氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件

氨基酸代谢控制发酵机制

及育种策略

徐庆阳中国氨基酸技术服务中心氨基酸代谢控制发酵机制

及育种策略

徐庆阳中国氨基酸技术服务1目录Chapter1代谢机制理论基础Chapter2L-谷氨酸Chapter3L-亮氨酸Chapter4L-缬氨酸Chapter5L-异亮氨酸目录Chapter1代谢机制理论基础2Chapter1代谢机制理论基础Chapter1代谢机制理论基础3氨基酸发酵机制在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间代谢产物，严格防止氨基酸、核苷酸等中间物质的大量积累。当氨基酸或核苷酸等物质进入细胞后，微生物细胞立即停止该物质的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，微生物细胞才能重新开始进行该物质的合成。微生物细胞中这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶的活性和酶量氨基酸发酵机制在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间4代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。一方面，从DNA的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机制，酶的合成像普通蛋白质的合成一样，受到结构基因的控制，由结构基因决定形成酶分子的一级结构；另一方面,酶的生物合成还受代谢物（酶反应的底物、产物及其类似物）的控制和调节。当有诱导物存在时，酶的生成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些酶促反应的产物，特别是终产物，又能产生阻遏作用，使酶的合成量大大减少。代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重5参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：①磷酸果糖激酶；②柠檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鸟氨酸转氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高丝氨酸脱氢酶；⑦苏氨酸脱水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸变位酶；11预苯酸脱水酶；12预苯酸脱氢酶。参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：①磷酸果糖激酶；②柠6一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶（branchingenzyme）可以成为关键酶，但关键酶并不都是分支点酶。关键酶的关键效果也只是在特定的氨基酸生物合成过程中成立，而在其他氨基酸的生物合成过程中则不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在缬氨酸生物合成途径中起主导性的关键酶作用，但在异亮氨酸的生物合成中，起主导性关键作用的却是苏氨酸脱水酶。该酶位于α-乙酰乳酸合成酶的前一阶段，并且不是分支点酶。一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶（br7反馈控制与优先合成氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制（反馈阻遏与反馈抑制）和在合成途径分支点处的优先合成如图所示的反馈控制，由催化合成途径最初反应A→B的初始酶受终产物氨基酸E的反馈抑制和合成途径上各种酶受终产物氨基酸E的反馈阻遏组成。反馈控制与优先合成8优先合成底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶的酶活性远远大于b酶的酶活性，结果优先合成E。E合成达到一定浓度时，就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G合成达到一定浓度时就会对c酶产生抑制作用优先合成底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶9平衡合成（balancedsynthesis）底物A经分支合成途径生成两种终产物E与G，由于a酶的酶活性远远大于b酶，结果优先合成E。E过量后就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果代谢流又转向合成E，如此循环平衡合成（balancedsynthesis）底物A经分10微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来催化的。按各种酶在代谢调节中作用的不同，又可将酶分为以下三类调节酶（常称关键酶，与代谢调节关系密切）变构酶：通过酶分子构象的变化来改变酶活性的一类酶同功酶：具有同一种酶的底物专一性，但分子结构不同的一类酶多功能酶：能够催化两种以上不同反应的一类酶静态酶一般与代谢调节关系不大的一类酶潜在酶指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来催化的。11同功酶酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G过量时，酶Ⅱ停止活动，C也不能经过F到G与此同时，酶I活力不受影响，A可以顺利地到E，从而使G过量，但并不干扰E的合成同功酶12反馈抑制与反馈阻遏的比较项目类型反馈阻遏反馈抑制控制对象酶的生物合成酶的活性控制量终产物浓度终产物浓度控制的水平DNA→mRNA→酶蛋白酶蛋白的构象变化控制装置终产物与阻遏蛋白的亲和力终产物与变构部位的亲和力控制装置的动作阻遏蛋白与操纵基因结合，通过变构效应，酶的结构发生变化不能合成mRNA形成的控制开、关控制控制酶活性大小反应迟缓、粗的控制迅速、精确的控制代谢途径无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等细胞经济高分子化合物(酶蛋白)低分子化合物(酶反应生成物)反馈抑制与反馈阻遏的比较项目反馈阻遏反馈抑制控制对象酶的生物13协同反馈抑制或称多价反馈抑制当一条代谢途径中有两个以上终产物时，任何一个终产物都不能单独抑制途径第一个共同的酶促反应，但当两者同时过剩时，它们协同抑制第一个酶反应协同反馈抑制或称多价反馈抑制14合作反馈抑制（Cooperativefeedbackinhibition）合作反馈抑制也可称为增效反馈抑制（Synergisticfeedbackinhibition）。这种反馈抑制不同于协同反馈抑制，也不同于积累反馈抑制当任何一个终产物单独过剩时，只部分地反馈抑制第一个酶的活性，只有当G、E两个终产物同时过剩存在时，才能引起强烈抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和合作反馈抑制（Cooperativefeedbackin15积累反馈抑制（Cumulativefeedbackinhibition）在积累反馈抑制中，每一个最终产物只单独地、部分地抑制共同步骤的第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所以几个最终产物同时存在时，它们的抑制作用是积累的积累反馈抑制（Cumulativefeedbackinh16顺序反馈抑制(Sequentialfeedbackinhibition)顺序反馈抑制的过程是：F积累，停止D→E反应，减少F的进一步合成，更多的D转到G，再由G合成I或K；I积累，抑制G→H的反应；K积累，抑制G→J的反应，结果造成G的积累，引起G对A→B的反馈抑制，使整个途径停止假反馈抑制(Pseudo-feedbackinhibition)假反馈抑制是指结构类似物引起的反馈抑制顺序反馈抑制(Sequentialfeedbackinh17Chapter2L-谷氨酸Chapter2L-谷氨酸18谷氨酸的生物合成途径生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸的生物合成途径生成谷氨酸的主要酶反应19谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途径）戊糖磷酸途径（pentosephosphatepathway，HMP途径）三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA循环）乙醛酸循环(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）等谷氨酸的生物合成包括20生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应转氨酶（AT）催化的转氨反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基21谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应22转氨酶（AT）催化的转氨反应转氨酶（AT）催化的转氨反应23谷氨酸合成酶（GS）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸合成酶（GS）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应24谷氨酸合成酶（GS）催化的反应谷氨酸合成酶（GS）催化的反应25由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径26

