第四章 荧光分析法 现代食品检测技术 教学课件

第四章荧光分析法第四章荧光分析法1第一节概述一、分子发光某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射。二、分子发光类型1、按激发模式①光致发光：分子因吸收外来辐射的光子能量而被激发所产生的发光现象。②化学发光：分子的激发能量是由反应的化学能量提供的发光现象。第一节概述一、分子发光2③生物发光：分子的激发能量是由生物体释放出来的能量所提供所产生的发光现象。2、按分子激发态的类型来划分①荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。②磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。③生物发光：分子的激发能量是由生物体释放3

第二节分子荧光分析法及其基本原理

一、荧光与磷光的产生过程

1.分子能级与跃迁在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；

第二节分子荧光分析法及其基本原理

一、荧光与磷42.电子激发态的多重态

平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；2.电子激发态的多重态平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则53.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；3.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定6（1）无辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。10-12s。内转换：同多重态电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。10-11s～10-13s通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。（1）无辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换7外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或猝灭。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。10-2s～10-6s改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生8（2）辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为

‘2的荧光。10-7～10-9s发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

‘2>

2>

1

；延迟荧光：分子跃迁至T1态后，因相互碰撞或通过激活作用又回到S1态，经振动驰豫到S1态的最低振动能级再发射荧光。（2）辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振9磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：S0→T1禁阻跃迁S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动10（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光激发光的能量不足，将电子激发至基态中较高的振动能级，假如电子在受激后能量没有损失，并且在瞬时返回原来的能级，于是便在各个不同的方向发射和激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。②拉曼光被激发到基态中其它较高振动能级的电子，当它返回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着产生波长略长或略短于激发光波长的拉曼散射光。（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光11S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸发发系间跨越内转换振动弛豫能l2l1l12二、分子荧光分析的基本原理1、激发光谱与荧光(磷光)光谱（1）.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。二、分子荧光分析的基本原理1、激发光谱与荧光(磷光)光谱13（2）.荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。（2）.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选14第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件15（3）.激发光谱与发射光谱的关系

①.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长（λem）比激发光谱的波长（λex）长，振动弛豫消耗了能量。

②.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。

（3）.激发光谱与发射光谱的关系①.Stokes位16第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件17③.镜像规则

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

③.镜像规则基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各18200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光发192、荧光强度及其与浓度的关系（1）量子产率及影响因素表示物质发射荧光的能力。

=发射的光子数/吸收的光子数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。由于激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁，因而荧光量子产率也可表示为：

=kf/(kf+∑K)kf：辐射跃迁速率，∑K：非辐射跃迁速率2、荧光强度及其与浓度的关系（1）量子产率及影响因素20（2）荧光强度与浓度的关系

①在稀溶液中（bc＜0.05)，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

If

=2.3I0

bc荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。在一定条件下：If

=Kc

②在浓溶液中，荧光强度常常随溶液浓度增加而下降a因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大降低；b.溶质与溶质间的相互作用产生荧光物质的激发态分子与基态分子形成复合物；

c自吸收。

（2）荧光强度与浓度的关系①在稀溶液中（bc＜0.05)213.荧光与分子结构的关系（1）分子产生荧光必须具备两个条件：a.具有合适的结构；b.具有一定的荧光量子产率。（2）化合物的结构与荧光①共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。a芳环越大,荧光峰越移向长波方向b同一共轭环数的芳族化合物,线性环结构者荧光波长比非线性者要强。

3.荧光与分子结构的关系（1）分子产生荧光必须具备两个条件22②刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。a试剂本身有刚性平面结构②刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故23b形成络合物后,形成刚性平面滂铬兰黑R（BBR）无荧光，它与铝形成螯合物有荧光。

b形成络合物后,形成刚性平面24c取代基之间形成氢键加强了分子刚性结构和增强荧光强度。d异构体的影响顺式和反式同分异构体具有不同的荧光强度。c取代基之间形成氢键加强了分子刚性结构和增强荧光强度。25③取代基效应芳环上有供电基，使荧光增强。a给电子基团常使荧光增强;取代基对苯荧光的影响(乙醇溶液)化合物分子式荧光波长(nm)荧光相对强度

苯C6H6270—31010苯酚C6H5OH285—36518苯胺C6H5NH2310—40520苯基氰C6H5CN280—39020苯甲醚C6H5OCH3285—34520

③取代基效应芳环上有供电基，使荧光增强。化合物26b吸电子基团会减弱甚至破坏荧光;c邻位、对位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。d重原子引入体系，荧光强度都很弱，而磷光强度相应增强。e与π电子体系作用小的取代基,影响小。b吸电子基团会减弱甚至破坏荧光;27④跃迁类型

*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。④跃迁类型*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率28第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件294、影响荧光强度的主要因素（1）荧光猝灭①自猝灭a.荧光辐射的自吸收；b.荧光物质的激发态分子M*与基态分子M形成激发态的二聚体（M*M）；c.基态的荧光物质分子的缔合。②电荷转移猝灭激发态分子比基态具有更强的与其他物质发生氧化还原反应的能力，从而导致荧光猝灭。

