选3基因工程 第一节课件

专题1基因工程

1.什么叫基因？思考讨论？3.遗传信息是如何表达的？

2.基因、DNA、染色体之间是怎样的关系？非编码区非编码区编码区编码区下游编码区上游

RNA聚合酶结合位点调控遗传信息的表达基因的结构（原核细胞）

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。编码区非编码区非编码区与RNA聚酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA

。内含子:外显子:真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。不能编码蛋白质的序列：包括非编码区和内含子基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术，是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞内，定向的改造生物的遗传性状。一、基因工程的定义：理论基础：基本原理：1.不同生物的基因结构上具有一定的相似性：（1）基因的基本单位相同（2）具有相同的碱基互补配对原则（3）都是双螺旋结构2.不同生物共用一套密码子。基因重组基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平剪切→重组（拼接）→导入→表达人类需要的基因产物

3.作用结果：切割DNA分子产生两种类型的末端----黏性末端和平末端2.作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶能够识别的序列均为6个核苷酸（个别4、5、8）1.来源：这类酶主要来自于原核生物（分离纯化），如：大肠杆菌细胞内可分离出EcoRI限制酶，目前已从近300种微生物分离出约4000种限制酶（一）“分子手术刀”-----限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

T1234512345

ADNA连接酶——“分子缝合针”DNA分子的切割和连接E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶（二）DNA连接酶——“分子缝合针”区别：E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接T4DNA连接酶既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低DNA连接酶——“分子缝合针”“分子缝合针”－－DNA连接酶种类来源功能EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体只能连接黏性末端形成磷酸二酯键既能连接黏性末端也能连接平末端形成磷酸二酯键DNA连接酶和DNA聚合酶的区别DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。

DNA聚合酶是在单个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。大肠杆菌的质粒：

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，常含有抗药基因（标记基因）。质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。基因工程的基本操作程序(P8)1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建

3.将目的基因导入受体细胞

4.目的基因的检测与鉴定三、基因工程的基本操作程序（3）提取办法：（2）基因文库的种类：（1）基因文库：1.从基因文库中获取目的基因目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。（一）目的基因的获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因组文库（含有一种生物所有的基因）和部分基因文库（如cDNA）含有一中生物的一部分基因根据目的基因的有关信息（基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因翻译产物蛋白质等特性）（2）构建cDNA文库反转录法：

用某种生物发育的某个时期的mRNA为模板，反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在受体菌群中，该受体菌群体叫这种生物的cDNA文库。mRNA单链DNAcDNA反转录合成文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列中的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分可以2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR是聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）原理：DNA双链复制的原理。（3）利用PCR技术获取目的基因的前提：是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。（4）PCR的反应步骤

PCR一般经历三十多次重复循环，每次循环可以分为三个基本步骤──高温变性（90℃-95℃）、低温复性（55℃-60℃）和适温延伸（70℃-75℃）①高温变性（90℃-95℃）

（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解链为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备.（5）循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性(90-95℃)②低温复性（55℃-60℃）（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到55-600C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。PCR扩增仪靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列结合(55-60℃)③适温延伸（70℃-75℃）

DNA模板——引物结合在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则，合成一条新的DNA链.靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸(70-75℃)靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后靶序列扩增的数量PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增;①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸;3、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成条件：基因比较小核苷酸序列已知

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成小结目的基因的获取

1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、通过化学方法人工合成:(1)反转录法(2)氨基酸----mRNA----脱氧核苷酸序列（推测）----化学合成(3)通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成（条件）（二）基因表达载体的构建

─基因工程的核心2.结构组成：3.启动子：4.终止子：5.标记基因：1.目的：（二）基因表达载体的构建

─基因工程的核心使目的基因在受体细胞中中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子、目的基因、终止子、标记基因等位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录的开始。位于基因的尾端，控制转录的结束。作用是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因。（三）将目的基因导入受体细胞转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。1.将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法：a.农杆菌的感染对象：可感染双子叶植物、裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。b.感染原理：农杆菌具有趋化性：植物体受损时，会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。方法：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等。c.过程：2.基因枪法：3.花粉管通道法：2.将目的基因导入动物细胞--显微注射法

（1）显微注射法是最常用、最有效的方法（2）操作程序：①提纯目的基因的表达载体，保持DNA的浓度为1-3μg/ml②取卵，体内或体外受精，采用显微注射仪把基因的表达载体注射进入受精卵③移植受精卵到雌性动物的输卵管或子宫内，发育为具有新性状的动物3.将目的基因导入微生物细胞（1）原核细胞的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。（2）转化过程：以大肠杆菌作为受体细胞的应用最广泛，其最常用转化方法是：①用Ca2+处理大肠杆菌细胞成为感受态细胞──能吸收周围环境中的DNA分子②将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。（四）目的基因的检测与鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传性状，只有通过检测与鉴定才能知道。这是检查基因工程是否成功的一步。分子水平的检测个体生物学水平的鉴定首先，要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术（基因探针）其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测方法是采用分子杂交技术（基因探针）最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测方法是进行抗原---抗体杂交分子水平的检测个体生物学水平的鉴定：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物获取目的基因基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定小结1）以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现