C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途径C6H12O6+NH3+3/2O227由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的总反应方程式为：C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4N+CO2+3H2O由于1摩尔葡萄糖可以生成1摩尔的谷氨酸，因此理论糖酸转化率为81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的28谷氨酸发酵的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径29葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物素充足时HMP所占比例是38%，控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例约为26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸谷氨酸发酵的代谢途径葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途30控制谷氨酸合成的重要措施α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脱氢酶活力微弱谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。丧失α-酮戊二酸脱氢酶的重要性已经用要求生物素和不分泌谷氨酸的大肠杆菌得以证明。甚至发现不要求生物素的一株丧失α-酮戊二酸脱氢酶的突变株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其亲株却什么也不分泌。谷氨酸产生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏条件下，三羧酸循环到达α-酮戊二酸时，即受到阻挡。把糖代谢流阻止在α-酮戊二酸的堰上，对导向谷氨酸形成具有重要意义。在铵离子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。谷氨酸发酵的代谢途径控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸发酵的代谢途径31谷氨酸脱氢酶活性强谷氨酸脱氢酶活性强32细胞膜对谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度，消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸，或青霉素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性。细胞膜对谷氨酸的通透性高33CO2固定酶系活力强Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强乙醛酸循环弱异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱CO2固定酶系活力强Citratesynthase,Ac34乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧35谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节糖代谢的调节氮代谢的调节谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节36优先合成黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸。优先合成黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制α-酮戊二酸合成后由37反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2-柠檬酸合成酶3-异柠檬酸脱氢酶4-α-酮戊二酸脱氢酶5-谷氨酸脱氢酶反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制1-磷酸烯醇式丙酮酸38优先合成

谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反应的关键酶，受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏优先合成与反馈调节优先合成优先合成与反馈调节39柠檬酸合成酶的调节

柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制异柠檬酸脱氢酶的调节

细胞内α-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当α-酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成α-酮戊二酸优先合成与反馈调节柠檬酸合成酶的调节优先合成与反馈调节40α-酮戊二酸脱氢酶的调节

在谷氨酸产生菌中，α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱谷氨酸脱氢酶的调节

谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸优先合成与反馈调节α-酮戊二酸脱氢酶的调节优先合成与反馈调节41糖代谢的调节能荷细胞所处的能量状态用ATP、ADP和AMP之间的关系来表示，称为能荷（energycharge）能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的能荷处于0.80到0.95之间，处于一种动态平衡）糖代谢的调节能荷能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的42糖代谢的调节能荷控制能量生成代谢系的调节如图所示，当生物体内即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），从而加速糖酵解、TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。当能荷高时，就会抑制糖元降解、糖酵解和TCA循环的关键酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶，并激活糖类合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分解，加速糖元的合成。

1-磷酸果糖激酶2-果糖1,6-二磷酸酯酶3-柠檬酸合成酶4-异柠檬酸脱氢酶5-反丁烯二酸酶6-乙酰CoA羧化酶7-糖原磷酸化酶8-糖原合成酶糖代谢的调节能荷控制能量生成代谢系的调节如图所示，当生物体内43糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节生物素对糖代谢速率的影响

生物素对糖代谢速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出生物素对CO2固定反应的影响生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以上），CO2固定反应可提高30%糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节44糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节生物素对乙醛酸循环的影响乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少由于异柠檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节45氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使ATP形成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，使得菌体生成积累谷氨酸生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力增强，琥珀酸氧化力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酸乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其它氨基酸量增加氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力46谷氨酸细胞膜渗透性的控制细胞膜的结构控制细胞膜渗透性的方法谷氨酸细胞膜渗透性的控制细胞膜的结构47氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件48细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成,极性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。膜内的蛋白质有的是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和信息交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的渗透性。细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于49控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成50控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成添加表面活性剂使用生物素过量的原料（如糖蜜等）发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂（如吐温60）或是高级饱和脂肪酸（C16～18）及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸作用机制：表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成51控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酸培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成。作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成52控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失α-磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成53控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成温度敏感突变株温度敏感突变株是通过诱变得到的在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株。利用温度敏感突变株进行谷氨酸发酵时，由于仅控制温度就能实现谷氨酸生产，所以又把这种新工艺称为物理控制方法。作用机制：温度敏感突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成54控制细胞壁的合成通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜，间接控制细胞膜通透性。这可以通过在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或头孢霉素C等抗生素来实现。作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸产生菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁糖肽的生物合成控制细胞壁的合成通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进55日常菌种工作定期分纯