4、影响荧光强度的主要因素（1）荧光猝灭30③转入三重态猝灭发生S1→T1间的系间窜跃，把多余的能量消耗于碰撞之中使荧光猝灭。（2）温度、酸度和溶剂的影响①温度随着溶液温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。②酸度对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。③转入三重态猝灭发生S1→T1间的系间窜跃，把多余的能量31③溶剂除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。（3）表面活性剂的影响①增溶②增敏a提高荧光量子产率;b提高ε。③

增稳③溶剂除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配32第三节：荧光分析仪器

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。

基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。第三节：荧光分析仪器测量荧光的仪器主要由四个部分组成33仪

器

光

路

图仪

器

光

路

图34一、基本装置及主要构件1、激发光源（1）条件①足够的强度②紫外，可见区域有连续的光谱③强度与波长无关④光强稳定（2）激发光源①氙灯（高压）:250～800nm光谱区呈连续光谱，氙灯使用寿命大约为2000h。②汞灯（高压）:在紫外区激发，365nm，使用寿命1500～3000小时。一、基本装置及主要构件1、激发光源352、单色器①光栅单色器有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱，主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可用前置滤光片加以消除。②滤光片滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有广泛的应用。3、样品池石英方形池，四面都透光。

4、狭缝狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。2、单色器①光栅单色器365、检测器①光电倍增管：灵敏度高，线路简单。②光电摄像管：具有检测效率高，动态范围宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。6、读出装置记录仪、阴极示波器和显示器。二、常用的一些荧光分光计1、YF—1型荧光分光计手控式荧光分光计2、YF—2型荧光分光计自动记录式3、微机化荧光分光计970CRT型荧光分光光度计；日立F—2500RF—5405、检测器①光电倍增管：灵敏度高，线路简单。37磷光检测

荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。磷光检测荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。38第四节

荧光分析方法与应用一、荧光定量分析方法定量依据

荧光强度

If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：

If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：

If

=2.3I0lc

=Kc第四节荧光分析方法与应用一、荧光定量分析方法391．

标准曲线法配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度2、比较法在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。1．

标准曲线法403、多组分混合物的荧光分析①各组分荧光峰相互不干扰，按单组分测定方法，分别在各自的荧光峰处测定；②如果荧光峰互相干扰，激发光谱相差大，可选择在不同的激发光进行测定，其它组分在此激发波长不会产生荧光；（书p114例）③如果在同一激发波长下荧光光谱互相干扰，可以利用荧光强度的加和性，解联立方程求出。3、多组分混合物的荧光分析①各组分荧光峰相互不干扰，按单414、荧光分析注意事项①防止荧光污染②防止散射光的干扰三、荧光分析法的特点1、灵敏度高；2、选择性强；3、重现性好；4、试样量少；5、应用范围小。4、荧光分析注意事项①防止荧光污染42四、荧光分析法的应用1无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定2生物与有机化合物的分析见表四、荧光分析法的应用1无机化合物的分析43第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件44第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件453、食品检测方面应用（1）食品中矿物质及金属元素的分析（2）食品中氨基酸、维生素等的分析（3）食品霉变物质、菌类污染荧光分析（4）食品添加剂、防腐剂、食品包装有害物质分析（5）食品农药残留、药物残留分析3、食品检测方面应用（1）食品中矿物质及金属元素的分析46第四章荧光分析法第四章荧光分析法47第一节概述一、分子发光某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射。二、分子发光类型1、按激发模式①光致发光：分子因吸收外来辐射的光子能量而被激发所产生的发光现象。②化学发光：分子的激发能量是由反应的化学能量提供的发光现象。第一节概述一、分子发光48③生物发光：分子的激发能量是由生物体释放出来的能量所提供所产生的发光现象。2、按分子激发态的类型来划分①荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。②磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。③生物发光：分子的激发能量是由生物体释放49

第二节分子荧光分析法及其基本原理

一、荧光与磷光的产生过程

1.分子能级与跃迁在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；

第二节分子荧光分析法及其基本原理

一、荧光与磷502.电子激发态的多重态

平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；2.电子激发态的多重态平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则513.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；3.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定52（1）无辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。10-12s。内转换：同多重态电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。10-11s～10-13s通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。（1）无辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换53外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或猝灭。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。10-2s～10-6s改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生54（2）辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为

‘2的荧光。10-7～10-9s发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

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；延迟荧光：分子跃迁至T1态后，因相互碰撞或通过激活作用又回到S1态，经振动驰豫到S1态的最低振动能级再发射荧光。（2）辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振55磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：S0→T1禁阻跃迁S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动56（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光激发光的能量不足，将电子激发至基态中较高的振动能级，假如电子在受激后能量没有损失，并且在瞬时返回原来的能级，于是便在各个不同的方向发射和激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。②拉曼光被激发到基态中其它较高振动能级的电子，当它返回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着产生波长略长或略短于激发光波长的拉曼散射光。（3）瑞利散射光和拉曼光①瑞利散射光57S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸发发系间跨越内转换振动弛豫能l2l1l58二、分子荧光分析的基本原理1、激发光谱与荧光(磷光)光谱（1）.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。二、分子荧光分析的基本原理1、激发光谱与荧光(磷光)光谱59（2）.荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。（2）.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选60第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件61（3）.激发光谱与发射光谱的关系

