换上无小牛血清的含药培养基，孵育 36h后，用葡萄糖检测试剂盒检测培养基上清的葡萄糖含

量，以不铺细胞的空白孔为空白对照，计算 36h葡萄糖消耗量（GC），并计算各药物葡萄糖消耗率（GCrate=各剂量组葡萄糖消耗量/正常组葡萄糖消耗量）。2.3MTT实验[14]葡萄糖消耗实验结束后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20讪,37C继续培养4小时，小心吸净培养液，每孔加入150讪DMSO，震荡5~10分钟，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值（A）,以监测细胞的数目与活力，通过计算 GC/MTT可以扣除由于细胞增殖对培养液中葡萄糖消耗的影响。10只做为正常对照组，给予基础饲料4周后，大鼠禁食10只做为正常对照组，给予基础饲料4周后，大鼠禁食12h,高糖高脂饲料（STZ临用前用0.1mol/l柠檬酸-檬酸pH值至4.21，操作均在冰浴中进行）建立糖尿病大鼠模型；正常-柠檬酸钠缓冲液。注射STZ3天后大鼠禁食12h，剪尾取血，3500检测空腹血糖，空腹血糖大于或等于 11.1mmo1/l的动物为造模80只大鼠适应性喂养1周，按体重均衡原则随即抽出喂养；其余70只，给予高糖高脂饲料喂养，自由饮水。组一次性腹腔注射2%链脉佐菌素（STZ）溶液35-柠檬酸钠缓冲液。注射STZ3天后大鼠禁食12h，剪尾取血，3500检测空腹血糖，空腹血糖大于或等于 11.1mmo1/l的动物为造模2.5动物分组和给药方法将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、卷柏醇提物组、卷柏水提物组、二甲双胍组。正常对照组与模型对照组： 每天清晨蒸馏水灌胃； 二甲双胍组：每天清晨以200mg/kg二甲双胍灌胃；卷柏醇提物和卷柏水提物均按临床用药的 20倍换算，卷柏醇提物组：每天清晨 210mg/kg卷柏醇提物灌胃，卷柏水提物组：每天清晨 312mg/kg卷柏水提物灌胃，连续灌胃 3周，灌胃体积均不大于4ml，所有大鼠喂养期间均自由进食饮水。大鼠给药前和给药 3周禁食12h，末次给药后2小时，尾静脉取血，用葡萄糖检测试剂盒测定血糖值。两天后进行口服葡萄糖耐量实验[17]:于检测前大鼠灌胃后禁食，12h后，给各组大鼠灌胃葡萄糖溶液 2g/kg,分别测定，0min、30min,60min,120min的血糖，0min血糖即空腹血糖。2.6统计方法测定的数据经SPSS13.0统计软件系统进行统计学分析，以 X±5表示，组间差异的显著性采用单项方差分析（One-WayANOVA）处理，给药前后血糖比较采用双因素 t检验。3结果3.1卷柏醇提物及卷柏水提物对 HepG2细胞葡萄糖消耗的影响卷柏醇提物在0.7~1.5mg/ml剂量时，均能明显促进HepG2细胞的葡萄糖消耗，与正常对照组比有显著性差异（P<0.01，P<0.05），与二甲双胍组相比没有统计学意义（ P>0.05）;卷柏水提物在0.9~1.5mg/ml剂量时对HepG2细胞葡萄糖消耗有明显的促进作用， 与正常对照组比有显著性差异（P<0.05）（见表1），与二甲双胍组相比没有统计学意义（ P>0.05）。扣除由于细胞增殖对培养液中葡萄糖消耗的影响，用 MTT校正后，卷柏醇提物在0.6、0.7、2.0mg/ml时均可增加培养液中HepG2细胞的葡萄糖消耗， 与正常对照组比有极显著性差异 （P<0.01），在0.7mg/ml时与二甲双胍组相比没有统计学意义（ P>0.05）；卷柏水提物对HepG2细胞的葡萄糖消耗没有明显的促进作用，与正常对照组比没有统计学意义（ P>0.05），与二甲双胍组相比均有显著性差异（P<0.01，P<0.05）（见表2）。Tab1EffectsoftheextractsfromSelaginellaTamariscinaonglucoseconsumptioninHepG2cell.（X Dose(mg/ml)EtOH-extractGC(mmol/l)EtOH-extractGCrateH2O-extractGC(mmol/l)H2O-extractGCrateNormal5.3571±).43394)11.8693±).59184)1controlmetformin8.2057±).56872)1.533.9976±).40302)2.14hydrochloride