一般1～2个月分纯—次，把产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑选出来小剂量诱变刺激用紫外线(10～20s)、通电、激光等轻微处理，可以淘汰生长微弱的菌株，并能激发溶原性噬菌体，使挑选出来的菌是产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染的优良菌株高产菌制做安瓿管通过诱变育种或分纯挑出来的高产菌株，要马上做安瓿管，防止菌种变异日常菌种工作定期分纯56谷氨酸发酵的代谢控制育种策略（进通节堵出）选育耐高渗透压菌种选育不分解利用谷氨酸的突变株选育细胞膜渗透性好的突变株选育强化CO2固定反应的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育强化能量代谢的突变株选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株谷氨酸发酵的代谢控制育种策略（进通节堵出）选育耐高渗透压菌种57选育耐高渗透压菌种耐高糖突变株选育在含20％～30％葡萄糖的平板上生长好的突变株耐高谷氨酸突变株选育在含15％～20％味精的平板上生长好的突变株耐高糖、高谷氨酸突变株选育在含20％葡萄糖和15％味精的平板上生长好的突变株选育耐高渗透压菌种耐高糖突变株58选育不分解利用谷氨酸的突变株谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸如果菌种一边合成谷氨酸，一边分解利用谷氨酸，就达不到积累谷氨酸的目的所以必须使菌种不能分解利用谷氨酸，切断-酮戊二酸继续向下氧化的反应，即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸59选育细胞膜渗透性好的突变株

谷氨酸产生菌细胞膜渗透性的改变是发酵法生产谷氨酸的关键抗Vp类衍生物

据有关资料报道，抗Vp类衍生物如香豆素、芦丁等能遗传性地改变细胞膜的渗透性选育溶菌酶敏感性突变株选育二氨基庚二酸缺陷突变株选育温度敏感突变株选育细胞膜渗透性好的突变株谷氨酸产生菌细胞膜渗透性的改60选育强化CO2固定反应的突变株选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株以琥珀酸为唯一碳源，菌体要想生长，碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应。菌休生长越快，四碳二羧酸的脱羧反应越强，而四碳二羧酸的脱羧反应与二氧化碳固定反应是相同酶所催化的，所以以琥珀酸为唯一碳源，菌体长得越好，二氧化碳固定反应越强选育氟丙酮酸敏感性突变株氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱，相对地CO2固定反应比例也就越大选育丙酮酸缺陷、天冬氨酸缺陷突变株克隆丙酮酸羧化酶基因选育强化CO2固定反应的突变株选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基61选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型突变株琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物，菌种对琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力越弱，乙醛酸循环就越弱

选育不利用乙酸的突变株利用基因工程技术，使异柠檬酸裂解酶活力降低选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型突变株62选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株选育柠檬酸合成酶强的突变株柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加强谷氨酸的生物合成

选育抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸等突变株抗氟乙酸、氟化钠、氮丝氨酸和氟柠檬酸都是乌头酸酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶的活力

选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株选育柠63选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育耐高谷氨酸的突变株选育谷氨酸结构类似物抗性突变株，如谷氨酸氧肟酸盐抗性突变株选育谷氨酰胺抗性突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育耐高谷氨酸的64选育强化能量代谢的突变株

谷氨酸高产菌的两个显著持点：-酮戊二酸继续向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循环弱，使能量代谢受阻；TCA循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢，可补救上述两点不足，使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快

选育呼吸抑制剂抗性突变株可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株

选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株

选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株

选育强化能量代谢的突变株65选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株选育抗核苷酸类抗生素突变抹，如德夸菌素、狭雷素C抗性突变株选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株选育莽草酸缺陷型或添加芳66Chapter3L-亮氨酸

Chapter3L-亮氨酸

67L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制68丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸间接前体物。催化丙酮酸生成α-酮基异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的，这些酶的合成均受到三种支链氨基酸的协同反馈阻遏。其中的乙酰羟基酸合成酶是由丙酮酸合成α-酮基异戊酸的关键（限速）酶，还受到L-缬氨酸的反馈抑制。在由α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸过程中，α-异丙基苹果酸合成酶是关键（限速）酶，受到L-亮氨酸的反馈抑制和阻遏。乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸的亲和力比对丙酮酸的高。α-异丙基苹果酸合成酶对α-酮基异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对α-酮基异戊酸的亲和力约高十倍。所以，三种支链氨基酸生物合成的优先顺序为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。据此可知，在α-酮基丁酸之前减弱或切断异亮氨酸的代谢流，对亮氨酸的优先合成有重要作用。丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊69L-亮氨酸产生菌的育种策略出发菌株的选择目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、粘质赛氏杆菌（Serratiamarcescens）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacteriumlactofermentum）、钝齿棒杆菌（Corynebacteriumcrenatum）、黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道

