紫外可见分光光度法课件

第十章

紫外-可见分光光度法基本要求：1、掌握分光光度法的基本原理、测量及计算方法；2、掌握分光光度计作用的基本原理、主要组成部件及各部件的作用；3、了解紫外分光光度法在有机化合物结构解析方面的作用。第十章

紫外-可见分光光度法基本要求：1第一节

光学分析概论一、电磁辐射和电磁波谱二、光学分析法及其分类三、光谱法仪器——分光光度计第一节光学分析概论一、电磁辐射和电磁波谱2一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量2．电磁辐射的性质：具有波、粒二向性波动性：粒子性：一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速3高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁续前3．电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称~。γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级4二、光学分析法及其分类（一）光学分析法依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称~。（二）分类：1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量分析方法

按能量交换方向分吸收光谱法发射光谱法按作用结果不同分原子光谱→线状光谱分子光谱→带状光谱二、光学分析法及其分类（一）光学分析法（二）分类：按能量5续前2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍射法3．光谱法与非光谱法的区别：光谱法：内部能级发生变化

原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变续前2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定3．光谱法6续前（三）发射光谱（四）吸收光谱例：γ-射线；x-射线；荧光例：原子吸收光谱，分子吸收光谱续前（三）发射光谱（四）吸收光谱例：γ-射线；x-射线；荧7三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源单色器样品池检测器记录装置三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源单色器8第二节紫外-可见吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型三、相关的基本概念四、吸收带类型和影响因素第二节紫外-可见吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生9一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级10续前

2．分子吸收光谱的分类：

分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序3．紫外-可见吸收光谱的产生

由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生（吸收能量=两个跃迁能级之差）续前2．分子吸收光谱的分类：3．紫外-可见吸收光谱的产生11二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子→饱和的σ键

π电子不饱和的π键n电子轨道：电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同，电子所具有能量不同基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态c成键轨道与反键轨道：σ<π<n<π*<σ*二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子12图示b图示b13电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）E较大，λ150~250nm（真空紫外区）3.π→π*跃迁：不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）按能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：按能量大小：σ→σ*14图示图示15续前注：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）续前注：16三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A作图2．吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：17图示back图示back18续前3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

4．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强续前3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团4．助色团19续前5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后

吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）

吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）6．增色效应和减色效应

增色效应：吸收强度增强的效应

减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：

εmax>105→强带

εmin<103→弱带续前5．红移和蓝移：6．增色效应和减色效应20四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生C＝O；C＝N；—N＝N—E小，λmax250~400nm，εmax<100溶剂极性↑，λmax↓→蓝移（短移）2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—λmax>200nm，εmax>104共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑溶剂极性↑，对于—(—CH＝CH—)n—λmax不变对于—CH＝C—CO—λmax↑→红移四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n21续前3．B带：由π→π*跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带λmax=254nm，宽带，具有精细结构；εmax=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4．E带：由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带E1180nmεmax>104（常观察不到）E2200nmεmax=7000强吸收苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移）续前3．B带：由π→π*跃迁产生4．E带：由苯环环形共轭系22图示图示23图示图示24图示图示25续前影响吸收带位置的因素：1．溶剂效应：对λmax影响：n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移对吸收光谱精细结构影响溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λmax2．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长续前影响吸收带位置的因素：26图示back图示back27图示back图示back28第三节基本原理一、Lamber-Beer定律二、吸光系数和吸收光谱三、偏离Beer定律的因素四、透光率的测量误差第三节基本原理29一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律301．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）31二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：讨论：32三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为33（一）光学因素

照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度（一）光学因素照射物质的光经单色器分光后34紫外可见分光光度法课件352．杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形2．杂散光的影响：3．反射光和散色光的影响：36第三节基本原理一、Lamber-Beer定律二、吸光系数和吸收光谱三、偏离Beer定律的因素四、透光率的测量误差第三节基本原理一、Lamber-Beer定律37一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对38续前取物体中一极薄层续前取物体中一极薄层39续前讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定续前讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）40二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：讨论：41续前2．吸光系数两种表示法：1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度3）两者关系3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收续前2．吸光系数两种表示法：3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A42续前4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择：选A=0.2~0.7注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰续前4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：选A=0.43三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）化学因素三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为（44（一）光学因素

1．非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度（一）光学因素1．非单色光的影响：照射物质的光经单色器分光45续前续前46续前讨论：

入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状结论：选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）选λmax作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性）续前讨论：结论：47续前2．杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形续前2．杂散光的影响：3．反射光和散色光的影响：48（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液49四、透光率的测量误差——ΔT影响测定结果的相对误差两个因素：T和ΔTΔT影响因素：仪器噪音