-4 (104mol/L)0.14.9903±0.19514)0.931.6104±0.79314)0.860.26.3228+1.14411.181.5753±0.85294)0.840.35.4057±0.75154)1.011.0763±0.76984)0.580.46.0531±0.37244)1.131.5052±0.70844)0.800.55.7132+0.90901.071.9503±0.66834)1.040.66.3768+0.65681.191.7965±0.56974)0.960.77.2588+).3347)1.351.8855±0.94094)1.010.86.8785+12576)1.282.0393±0.67024)1.090.97.6877±1.79221)1.432.3468±0.44151)1.721.07.7120±).34602)1.443.2208±1.08431)1.671.57.7363±0.44972)1.443.1317±0.83341)1.592.06.1016±0.48554)1.142.9780±1.09234)1.03与 〔丿表示PV0.05,2）表示P<0.01;与二甲双胍组比较,1Tab2EffectsoftheextractsfromSelaginellaTamariscinaonHepG2cellproliferationactivity.(X±0DoseEtOH-extractEtOH-extractH2O-extractH2O-extract(mg/ml)MTTGC/MTTMTTGC/MTTNormal0.81275+0.01692.300013+0.364control0.5593+0.01149.5777+0.38794)280694)metforminhydrochloride(10'4mol/L)0.5783+0.050114.1885±).49172)0.7788+0.05375.1334+0.2580)0.10.56+0.09248.9112+0.20124)0.695+0.0222.4798+0.7752)0.20.5613+0.014611.2639+1.176L0.6353+0.07851.5475±0.55344)0.30.495+0.028310.9206+D.75914)0.6955+0.00992.1464+0.50514)0.40.5393+).054211.2232+D.34524)0.7013+0.00742.7527+0.4716)0.50.554+0.067210.3126+0.82044)0.7085+0.01272.9892+0.4739)0.60.5207+).045112.2473+0.63O72)0.601+0.06942.4842+0.6190)0.70.5663+).014312.8172±).29552)0.759+0.06572.2226+0.36500.80.7187+).03949.5712+0.17924)0.9175+0.01112.7472±0.25844)0.90.7967±^.02021)9.64988+1.12484)0.8543+0.01823.5697+0.6000)1.00.7517+).039410.2598+0.23014)0.9023+0.02263.0840+0.410单1.50.7797+).03159.9225+0.28834)1.0155+0.0204)3.2662+0.599J)2.00.5123+).01630.9118+0.02002.4436+0.1600)3.2卷柏醇提物及卷柏水提物对糖尿病大鼠模型血糖的影响注射STZ72小时后，糖尿病模型组大鼠血糖明显升高，与正常组比有极显著性差异（P<0.01），其高血糖水平可维持3周以上。二甲双胍灌胃 3周后，空腹血糖明显降低，与模型组比有极显著性差异（P<0.01），与治疗前比有极显著性差异（ P<0.01），与正常组比无差异（P>0.05）。卷柏醇提物和卷柏水提物给药 3周后，均在不同程度上改善了糖尿病大鼠的高血糖症状，同模型组比有极显著性差异（ P<0.01），与治疗前比有极显著性差异（P<0.01）,但其空腹血糖仍明显高于正常组（P<0.05或0.01）；且与卷柏水提物相比，卷柏醇提物降糖效果明显优于卷柏水提物（P<0.05）（见表3）。与正常对照组比较，1）表示Pv0.05,2）表示P<0.01;与二甲双胍组比较，3）表示PV0.05;4）表示P<0.01Tab3Effectsof3-weektreatmentwiththeextractsofSelaginellaTamariscinaonglucoselevelsindiabeticrats(n=10).(xis)GroupBloodglucose(mmol/l)0days21daysNormalcontrol6.020.925.90.844)Diabeticcontrol16.88±492)22.66土.272)6)metforminhydrochloride16.86±40，8.583.31))EtOH-extract17.29±302)10.003.431)4)6)H2O-extract16.65±592)13.392.872)6)7)注：与同一时间点正常组比较: ［丿表示PV0.05,2）表示PV0.01;与同一时间点模型组比较: 3）表示Pv0.05,4）表示PV0.01;与治疗前（注射STZ后72小时）比较：5）表示P<0.05,6）表示P<0.01;卷柏水提物与卷柏醇提物比较7）表示P<0.05,8）表示P<0.01。