L-亮氨酸产生菌的育种策略出发菌株的选择70切断进一步代谢途径要大量积累L-亮氨酸，需切断或减弱亮氨酸进一步向下代谢的途径，使合成的亮氨酸不再被消耗，如选育以L-亮氨酸为唯一碳源不能生长或生长微弱的突变株切断进一步代谢途径71解除反馈抑制与阻遏解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟基酸合成酶等3个共用酶的协同反馈阻遏作用解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏作用以上可通过使菌体带上L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记(如：2-TAr、α-ABr、β-HLr、Valr等遗传标记)来实现解除反馈抑制与阻遏解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰72减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成选育异亮氨酸缺陷突变株来解除3个共用酶受所到的反馈阻遏选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-亮氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-亮氨酸产量的提高。选育以琥珀酸为唯一碳源生长微弱的突变株，即可获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱的突变株减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成选育异亮氨酸缺陷突变73改变菌体的正常代谢筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸产生菌选育上具有普遍提高产酸能力的作用，关于其详细机制，尚未见到令人信服的报道。一般认为，磺胺胍是细菌的生长因子-对氨基苯甲酸（PAPA）的结构类似物，而PAPA是叶酸的一个组分，不少细菌要求外界提供PAPA以合成其代谢中必不可少的辅酶-四氢叶酸，因而二者起竞争性拮抗作用。一旦菌株带有磺胺胍抗性标记，菌体的正常代谢发生改变，从而导致像氨基酸这样的代谢产物大量的积累改变菌体的正常代谢筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸74改变菌体的正常代谢筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸产量提高，其机制尚不清楚，可能是通过改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。利福平为半合成广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核分支杆菌均有明显抗菌效应。抗菌机理是：通过与细菌RNA聚合酶的β亚基结合，抑制细菌RNA聚合酶的活性，妨碍细菌RNA转录的启始。但是RNA转录一旦开始，利福平则不起作用改变菌体的正常代谢筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮75利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌基因工程技术主要通过目的基因扩增，增加生物合成途径中的限速酶，以提高目的产物的产量。从L-亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制可知，α-异丙基苹果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途径中真正意义上的限速酶，将编码该酶的基因克隆到L-亮氨酸产生菌中，增加该酶的数量，以解除其“瓶颈”的限速作用，从而提高L-亮氨酸的产量利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌76综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、异亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；结构类似物抗性，如：2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、β-羟基亮氨酸抗性（β-HLr）、亮氨酸氧肟酸盐抗性（LeuHxr）或缬氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为77氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件78Chapter4L-缬氨酸Chapter4L-缬氨酸79L-缬氨酸的生物合成途径L-缬氨酸的生物合成途径80代谢调节机制丙酮酸是L-缬氨酸的直接前体物，催化丙酮酸生成α-乙酰异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的。这些酶的合成均受到三种分支链氨基酸的协同阻遏。其中α-乙酰乳酸合成酶是L-缬氨酸生物合成途径中的关键酶，受到L-缬氨酸的反馈抑制。L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的最后一步转氨反应都是由同一种转氨酶催化完成的。代谢调节机制81L-缬氨酸高产菌株的育种思路出发菌株的选择:目前，世界上利用发酵法生产L-缬氨酸的出发菌株有北京棒杆菌（Corynebacteriumpekineise），谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutacium），乳糖发酵短杆菌[34](Brevibacteriumlactofermentum)，大肠杆菌（Escherichiacoli），黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum），粘质赛氏杆菌（Serratiamarcescens），芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属（Escherichia）的菌株等，这些菌株均可以作为选育L-缬氨酸生产菌的出发菌株L-缬氨酸高产菌株的育种思路出发菌株的选择:目前，世界上82切断或改变平行代谢途径L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，L-缬氨酸、L-亮氨酸与L-异亮氨酸的生物合成途径中共用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育L-亮氨酸、L-异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的共用酶系完全用于L-缬氨酸的生物合成，进而提高L-缬氨酸的产量。α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物。切断L-亮氨酸的合成途径不仅可以节省碳源而且解除了菌体生成L-缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏，使α-异丙基苹果酸合成酶脱敏，显著提高L-缬氨酸的产量切断或改变平行代谢途径L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途83解除菌体自身的反馈调节L-缬氨酸合成中的第一个限速酶—乙酰乳酸合成酶受L-缬氨酸的反馈抑制，同时L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的多价阻遏。如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸生物酶系的多价阻遏，必将大大提高L-缬氨酸的积累。可选育L-缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除L-缬氨酸的反馈调节。常用的L-缬氨酸结构类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、α-氨基丁酸（α-AB）、氟亮氨酸、正L-缬氨酸等解除菌体自身的反馈调节L-缬氨酸合成中的第一个限速酶—乙酰乳84增加前体物质的合成L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的L-缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量，可以选育以琥珀酸为唯一碳源生长慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突变株来达到目的增加前体物质的合成L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，为85切断进一步代谢途径要积累大量L-缬氨酸，需切断或减弱L-缬氨酸进一步向下的代谢途径，使积累的L-缬氨酸不再消耗，可通过选育不能以L-缬氨酸为唯一碳源生长，即丧失L-缬氨酸分解能力的突变株来实现切断进一步代谢途径86选育营养缺陷型回复突变株当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状之后，经过回复突变可以再回复其原有遗传性状，这是因为当某一结构基因发生突变后，结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活。而经过第二次回复突变后，该酶的活性中心结构就可以复原，而调节部位结构常常并没有回复，结果是酶恢复了活性，但是反馈抑制却已解除或并不怎么严重因此可以利用选育营养缺陷型回复突变株来提高发酵目的产物的产量，例如选育α-乙酰乳酸合成酶缺陷突变株的回复突变株可以解除L-缬氨酸的反馈抑制以及L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸引起的多价阻遏选育营养缺陷型回复突变株当一个菌株由于突变而失去某一遗传性87利用基因工程技术构建L-缬氨酸工程菌