1）暗噪音2）讯号噪音四、透光率的测量误差——ΔT影响测定结果的相对误差两个因素：50续前1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关与光讯号无关续前1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关51续前2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，对测定有利续前2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围521.紫外-可见光谱属于______。

a.原子光谱b.电子光谱c.振转光谱d.冷光谱2.衡量物质吸光能力的参数是：

吸光度摩尔吸光系数透光度桑得尔指数3.摩尔吸光系数的大小与下列哪项有关。

试样浓度比色皿厚度入射光波长不变的常数1.紫外-可见光谱属于______。

a.原子光谱534.吸光度与透光度的关系为：

A=T/M

A=-lgTA=T·M

A=lgT4.吸光度与透光度的关系为：

A=T/M54第四节紫外分光光度计

1．光源：2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm第四节紫外分光光度计1．光源：2．单色器：包括狭缝55续前3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器续前3．吸收池：5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池56类型：1．单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池→移动误差对光源要求高比色池配对类型：1．单光束分光光度计：特点：57续前2．双光束分光光度计：

特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱续前2．双光束分光光度计：特点：58续前3．双波长分光光度计特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差续前3．双波长分光光度计特点：59第五节定性和定量分析一、定性分析二、定量分析

定性鉴别纯度检查和杂质限量测定单组分的定量方法多组分的定量方法第五节定性和定量分析一、定性分析定性鉴别单组分的定量方法60一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征61续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，62续前2．对比吸收光谱的特征值续前2．对比吸收光谱的特征值63续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例：续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例：64续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：

找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：

主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）65续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A310≤0.05即符合要求的杂质限量≤0.06%续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含66二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法67续前1．吸光系数法（绝对法）续前1．吸光系数法（绝对法）68练习例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度解：练习例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为69练习例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？（）解：练习例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100m70练习例：解：练习例：解：71续前2．标准曲线法续前2．标准曲线法72示例

芦丁含量测定0.710mg/25mL示例芦丁含量测定0.710mg/25mL73续前3．对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时续前3．对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的74练习例：

维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100μg/mL）解：1）对照法练习例：维生素B12的含量测定解：1）对照法75练习2）吸光系数法练习2）吸光系数法76续前（二）多组分的定量方法三种情况：1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量续前（二）多组分的定量方法三种情况：77续前2．两组分吸收光谱部分重叠

λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca

续前2．两组分吸收光谱部分重叠78续前3．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定（1）解线性方程组法（2）等吸收双波长消去法（3）系数倍率法续前3．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定（1）解线性方791．解线性方程组法步骤：1．解线性方程组法步骤：802．等吸收双波长法步骤：

消除a的影响测b2．等吸收双波长法步骤：消除a的影响测b81续前消去b的影响测a注：须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大续前消去b的影响测a注：须满足两个基本条件823．系数倍率法前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点3．系数倍率法前提：干扰组分b不成峰形83续前步骤：b曲线上任找一点→λ1另一点→λ2优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍，提高了待测组分测定灵敏度abλ1

λ2续前步骤：b曲线上任找一点→λ1优点：同时将待测组分和干扰组84练习解：1．取咖啡酸，在165℃干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至200mL容量瓶中，加水至刻度线，取此溶液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L的HCL4mL，加水至刻度线。取此溶液于1cm比色池中，在323nm处测定吸光度为0.463，已知该波长处的，求咖啡酸百分含量练习解：1．取咖啡酸，在165℃干燥至恒重，精密称取10.085练习解：2．精密称取0.0500g样品，置于250mL容量瓶中，加入0.02mol/LHCL溶解，稀释至刻度。准确吸取2mL，稀释至100mL。以0.02mol/LHCL为空白,在263nm处用1cm吸收池测定透光率为41.7%，其摩尔吸光系数为12000，被测物分子量为100.0，试计算263nm处和样品的百分含量。

练习解：2．精密称取0.0500g样品，置于250mL容量瓶864、导数光谱法1）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解决干扰物质与被测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提高光谱分辨率的一种数据处理技术。2）原理：已知，对波长求一阶导数，得控制仪器使I0在整个波长范围内保持恒定，即dI0/d=0，则可见，一阶导数信号与浓度成正比。同样可得到二阶、三阶….n阶导数信号亦与浓度成正比。4、导数光谱法可见，一阶导数信号与浓度成正比。87随导数阶数的增加，峰形越来越尖锐，因而导数光谱法分辨率高（右图）。吸收峰数为：导数阶数+1，即n+110ppm苯的乙醇液1ppm苯的乙醇液1ppm苯的乙醇溶液，一阶导数光谱基本光谱1ppm苯的乙醇溶液，四阶导数光谱选择性及灵敏度均提高（苯的导数信号）随导数阶数的增加，峰形越来越尖锐，因而导数光谱883）导数峰高测量方法测量方法有三，如下图：正切法：相邻峰(极大或极小)切线中点至相邻峰切线(极小或极大)的距离d；峰谷法：两相邻峰值(极大或极小)间的距离p1或p2；峰零法：极值峰至零线间的距离。3）导数峰高测量方法895、光电比色法灵敏度高、选择性高、生成物稳定、显色剂在测定波长处无明显吸收。溶液中存在两种有色物质时，要求两种有色物最大吸收波长之差（对比度）：△λ>60nm。显色反应条件的选择1）.显色剂用量5、光电比色法灵敏度高、选择性高、生成物稳定、显色剂在测902）.显色反应时间与温度实验确定！显色后，分别在不同时间测定吸光度，作图得吸光度与时间变化曲线。一定时间后，吸光度不再随时间变化。此时的时间为显色反应时间。显色反应时间较长时，可提高显色温度。3）.反应体系的酸度在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。2）.显色反应时间与温度实验确定！显色后，分别在91第十章