①.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长（λem）比激发光谱的波长（λex）长，振动弛豫消耗了能量。

②.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。

（3）.激发光谱与发射光谱的关系①.Stokes位62第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件63③.镜像规则

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

③.镜像规则基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各64200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光发652、荧光强度及其与浓度的关系（1）量子产率及影响因素表示物质发射荧光的能力。

=发射的光子数/吸收的光子数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。由于激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁，因而荧光量子产率也可表示为：

=kf/(kf+∑K)kf：辐射跃迁速率，∑K：非辐射跃迁速率2、荧光强度及其与浓度的关系（1）量子产率及影响因素66（2）荧光强度与浓度的关系

①在稀溶液中（bc＜0.05)，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

If

=2.3I0

bc荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。在一定条件下：If

=Kc

②在浓溶液中，荧光强度常常随溶液浓度增加而下降a因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大降低；b.溶质与溶质间的相互作用产生荧光物质的激发态分子与基态分子形成复合物；

c自吸收。

（2）荧光强度与浓度的关系①在稀溶液中（bc＜0.05)673.荧光与分子结构的关系（1）分子产生荧光必须具备两个条件：a.具有合适的结构；b.具有一定的荧光量子产率。（2）化合物的结构与荧光①共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。a芳环越大,荧光峰越移向长波方向b同一共轭环数的芳族化合物,线性环结构者荧光波长比非线性者要强。

3.荧光与分子结构的关系（1）分子产生荧光必须具备两个条件68②刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。a试剂本身有刚性平面结构②刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故69b形成络合物后,形成刚性平面滂铬兰黑R（BBR）无荧光，它与铝形成螯合物有荧光。

b形成络合物后,形成刚性平面70c取代基之间形成氢键加强了分子刚性结构和增强荧光强度。d异构体的影响顺式和反式同分异构体具有不同的荧光强度。c取代基之间形成氢键加强了分子刚性结构和增强荧光强度。71③取代基效应芳环上有供电基，使荧光增强。a给电子基团常使荧光增强;取代基对苯荧光的影响(乙醇溶液)化合物分子式荧光波长(nm)荧光相对强度

苯C6H6270—31010苯酚C6H5OH285—36518苯胺C6H5NH2310—40520苯基氰C6H5CN280—39020苯甲醚C6H5OCH3285—34520

③取代基效应芳环上有供电基，使荧光增强。化合物72b吸电子基团会减弱甚至破坏荧光;c邻位、对位取代增强荧光，间位取代抑制荧光。d重原子引入体系，荧光强度都很弱，而磷光强度相应增强。e与π电子体系作用小的取代基,影响小。b吸电子基团会减弱甚至破坏荧光;73④跃迁类型

*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。④跃迁类型*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率74第四章荧光分析法现代食品检测技术教学课件754、影响荧光强度的主要因素（1）荧光猝灭①自猝灭a.荧光辐射的自吸收；b.荧光物质的激发态分子M*与基态分子M形成激发态的二聚体（M*M）；c.基态的荧光物质分子的缔合。②电荷转移猝灭激发态分子比基态具有更强的与其他物质发生氧化还原反应的能力，从而导致荧光猝灭。

4、影响荧光强度的主要因素（1）荧光猝灭76③转入三重态猝灭发生S1→T1间的系间窜跃，把多余的能量消耗于碰撞之中使荧光猝灭。（2）温度、酸度和溶剂的影响①温度随着溶液温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。②酸度对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。③转入三重态猝灭发生S1→T1间的系间窜跃，把多余的能量77③溶剂除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。（3）表面活性剂的影响①增溶②增敏a提高荧光量子产率;b提高ε。③

增稳③溶剂除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配78第三节：荧光分析仪器

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。

基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。第三节：荧光分析仪器测量荧光的仪器主要由四个部分组成79仪

器

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光

路

图80一、基本装置及主要构件1、激发光源（1）条件①足够的强度②紫外，可见区域有连续的光谱③强度与波长无关④光强稳定（2）激发光源①氙灯（高压）:250～800nm光谱区呈连续光谱，氙灯使用寿命大约为2000h。②汞灯（高压）:在紫外区激发，365nm，使用寿命1500～3000小时。一、基本装置及主要构件1、激发光源812、单色器①光栅单色器有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱，主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可用前置滤光片加以消除。②滤光片滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有广泛的应用。3、样品池石英方形池，四面都透光。

4、狭缝狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。2、单色器①光栅单色器825、检测器①光电倍增管：灵敏度高，线路简单。②光电摄像管：具有检测效率高，动态范围宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。6、读出装置记录仪、阴极示波器和显示器。