Hoechst和Marquardt等将来源于大肠杆菌ATCC11303的ilvE基因片段克隆到pBR322质粒中，ilvE基因主要编码L-缬氨酸转氨基酶，将重组质粒转化到大肠杆菌DG30中，所构建的工程菌株可以高产L-缬氨酸。Mitsubishi与味之素公司的科研人员等将棒杆菌中编码乙酰氧肟酸基因的一段特殊的DNA序列插入到质粒载体中，再将构建的重组质粒转化到棒杆菌中，所构建的工程菌可以高产L-缬氨酸利用基因工程技术构建L-缬氨酸工程菌

Hoechst和Mar88育种标记育种目的备注Leu-切断L-亮氨酸的支路代谢。Ile-切断L-异亮氨酸的支路代谢。2-TAr解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用；2-TA是L-亮氨酸和L-缬氨酸的结构类似物。α-ABr解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用。α-AB是L-缬氨酸的结构类似物。SGr增强菌体必需生长因子四氢叶酸的生物合成，从而促进氨基酸的生物合成。SG是对氨基苯甲酸的结构类似物。育种标记育种目的备注Leu-切断L-亮氨酸的支路代谢89Chapter5L-异亮氨酸Chapter5L-异亮氨酸90L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制

L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制

91L-异亮氨酸的生物合成途径

葡萄糖经酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸经二氧化碳固定反应生成四碳二羧酸，经氨基化反应生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的催化下生成高丝氨酸；高丝氨酸在高丝氨酸激酶的催化下生成苏氨酸，苏氨酸经苏氨酸脱氨酶、乙酰羟基酸合成酶和支链氨基酸谷氨酸转氨酶的催化作用，生成L-异亮氨酸。L-异亮氨酸的生物合成途径

葡萄糖经酵解途径生成磷酸烯醇式丙92L-异亮氨酸的反馈调节机制微生物合成L-异亮氨酸由于有正常的反馈调节机制，故不能过量合成，正常的反馈调节包括：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制天冬氨酸激酶受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制高丝氨酸脱氢酶受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏苏氨酸脱氨酶受L-异亮氨酸的反馈抑制乙酰羟基酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制分支链氨基酸合成酶受三种支链氨基酸（L-异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）的多价阻遏细胞内苏氨酸水平的调节作用等。L-异亮氨酸的反馈调节机制微生物合成L-异亮氨酸由于有正常的93L-异亮氨酸产生菌常规育种思路

L-异亮氨酸产生菌应具备的生化特征根据L-异亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制，L-异亮氨酸高产菌应具备以下生化特征：CO2固定反应能力强天冬氨酸合成酶能力强天冬氨酸激酶活力强高丝氨酸脱氢酶活力强苏氨酸脱氨酶活力强乙酰羟基酸合成酶活力强二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶活力微弱或丧失琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶活力微弱或丧失谷氨酸脱氢酶活力弱。L-异亮氨酸产生菌常规育种思路

L-异亮氨酸产生菌应具备的94切断或减弱支路代谢

切断或减弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比苏氨酸优先合成，蛋氨酸合成过量后才使代谢转向合成苏氨酸，进一步合成L-异亮氨酸，因此切断或减弱蛋氨酸的合成支路有利于高产L-异亮氨酸。可选育蛋氨酸营养缺陷型Met-或MetL(渗漏突变)切断或减弱支路代谢

切断或减弱蛋氨酸的合成支路。蛋氨酸比苏氨95切断或削弱赖氨酸合成支路。由图可以看出，选育赖氨酸缺陷型或渗漏突变株，即切断或减弱由天冬氨酸半醛（ASA）向赖氨酸的合成支路。一方面可以起到节省碳源的作用，另一方面可以解除其对天冬氨酸激酶(AK)的反馈抑制，使代谢流更加流畅，造成异亮氨酸的前体物苏氨酸大量积累，从而使异亮氨酸的积累量提高切断或削弱赖氨酸合成支路。由图可以看出，选育赖氨酸缺陷型或渗96切断或减弱亮氨酸合成支路。选育亮氨酸缺陷或渗漏突变株，既可以解除亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸对分支链氨基酸生物合成酶系的多价阻遏，又可以避免不利于异亮氨酸精制操作的副产物氨基酸—正缬氨酸和高异亮氨酸的生成，从而有利于目的产物异亮氨酸的积累。这些副生氨基酸由α-酮丁酸、α-酮-β-甲基戊酸经亮氨酸生物合成途径生成，为亮氨酸所调节。所以，对于异亮氨酸生产菌株来说，如能增加亮氨酸缺陷这一遗传标记，就可以不生成正缬氨酸和高异亮氨酸，从而达到改良生产菌株的目的切断或减弱亮氨酸合成支路。选育亮氨酸缺陷或渗漏突变株，既可以97解除菌体自身反馈调节