3.3卷柏醇提物与卷柏水提物对糖尿病模型大鼠葡萄糖耐量的影响表4结果显示，糖尿病模型组大鼠灌糖水后血糖升高， 60min时达最大值，然后随时间血糖呈下降趋势，各时间点血糖与正常组比均有极显著性差异 （P<0.01），灌糖水后120min血糖比0min血糖升高约32.9%;二甲双胍组大鼠灌糖水后各时间点血糖比模型组明显降低 （P<0.01）,120min血糖基本恢复空腹血糖水平；卷柏醇提物组大鼠灌糖水后 0~60min时血糖变化不明显，与模型组相比无统计学意义（P>0.05），但120min时，血糖明显下降，与模型组相比差异极显著 （P<0.01）.卷柏水提物组0~30min时，血糖下降，与模型组相比差异显著（ P<0.05），但60,120min时，血糖变化不明显，与模型组相比无统计学意义（ P>0.05）。卷柏醇提物和水提物对糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影响均不及二甲双胍组，与其相比均有极显著性差异（ P<0.01）。Tab4EffectsoftheextractsfromSelaginellaTamariscinaonglucosetoleraneeindiabeticrats（n=10）.（xis） （mmol/l）Group0min30min60min120minNormalcontrol6.531曲6）6.940.284)6)8.770.774)6)7.15:0.394)6)Diabeticcontrol20.00±612)24.53±462)6)32.06±.722)6)25.882.762)6)metforminhydrochloride18.670;692)20.492;782)4)26.714.242)4)17.925.712)4)EtOH-extract18.49±152)22.64±172)6)31.49土.112)6)21.882.382)4)6)H2O-extract18.0021.99曲)3)6)31.652.532)6)26.782.212)6)注：与同一时间点正常组比较：1）表示P<0.05,2）表示PV0.01;与同一时间点模型组比较：3）表示PV0.05,4）表示Pv0.01;与同一时间点二甲双胍组比较 5）表示Pv0.05,6）表示PV0.01。3.4卷柏醇提物上聚酰胺柱所得各部位对 HepG2细胞葡萄糖消耗的影响体内实验和体外实验提示：卷柏醇提物具有很好的降糖活性，为进一步探讨卷柏降糖成分所在部位，本实验选用聚酰胺柱，采用不同浓度含水乙醇梯度洗脱，分别得到水、 50%EtOH、80%EtOH、95%EtOH部位，并以HepG2细胞葡萄糖消耗实验作为指标对降糖的有效部位进行了筛选。表5结果显示：卷柏水部位在 0.4、0.6、0.9、1.0mg/ml剂量时不同程度促进HepG2细胞葡萄糖的消耗，与正常对照组相比有极显著差异（ P<0.01），0.4mg/ml剂量时作用最强。但各剂量作用均不及二甲双胍组，与其相比均有极显著性差异（ P<0.01）;50%乙醇部位在0.05~0.7mg/ml浓度范围内不同程度促进 HepG2细胞葡萄糖的消耗，并呈一定的剂量依赖性，与正常对照组相比有显著差异（ P<0.05，P<0.01），在0.4mg/ml剂量时作用最强。在0.3、0.4、0.5、0.7mg/ml齐U量时，与二甲双胍作用相当，与其相比没有显著性差异（P>0.05）;80%乙醇部位在0.1~1.0mg/ml浓度范围内不同程度促进 HepG2细胞葡萄糖的消耗，与正

常对照组比有极显著差异(P<0.05,P<0.01)，并呈一定的剂量依赖性，在1.0mg/ml剂量时作用最强。在0.4~1.0mg/ml浓度范围内与二甲双胍作用相当，与其相比没有显著性差异(P>0.05);95%乙醇部位作用不明显，仅在 0.6mg/ml剂量时有作用，与正常对照组相比有显著差异(P<0.05)。与二甲双胍组相比，各剂量组均有极显著性差异( P<0.01)。Tab5EffectsofthedifferentpartsofEtOH-extractfrompolyamidecolumnonglucoseconsumptioninHepG2(xis)Dose(mg/ml)WaterportionGC(mmol/l)waterportionGCrate50%-EtOHGC(mmol/l)50%-EtOHGCrate80%-EtOHGC(mmol/l)80%-EtOHGCrate95%-EtOHGC(mmol/l)95%-EtOHGCrateNormal3.90330.76012.64000;9414.7400±1d3.18750;79dcontrol54)864)406)1854)1metforminhydrochloride8.2625±0472.126.64250;898.44750;66.31000;55(10-4mol/l)22)732)2.524402)1.78