PCR简介-陈小波课件

PCR技术介绍（PolymeraseChainReaction)

IntroductiontoPCRTechnology实验室：陈小波遗传是怎样实现的？一、DNA结构的发现O.T.Avery(1877-1955)1865年1944年1953年二、DNA的体内半保留复制1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）三、PCR的发明

1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖基因研究的里程碑！

聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ：

在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，即体外DNA扩增技术。四、PCR的基本概念模板聚合酶dNTPsBuffer(Mg2+)引物五、PCR的反应体系常用体系：10µL

25µL50µLPCR循环第一步：加热变性（94℃）靶序列靶序列七、PCR的反应过程PCR循环第三步:引物延伸（72℃

）靶序列靶序列引物1引物2生物素生物素5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon八、PCR的体系优化模板：纯聚合酶：效率与错配dNTPs：足量Buffer(Mg2+)：镁离子浓度引物：设计合理1.变性温度和时间2.退火温度和时间3.延伸温度和时间

4.循环数九、PCR的条件优化单因素改变！优化PCR条件设立阳性和阴性对照避免交叉污染

采取隔离措施循环次数尽量少十、PCR的质量控制荧光定量PCR(Real-timePCR)

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan探针技术Dane颗粒（完整的病毒）HBsAgHBcAg/HBeAgHBVDNADNA聚合酶（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）八、荧光定量PCR检测HBV(一)、HBV的结构：(三)、HBV抗原抗体系统检测临床意义HBsAgHBeAg抗-HBe抗-HBc抗-HBs临床意义IgMIgG+-----

感染或无症状携带者++-+--急性乙型肝炎（有传染）

（大三阳）++--+-慢性乙型肝炎（有传染）

（大三阳）+-++-急性肝炎趋向恢复（小三阳）--+-++恢复期（传染性低）-----+既往感染或接种疫苗1.检测HBV-DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”；2.判断疾病的严重程度和传染性；3.检测病毒变异引起的“HBeAg阴性肝炎”、“抗-HBs阳性乙肝”等；4.指导选择抗病毒药物，避免盲目用药:如果抗病毒治疗3个月或半年，HBV

DNA仍不转阴或下降少于2次方，则提示该药物抗病毒疗效欠佳，可考虑停药或换用其他抗病毒药。

(四)、HBV-DNA检测的意义：(五)、HBV-DNA其它检测的意义：1HBVP区耐药基因测序各种耐药：拉米呋啶、阿德福韦、恩曲他滨、恩替卡韦、特比呋啶；2HBVYMDD突变检测拉米呋啶耐药；HBV前C区1896位点变异检测干扰素治疗不敏感。3－子宫颈癌与人乳头瘤病毒（HPV）九、荧光定量PCR检测HPV*十九世纪四十年代:意大利医生RegoniStern最早提出：结婚与否与宫颈癌的发生可能有关；

*60－70年代:人们的主要研究对象是HSV,HCMV等病原体；

*1974年:zurHausen首次提出HPV感染与宫颈肿瘤有密切关系；(一)、宫颈癌的生物学病因研究进展：返回分子生物*1977年:Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）颗粒；

*1995年IARC专题讨论会：

高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。

-99.7％的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。(一)、宫颈癌的生物学病因研究进展：

行为因素：如性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、社会经济地位低下、营养不良及性混乱等；

生物学因素：如细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染。目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。(二)、子宫颈癌的危险因素：(三)、人乳头瘤病毒：（HumanPapillomaviruses,HPV）双链DNA无包膜病毒；环状DNA，约8Kb；病毒颗粒直径为50～55nm；依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。HPV电镜图1.病毒简介：已发现100多种不同的亚型。其中超过35种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关：

1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV6、11、42）；

2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV16、18、31、33、35、39

、45、51、52、53、56、58、59、66及68）；

3）中间型：不确定型。2.HPV的型别：

3.HPV常见类型:

低危型（6/11）:可导致生殖道、肛周皮肤外生性湿疣病变，或低级别病变(CIN1)。（6、11、42、43、44）

高危型（16/18）:可导致高级别病变（CIN2/CIN3）和宫颈癌的发生。（16、1831、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）

有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关：

1）HPV45在非洲西部很常见；2）HPV39和59在美洲中部和南部常见；3）HPV52，58在中国常见。

4）在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16为主(占51％)，在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。3.HPV的分布：4.HPV感染率:最常见的低危型:HPV6、11最常见的高危型:HPV16、18、31、33、45、58HPV16HPV18HPV45HPV31HPV33Other宫颈癌患者中高危型HPV感染率表：2006-2007ADICONHPV亚型阳性率统计亚型6111618313335比例

16％18％32％6％4％10％16％亚型394556585973比例2％4％16％8％12％2％子宫颈癌：

病因明确的癌症;可以早期发现及预防的癌症;可望消灭的癌症。(四)、子宫颈癌的预防与检查:1.概述:表:不同的筛查频率，可以降低宫颈癌的累积发病率筛查频率每年筛查一次每两年筛查一次每三年筛查一次一生筛查5次一生筛查3次一生筛查2次一生筛查一次累积发病率的降低（％）90-9386-9175-8861-7435-5529-4217-32筛查对象:三年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女终止年龄:65岁以上危险性极低。筛查间隔:每年一次，若连续两次HPV和细胞学筛查均为正常，可延长筛查间隔时间至5～8年。2.宫颈癌筛查及早诊早治指南:

---中国癌症研究基金会（CCRF）筛查方案：

最佳方案：TCT+HPV检测随访对象：细胞学低度病变、CINI以上者、“特殊职业”妇女人群、年龄30岁以上的高危HPV感染者，每年定期随访检查。注意事项：

1、在非月经期采样

2、采样前3天内不做阴道冲洗，不使用阴道内用药物

3、采样前24h内不要行性生活TCT检查3.宫颈癌的常规临床检测方法:临床检查：如肉眼观察、阴道镜等;细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂片、TCT等病毒学检测：HPVDNA检测(PCR方法),常见方法有：基因芯片分型检测、荧光PCR等

特异性强、灵敏度高，操作简便快捷(98%)4.德、法、英三个国家研究数据总概:HPV（＋）是宫颈病变的重要依据，持续的HPV感染是CINⅡ/CINⅢ的重要条件。液基薄层细胞学检测（ThinprepCytologicTest：TCT）目前国际领先的一种宫颈防癌细胞学检查技术

返回首页

子宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌。全世界每年约有47万新发子宫颈癌，亚洲约38万，中国约15万例。全世界每年约23万妇女死于宫颈癌，亚洲约19万，中国约8万，美国约0.5万。子宫颈癌患者年轻化，腺癌的发生率上升。年轻人群中的HPV感染增加，其中20岁左右的子宫颈癌患者占所有患者的5%。一、子宫颈癌

巴氏涂片细胞学之父：巴巴尼古拉是过去50年来最有效的子宫颈癌的筛选方法。

自从被发明以来，已经减少了70%的子宫颈癌患者。在过去的50年内，几乎没有什么改进。二、传统子宫颈癌筛查方法假阴性(1.5-55%)

子宫颈发生病变，但病变细胞未在玻片上被发现。不确定性(5-20%)

不明确的结果。假阳性(SIL-鳞状上皮内瘤变)(5-10%)

细胞学检查结果为异常，但子宫颈并未发生病变。(一)、巴氏涂片的局限：克服样本制备的问题更有效的特制取样器保留了几乎所有的细胞过滤膜及微电脑控制制片，标本具有代表性及时的湿固定处理克服了读片的问题超薄，一致的细胞层大幅度降低不满意标本数细胞形态和结构更加清晰传统涂片TCT涂片同一病人标本，均为显微镜下放大40倍三、TCT传统涂片TCT(一)、TCT与巴氏涂片的对比：

步骤一：采样

暴露宫颈口，用棉签将宫颈口及宫颈管内的分泌物轻轻粘掉，不能用力擦；将扫帚状采样器的中央刷毛部分轻轻地深插入子宫颈的通道内，以便较短的刷毛能够完全接触到外子宫颈，柔和地向前抵住采样器，并按同一个时针方向转动扫帚状采样器5-10周整，从子宫颈上采取足够数量的细胞样本；切勿来回转动。(二)、TCT检查标本采集方法：步骤二：漂洗

在装有TCT保存液的小瓶内漂洗扫帚状采样器。上下反复地将扫帚状采样器推入瓶底，迫使刷毛全部分散开来，共10次；最后，在溶液中快速地转动扫帚状采样器以进一步的将细胞样本保存下来，然后将采样器扔掉。

步骤三：存放

拧紧瓶盖，直到瓶盖上的扭矩标志线越过瓶上的扭矩标志线为止；将患者的姓名写在瓶上空白标签处，详细填写液基薄层细胞学检验申请单，贴条形码，并在标本瓶上贴与其相应的条形码；将样本保存瓶和检验申请单分别装入自封袋后再装入同一自封袋内，送至医院检验科等待艾迪康工作人员接收。全自动化微电脑处理精确过滤膜有效的去除血液、黏液及非诊断性杂质1.细胞分散2.细胞采集3.细胞转移在诊所在实验室将细胞涮到保存液中1232cm(三)、TCT检查制备步骤：一个重要的转变 1、采样应在非月经期进性2、采样前24h内不做阴道冲洗，不使用阴道内用药物3、采样前24h内不要行性生活(四)、TCT检查制备注意事项：

返回首页

染色体核型分析通过对染色体核型的分析，在细胞水平上对疾病进行诊断－－细胞遗传学

返回首页

利用PHA（植物血凝素）刺激成熟的淋巴细胞再次分裂；利用秋水仙素在细胞分裂中期破坏纺锤丝，抑制细胞分裂，形成染色体的形态；通过胰酶消化或缓冲液作用，将染色体显带，通过带纹和数目的分析判断染色体数目和结构的情况。(一)、染色体核型分析的原理：染色体（chromosome)是遗传信息的载体，由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成。人类具有23对染色体，其中1对性染色体，X,Y，22对常染色体。正常女性的染色体核型为：46,XX正常男性的染色体核型为：46,XY(二)、染色体与常见染色体病：

染色体各级结构图解DNA大分子形成核小体长度缩小7倍形成螺线管缩短6倍形成超螺线管再缩短40倍形成染色单体时缩短5倍共缩短7x6x40x5＝8400倍从几厘米长缩短到几微米长不平衡易位通常引起严重的疾患而夭折。平衡易位由于大都没有遗传物质的丢失，所以，本人虽不表现疾患，但其生育染色体异常患者的概率高达50-100％，给后代带来严重的后果。