a.选育抗结构类似物突变株选育苏氨酸结构类似物抗性突变株，如α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性、苏氨酸氧肟酸盐（ThrHx）抗性突变株，可解除苏氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制。选育赖氨酸结构类似物抗性突变株，如S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)抗性突变株，可解除赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制。选育异亮氨酸结构类似物抗性突变株。苏氨酸脱氨酶是异亮氨酸生物合成途经中的关键酶，受异亮氨酸的反馈抑制。选育α-氨基丁酸抗性（α-ABr）、异亮氨酸氧肟酸盐抗性(IleHxr)、硫代异亮氨酸抗性(S-Iler)、三氟代亮氨酸抗性(TFLr)、α-噻唑丙氨酸抗性(α-TAr)、邻甲基-L-苏氨酸抗性(OMTr)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)、α-溴丁酸抗性及D-苏氨酸抗性突变株，可以遗传性地解除异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈调节，从而有利于异亮氨酸的积累。选育蛋氨酸的结构类似物抗性突变株，如乙硫氨酸（Eth）抗性突变株，可解除蛋氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈阻遏作用。选育缬氨酸结构类似物抗性突变株，可解除支链氨基酸对乙酰羟基酸合成酶的协同反馈阻遏和缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。解除菌体自身反馈调节

a.选育抗结构类似物突变株98增加前体物的合成增加前体物苏氨酸的合成增加天冬氨酸的合成增加前体物的合成增加前体物苏氨酸的合成99切断进一步代谢途径要大量积累异亮氨酸，需要切断或减弱异亮氨酸进一步向下代谢的途径，使积累的异亮氨酸不再被消耗。据报道，选育不能以异亮氨酸为唯一碳源生长，即丧失异亮氨酸分解能力的突变株，有助于异亮氨酸的大量积累。切断进一步代谢途径100谢谢谢谢101氨基酸代谢控制发酵机制