522)1.980.0012.20750;93-----104)0.84-0.012.4900±30--984)0.94-0.053.80500;49--241)4)1.44■■■-0.14.16670.2825.27500;217.13000;83.75000;4794)1.07382)3)2.001552)3)1.50514)1.180.24.00750.4015.37500;096.1075±13.79670;5794)1.03402)3)2.041)4)5421)1.29734)1.190.34.92750.9567.26250;556.69250;82.81000;2954)1.26782)2.750572)4)1.41054)0.880.46.48000.3977.47000;398.0600 0;83.01750;6822)4)1.66252)2.83216)1.70504)0.950.55.04670.8076.23000;587.70250;33.73330;2204)1.29132)2.36853)1.6355)1.170.65.82750.6105.25250;697.80750;54.3225±0722)4)1.49082)3)1.995542)1.65701)4)1.360.74.80750.5216.0275±178.86750;53.04000;5244)1.23622)2.281382)1.87224)0.950.84.87250.4629.34750;42.69670;4694)1.25--3902)1.97314)0.850.95.46250.9218.94250;62.98000;4732)4)1.40--8312)1.89124)0.931.05.34750.5899.46000;73.14000;6332)4)1.37--1592)2.00424)0.99与正常对照组比较，1)表示Pv0.05,2)表示P<0.01;与二甲双胍组比较，3)表示PV0.05;4)表示P<0.01表6结果显示：卷柏50%乙醇、80%乙醇和 95%乙醇部位分别在 0.05~0.5mg/ml、0.3~1.0mg/ml、0.8~1.0mg/ml浓度范围内对HepG2细胞的增殖有促进作用，与正常对照组相比有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。另外卷柏水和 50%乙醇部位分别在 0.6~1.0mg/ml和0.6~0.7mg/ml浓度范围内对 HepG2细胞的增殖有抑制作用，与正常对照组相比有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。Tab6EffectsofthedifferentpartsofEtOH-extractfrompolyamidecolumnonHepG2cellproliferationactivity(xis)

Dose(mg/ml)waterportionMTT50%-EtOHMTT80%-EtOHMTT95%-EtOHMTTNormalcontrol0.5475±).02750.5250±).05920.6425±).02870.5200+0.0455metforminhydrochloride(10-4mol/L)0.5500±).03560.5425±).03100.5950±).02380.4800±).02160.0010.5775±).02631)0.01-0.5725±).0359--0.05-0.6225^0.055$)4)--0.10.6075±).04271)3)O.6625±).O25C2)4)0.6050±).05320.5100±)0.20.6350±).1109O.6125±O.O2872)4)O.6675±).O45C3)0.5250+0.01290.30.5850±).0592O.61OO±).O2832)3)0.7100±).04551)4)0.5100±).03370.40.6150±).0520O.6225±).O1712)4)O.7525±).O4272)4)0.4825±).01710.5O.5767±).O2523)O.65OO±).O356')4O.665O±).O42C3)0.5150±).03420.6O.4425±).O4862)4)0.4575±).0290)4)O.6725±).O2753)0.5350+0.03000.7O.385O±).O4O42)4)O.425O±).O289')4)O.74OO±).O2452)4)0.5250+0.07330.8O.3O75±).O2222)4)-O.7275±).O4792)4)0.5950±).02381)4)0.9O.275O±).O4O42)4)-0.7100±).00821)4)0.6500+0.095住4)1.0O.3O5O±).O42O2)4)-0.7050±).07331)4)0.6625±).071卑4)表7结果显示：扣除由于细胞增殖对培养液中匍萄糖消耗的影响，用 MTT校正后。