及育种策略

徐庆阳中国氨基酸技术服务中心氨基酸代谢控制发酵机制

及育种策略

徐庆阳中国氨基酸技术服务102目录Chapter1代谢机制理论基础Chapter2L-谷氨酸Chapter3L-亮氨酸Chapter4L-缬氨酸Chapter5L-异亮氨酸目录Chapter1代谢机制理论基础103Chapter1代谢机制理论基础Chapter1代谢机制理论基础104氨基酸发酵机制在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间代谢产物，严格防止氨基酸、核苷酸等中间物质的大量积累。当氨基酸或核苷酸等物质进入细胞后，微生物细胞立即停止该物质的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，微生物细胞才能重新开始进行该物质的合成。微生物细胞中这种调节控制作用主要靠两个因素，即参与调节的有关酶的活性和酶量氨基酸发酵机制在一般情况下，微生物细胞只合成本身需要的中间105代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制。一方面，从DNA的分子水平上阐明了酶生物合成的控制机制，酶的合成像普通蛋白质的合成一样，受到结构基因的控制，由结构基因决定形成酶分子的一级结构；另一方面,酶的生物合成还受代谢物（酶反应的底物、产物及其类似物）的控制和调节。当有诱导物存在时，酶的生成量可以几倍乃至几百倍的数量增加。相反，某些酶促反应的产物，特别是终产物，又能产生阻遏作用，使酶的合成量大大减少。代谢控制机制的研究已经证明，酶的生物合成受基因和代谢物的双重106参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：①磷酸果糖激酶；②柠檬酸合成酶；③N-乙酰谷氨酸激酶；④鸟氨酸转氨基甲酰酶；⑤天冬氨酸激酶；⑥高丝氨酸脱氢酶；⑦苏氨酸脱水酶；⑧α-乙酰乳酸合成酶；⑨DAHP（2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯糖型庚糖酸-7-磷酸）合成酶；⑩分支酸变位酶；11预苯酸脱水酶；12预苯酸脱氢酶。参与氨基酸生物合成的关键酶主要有12种：①磷酸果糖激酶；②柠107一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶（branchingenzyme）可以成为关键酶，但关键酶并不都是分支点酶。关键酶的关键效果也只是在特定的氨基酸生物合成过程中成立，而在其他氨基酸的生物合成过程中则不成立。例如，α-乙酰乳酸合成酶在缬氨酸生物合成途径中起主导性的关键酶作用，但在异亮氨酸的生物合成中，起主导性关键作用的却是苏氨酸脱水酶。该酶位于α-乙酰乳酸合成酶的前一阶段，并且不是分支点酶。一般情况下，与氨基酸生物合成途径分支点有关系的分支点酶（br108反馈控制与优先合成氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制（反馈阻遏与反馈抑制）和在合成途径分支点处的优先合成如图所示的反馈控制，由催化合成途径最初反应A→B的初始酶受终产物氨基酸E的反馈抑制和合成途径上各种酶受终产物氨基酸E的反馈阻遏组成。反馈控制与优先合成109优先合成底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶的酶活性远远大于b酶的酶活性，结果优先合成E。E合成达到一定浓度时，就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G合成达到一定浓度时就会对c酶产生抑制作用优先合成底物A经分支合成途径生成两种终产物E和G，由于a酶110平衡合成（balancedsynthesis）底物A经分支合成途径生成两种终产物E与G，由于a酶的酶活性远远大于b酶，结果优先合成E。E过量后就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G过量后，就会拮抗或逆转E的反馈抑制作用，结果代谢流又转向合成E，如此循环平衡合成（balancedsynthesis）底物A经分111微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来催化的。按各种酶在代谢调节中作用的不同，又可将酶分为以下三类调节酶（常称关键酶，与代谢调节关系密切）变构酶：通过酶分子构象的变化来改变酶活性的一类酶同功酶：具有同一种酶的底物专一性，但分子结构不同的一类酶多功能酶：能够催化两种以上不同反应的一类酶静态酶一般与代谢调节关系不大的一类酶潜在酶指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶微生物体内代谢过程的各种生物化学反应，都是由各种酶来催化的。112同功酶酶I和酶Ⅱ都是催化A→B的同功酶。G过量时，酶Ⅱ停止活动，C也不能经过F到G与此同时，酶I活力不受影响，A可以顺利地到E，从而使G过量，但并不干扰E的合成同功酶113反馈抑制与反馈阻遏的比较项目类型反馈阻遏反馈抑制控制对象酶的生物合成酶的活性控制量终产物浓度终产物浓度控制的水平DNA→mRNA→酶蛋白酶蛋白的构象变化控制装置终产物与阻遏蛋白的亲和力终产物与变构部位的亲和力控制装置的动作阻遏蛋白与操纵基因结合，通过变构效应，酶的结构发生变化不能合成mRNA形成的控制开、关控制控制酶活性大小反应迟缓、粗的控制迅速、精确的控制代谢途径无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等无定向代谢途径和合成代谢途径分支点等细胞经济高分子化合物(酶蛋白)低分子化合物(酶反应生成物)反馈抑制与反馈阻遏的比较项目反馈阻遏反馈抑制控制对象酶的生物114协同反馈抑制或称多价反馈抑制当一条代谢途径中有两个以上终产物时，任何一个终产物都不能单独抑制途径第一个共同的酶促反应，但当两者同时过剩时，它们协同抑制第一个酶反应协同反馈抑制或称多价反馈抑制115合作反馈抑制（Cooperativefeedbackinhibition）合作反馈抑制也可称为增效反馈抑制（Synergisticfeedbackinhibition）。这种反馈抑制不同于协同反馈抑制，也不同于积累反馈抑制当任何一个终产物单独过剩时，只部分地反馈抑制第一个酶的活性，只有当G、E两个终产物同时过剩存在时，才能引起强烈抑制，其抑制程度大于各自单独存在的和合作反馈抑制（Cooperativefeedbackin116积累反馈抑制（Cumulativefeedbackinhibition）在积累反馈抑制中，每一个最终产物只单独地、部分地抑制共同步骤的第一个酶，并且各最终产物的抑制作用互不影响。所以几个最终产物同时存在时，它们的抑制作用是积累的积累反馈抑制（Cumulativefeedbackinh117顺序反馈抑制(Sequentialfeedbackinhibition)顺序反馈抑制的过程是：F积累，停止D→E反应，减少F的进一步合成，更多的D转到G，再由G合成I或K；I积累，抑制G→H的反应；K积累，抑制G→J的反应，结果造成G的积累，引起G对A→B的反馈抑制，使整个途径停止假反馈抑制(Pseudo-feedbackinhibition)假反馈抑制是指结构类似物引起的反馈抑制顺序反馈抑制(Sequentialfeedbackinh118Chapter2L-谷氨酸Chapter2L-谷氨酸119谷氨酸的生物合成途径生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸的生物合成途径生成谷氨酸的主要酶反应120谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（glycolysis,EMP途径）戊糖磷酸途径（pentosephosphatepathway，HMP途径）三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA循环）乙醛酸循环(glyoxylatecycle)丙酮酸羧化支路（CO2固定反应）等谷氨酸的生物合成包括121生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应转氨酶（AT）催化的转氨反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基122谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应123转氨酶（AT）催化的转氨反应转氨酶（AT）催化的转氨反应124谷氨酸合成酶（GS）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸合成酶（GS）催化的反应生成谷氨酸的主要酶反应125谷氨酸合成酶（GS）催化的反应谷氨酸合成酶（GS）催化的反应126由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径127

C6H12O6+NH3+3/2O2C5H9O4N+CO2+3H2O谷氨酸生物合成的理想途径C6H12O6+NH3+3/2O2128由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的总反应方程式为：C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4N+CO2+3H2O由于1摩尔葡萄糖可以生成1摩尔的谷氨酸，因此理论糖酸转化率为81.7%。由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡萄糖生物合成谷氨酸的129谷氨酸发酵的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径130葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物素充足时HMP所占比例是38%，控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例约为26%。生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸谷氨酸发酵的代谢途径葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途131控制谷氨酸合成的重要措施α-酮戊二酸氧化能力微弱，即α-酮戊二酸脱氢酶活力微弱谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征就是α-酮戊二酸氧化能力微弱。丧失α-酮戊二酸脱氢酶的重要性已经用要求生物素和不分泌谷氨酸的大肠杆菌得以证明。甚至发现不要求生物素的一株丧失α-酮戊二酸脱氢酶的突变株，能分泌2.3g/L谷氨酸，而其亲株却什么也不分泌。谷氨酸产生菌的α-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏条件下，三羧酸循环到达α-酮戊二酸时，即受到阻挡。把糖代谢流阻止在α-酮戊二酸的堰上，对导向谷氨酸形成具有重要意义。在铵离子存在下，α-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。谷氨酸发酵的代谢途径控制谷氨酸合成的重要措施谷氨酸发酵的代谢途径132谷氨酸脱氢酶活性强谷氨酸脱氢酶活性强133细胞膜对谷氨酸的通透性高谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度，消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸，或青霉素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性。细胞膜对谷氨酸的通透性高134CO2固定酶系活力强Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强乙醛酸循环弱异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱CO2固定酶系活力强Citratesynthase,Ac135乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧136谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节糖代谢的调节氮代谢的调节谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节137优先合成黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸。优先合成黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制α-酮戊二酸合成后由138反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2-柠檬酸合成酶3-异柠檬酸脱氢酶4-α-酮戊二酸脱氢酶5-谷氨酸脱氢酶反馈调节黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制1-磷酸烯醇式丙酮酸139优先合成

谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反应的关键酶，受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏优先合成与反馈调节优先合成优先合成与反馈调节140柠檬酸合成酶的调节

柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制异柠檬酸脱氢酶的调节

细胞内α-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当α-酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成α-酮戊二酸优先合成与反馈调节柠檬酸合成酶的调节优先合成与反馈调节141α-酮戊二酸脱氢酶的调节

在谷氨酸产生菌中，α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱谷氨酸脱氢酶的调节

谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。α-酮戊二酸合成后由于α-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸优先合成与反馈调节α-酮戊二酸脱氢酶的调节优先合成与反馈调节142糖代谢的调节能荷细胞所处的能量状态用ATP、ADP和AMP之间的关系来表示，称为能荷（energycharge）能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的能荷处于0.80到0.95之间，处于一种动态平衡）糖代谢的调节能荷能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的143糖代谢的调节能荷控制能量生成代谢系的调节如图所示，当生物体内即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制（如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等），并抑制糖元合成的酶（如糖元合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等），从而加速糖酵解、TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。当能荷高时，就会抑制糖元降解、糖酵解和TCA循环的关键酶，如糖元磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶，并激活糖类合成的酶，如糖元合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分解，加速糖元的合成。

1-磷酸果糖激酶2-果糖1,6-二磷酸酯酶3-柠檬酸合成酶4-异柠檬酸脱氢酶5-反丁烯二酸酶6-乙酰CoA羧化酶7-糖原磷酸化酶8-糖原合成酶糖代谢的调节能荷控制能量生成代谢系的调节如图所示，当生物体内144糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节生物素对糖代谢速率的影响

生物素对糖代谢速率的影响，主要是影响糖降解速率，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出生物素对CO2固定反应的影响生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以上），CO2固定反应可提高30%糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节145糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节生物素对乙醛酸循环的影响乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。原因是丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少由于异柠檬酸裂解酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动糖代谢的调节生物素对糖代谢的调节146氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶活力，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使ATP形成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在铵离子适量存在下，使得菌体生成积累谷氨酸生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力增强，琥珀酸氧化力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酸乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其它氨基酸量增加氮代谢的调节控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力147谷氨酸细胞膜渗透性的控制细胞膜的结构控制细胞膜渗透性的方法谷氨酸细胞膜渗透性的控制细胞膜的结构148氨基酸代谢控制发酵机制及育种策略课件149细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成,极性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。膜内的蛋白质有的是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和信息交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的渗透性。细胞膜的脂质主要是磷脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于150控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成151控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成添加表面活性剂使用生物素过量的原料（如糖蜜等）发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂（如吐温60）或是高级饱和脂肪酸（C16～18）及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸作用机制：表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成152控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酸培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成。作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成153控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失α-磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成154控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成温度敏感突变株温度敏感突变株是通过诱变得到的在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株。利用温度敏感突变株进行谷氨酸发酵时，由于仅控制温度就能实现谷氨酸生产，所以又把这种新工艺称为物理控制方法。作用机制：温度敏感突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变控制细胞膜渗透性的方法控制磷脂的合成155控制细胞壁的合成通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜，间接控制细胞膜通透性。这可以通过在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或头孢霉素C等抗生素来实现。作用机制：添加青霉素是抑制谷氨酸产生菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁糖肽的生物合成控制细胞壁的合成通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进156日常菌种工作定期分纯

一般1～2个月分纯—次，把产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑选出来小剂量诱变刺激用紫外线(10～20s)、通电、激光等轻微处理，可以淘汰生长微弱的菌株，并能激发溶原性噬菌体，使挑选出来的菌是产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染的优良菌株高产菌制做安瓿管通过诱变育种或分纯挑出