卷柏水、50%乙醇、80%乙醇部位分别在0.4~1.0mg/ml、0.05~0.7mg/ml、0.1~1.0mg/ml浓度范围内不同程度地促进HepG2细胞葡萄糖的消耗，并呈一定的剂量依赖性，与正常对照组相比有显著差异（P<0.05，P<0.01）。卷柏水、50%乙醇、80%乙醇部位分别在0.6、0.8mg/ml剂量，0.3、0.4、0.7mg/ml剂量，0.8~1.0mg/ml剂量时与二甲双胍组相比没有统计学意义（ P>0.05）,另外卷柏水、50%乙醇部位分别在0.7、0.9、1.0mg/ml剂量，0.7mg/ml剂量时葡萄糖消耗量高于二甲双胍组，与二甲双胍组相比有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。95%乙醇部位仅在0.6mg/ml剂量时有作用，与正常对照组相比有显著差异（ P<0.05），各剂量组作用均不及二甲双胍组，与二甲双胍组相比均有极显著差异（ P<0.01）。Tab7EffectsofthedifferentpartsofEtOH-extractfrompolyamidecolumnonglucoseconsumptioninHepG2aftercorrectedbyMTT（X±）与正常对照组比较,卩表示PvO.O5,2）表示P<0.01;与二甲双胍组比较,3）表示P<0.05;4）表示P<0.01Dose(mg/ml)waterportionGC/MTT50%-EtOHGC/MTT80%-EtOHGC/MTT95%-EtOHGC/MTTNormalcontrol7.O733±1.46844)4.9563±1.48764)7.3586±.61OO4)6.O725±1.O2564)metforminhydrochloride(10-4mol/L)15.O225±1.64242)12.2115±1.17382)14.189O±).71862)13.1575±1.21112)0.001-4.5576±).49354)--0.014.2720±1.89884)0.05-6.1387±0.88614)--0.16.8467±1.00133)4)7.9741±).51172)4)11.8643+1.71911)7.3529±0.93154)0.26.4675±1.33674)8.7888±).41352)4)9.1007±1.09311)7.2559±1.10484)0.38.4325±1.40634)11.9068±).72612)9.4247±).94712)5.4719±0.32894)0.410.5800±0.932矽4)11.9953±).37262)10.7186±1.02532)6.2295±1.25484)0.58.7267±1.12884)9.5878±).75962)4)11.6033±).65552)7.4866±0.74934)0.68.1378±2.32471)13.1825±).38052)11.5313±1.87692)11.6127±).74202)4)0.712.5600±1.47872)3)14.1361±2.34682)3)11.9902±).74462)5.7998±0.73064)0.815.9725i2.51272)-12.8810±).88212)4.6214±0.78314)0.919.8600±1.94172)4)-12.6034±.08962)4.7063±1.31554)1.017.6500±1.735矽3)12.7603±.75232)4.7679±0.97354)与正常对照组比较, 1）表示PV0.05,2）表示PV0.01;与二甲双胍组比较,3）表示P<0.05;4）表示P<0.014讨论HepG2细胞是一种与人肝细胞表型极为相似的肝胚胎瘤细胞株 [18]，它能够表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子的代谢反应[19]，另外，HepG2细胞葡萄糖消耗模型利用多靶点和胞内多条信号通路的同时激活，能全面模拟肝细胞对周围环境中葡萄糖的摄入和消耗，肝脏是体内物质代谢的中心，在糖代谢中自然也起着枢纽作用。因此，我们采用 HepG2细胞探讨不同提取方法对卷柏降糖活性的影响，以期筛选出卷柏降糖作用最佳的提取工艺。MTT法是检测细胞数及活力的综合性指标， MTT数值的高低主要代表细胞数的多寡，因此可以通过MTT法观察细胞增殖的情况，计算 GC/MTT的比值可扣除细胞增殖的作用对培养液中葡萄糖消耗的影响，实验结果显示：在高糖环境中，卷柏醇提物和水提物均可明显促进HepG2细胞葡萄糖的消耗，用 MTT校正后，卷柏醇提物在0.7~2.0mg/ml浓度范围内能明显促进HepG2细胞葡萄糖的消耗；卷柏水提物对培养液中肝细胞的葡萄糖消耗量无明显影响， 这一结果提示卷柏醇提物可能比卷柏水提物具有更好的降糖活性。为进一步探讨卷柏不同溶剂提取物对整体动物血糖的影响，本实验室又采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素复制的糖尿病动物模型，通过体外实验结合体内实验，来探讨卷柏降糖作用。用此种方法制造的糖尿病动物模型与人类 2型糖尿病发病机理相似，常用于糖尿病的研究及治疗糖尿病药物的筛选。实验结果显示糖尿病模型组大鼠注射 STZ72小时后血糖明显升高，与正常对照组相比有极显著性差异，达到糖尿病模型标准，且高血糖状态可维持 3周以上。卷柏醇提物与卷柏水提物给药3周分别将血糖降低55.9%和40.9%。此结果提示卷柏卷柏醇提物和卷柏水提物均具有很好的降糖效果，并且卷柏醇提物可能比卷柏水提物具有更好降糖效果，这一实验结果与体外筛选的结果一致。葡萄糖耐量实验是检测机体血糖调节的一种方法，用以了解人体对进食葡萄糖后的血糖调节能力，正常人给予一定量葡萄糖后，血糖浓度暂时升高，机体刺激胰岛素分泌，促使合成糖原，储存能量，在两个小时内，血糖将会降至空腹水平。葡萄糖耐量实验结果显示：卷柏醇提[19][19]物与卷柏水提物对糖尿病大鼠服糖后血糖降低的作用时间不同，可能与实验误差及大鼠的个体差异有关，另一方面，卷柏不同提取物对灌糖水后各时间点降糖作用均不及二甲双胍，可能与中药起效慢，作用缓和有关，还需我们进一步的验证和探讨。体内实验和体外实验提示：卷柏醇提物具有很好的降糖活性，因此我们进一步对其进行活性追踪，结果显示50%乙醇部位的降糖活性最佳。数据显示水部位在显增加HepG2细胞葡萄糖消耗，作用甚至优于二甲双胍，但其在HepG2细胞增殖有明显的抑制作用，因此导致GC/MTT值升高，细胞毒作用。50%乙醇部位在0.1~0.5mg/ml浓度范围能明显增加一浓度范围对HepG2细胞增殖没有明显的抑制作用，甚至有促进增殖的作用，乙醇部位降糖作用最明显，其明确的作用成分还需进一步的追踪、分离和鉴定。0.7、0.9、1.0剂量时能明0.6~1.0mg/ml浓度范围对这说明其在高浓度下有一定的HepG2细胞葡萄糖消耗，在这这一结果提示50%REFERENCES[1][2][3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18]Ch.P(2005)VolI(中国药典2005年版.一部)[S].2005:157.ChenK,PlumbaGWf,BennettaRN,BaoY.Antioxidantactivitiesofextractsfromfiveanti-viralmedicinalplants[J].JEthnopharmacol2005,96:201-205ZHENGXK,SHISP,BIYF,etal.TheisolationandidentificationofanewllignanosidefromSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ActaPharmSin(药学学报),2004,39(9):719-721ZHENGXK,BIYF,FENGWS,etal.StudyonthechemicalconstituentsofSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ActaPharmSin(药学学报),2004,39(4):266-268ZHENGXK,LiJ,FENGWS,etal.StudiesontheFlavonesandFlavonoidsfromSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ChinTraditandHerbalDrugs(中草药),2004,35(7):742-743BIYF,ZHENGXK,FENGWS,IsolationandstructuralidentificationofchemicalconstituentsfromSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].ActaPharmSin(药学学报),2004,39(1):41-45.LvPF.ExperimentstudyofestrogenicactivitiesofChineseherbalmedicineandtheresearchofchemicalconstituentfromBeoahygrometrica(Bge.)R.Br[D].Henan:Univ.ofTCM,2006.(河南中医学院硕士毕业论文)，YULP,ZHANGX,WANGYZ.EffectofSelaginellaLamariscineSpringonFFRInsulinSensitivity[J].ChinTraditPatMed(中成药),2001,23(4):291-292MiaoN,TaoH,TongC,XuanH,ZhamgG.TheSelaginellatamariscina(Beauv.)Sp