紫外-可见分光光度法基本要求：1、掌握分光光度法的基本原理、测量及计算方法；2、掌握分光光度计作用的基本原理、主要组成部件及各部件的作用；3、了解紫外分光光度法在有机化合物结构解析方面的作用。第十章

紫外-可见分光光度法基本要求：92第一节

光学分析概论一、电磁辐射和电磁波谱二、光学分析法及其分类三、光谱法仪器——分光光度计第一节光学分析概论一、电磁辐射和电磁波谱93一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量2．电磁辐射的性质：具有波、粒二向性波动性：粒子性：一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速94高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁续前3．电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称~。γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级95二、光学分析法及其分类（一）光学分析法依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称~。（二）分类：1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量分析方法

按能量交换方向分吸收光谱法发射光谱法按作用结果不同分原子光谱→线状光谱分子光谱→带状光谱二、光学分析法及其分类（一）光学分析法（二）分类：按能量96续前2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍射法3．光谱法与非光谱法的区别：光谱法：内部能级发生变化

原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变续前2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定3．光谱法97续前（三）发射光谱（四）吸收光谱例：γ-射线；x-射线；荧光例：原子吸收光谱，分子吸收光谱续前（三）发射光谱（四）吸收光谱例：γ-射线；x-射线；荧98三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源单色器样品池检测器记录装置三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源单色器99第二节紫外-可见吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型三、相关的基本概念四、吸收带类型和影响因素第二节紫外-可见吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生100一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级101续前

2．分子吸收光谱的分类：

分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序3．紫外-可见吸收光谱的产生

由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生（吸收能量=两个跃迁能级之差）续前2．分子吸收光谱的分类：3．紫外-可见吸收光谱的产生102二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子→饱和的σ键

π电子不饱和的π键n电子轨道：电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同，电子所具有能量不同基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态c成键轨道与反键轨道：σ<π<n<π*<σ*二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子103图示b图示b104电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）E较大，λ150~250nm（真空紫外区）3.π→π*跃迁：不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）按能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：按能量大小：σ→σ*105图示图示106续前注：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）续前注：107三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A作图2．吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：108图示back图示back109续前3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

4．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强续前3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团4．助色团110续前5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后

吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）

吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）6．增色效应和减色效应

增色效应：吸收强度增强的效应

减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：

εmax>105→强带

εmin<103→弱带续前5．红移和蓝移：6．增色效应和减色效应111四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生C＝O；C＝N；—N＝N—E小，λmax250~400nm，εmax<100溶剂极性↑，λmax↓→蓝移（短移）2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—λmax>200nm，εmax>104共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑溶剂极性↑，对于—(—CH＝CH—)n—λmax不变对于—CH＝C—CO—λmax↑→红移四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n112续前3．B带：由π→π*跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带λmax=254nm，宽带，具有精细结构；εmax=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4．E带：由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带E1180nmεmax>104（常观察不到）E2200nmεmax=7000强吸收苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移）续前3．B带：由π→π*跃迁产生4．E带：由苯环环形共轭系113图示图示114图示图示115图示图示116续前影响吸收带位置的因素：1．溶剂效应：对λmax影响：n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移对吸收光谱精细结构影响溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λmax2．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长续前影响吸收带位置的因素：117图示back图示back118图示back图示back119第三节基本原理一、Lamber-Beer定律二、吸光系数和吸收光谱三、偏离Beer定律的因素四、透光率的测量误差第三节基本原理120一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律1211．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）122二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：讨论：123三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为124（一）光学因素

照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度（一）光学因素照射物质的光经单色器分光后125紫外可见分光光度法课件1262．杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形2．杂散光的影响：3．反射光和散色光的影响：127第三节基本原理一、Lamber-Beer定律二、吸光系数和吸收光谱三、偏离Beer定律的因素四、透光率的测量误差第三节基本原理一、Lamber-Beer定律128一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对129续前取物体中一极薄层续前取物体中一极薄层130续前讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定续前讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）131二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：讨论：132续前2．吸光系数两种表示法：1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度3）两者关系3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收续前2．吸光系数两种表示法：3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A133续前4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择：选A=0.2~0.7注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰续前4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：选A=0.134三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）化学因素三、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为（135（一）光学因素

1．非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度（一）光学因素1．非单色光的影响：照射物质的光经单色器分光136续前续前137续前讨论：

入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状结论：选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）选λmax作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性）续前讨论：结论：138续前2．杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形续前2．杂散光的影响：3．反射光和散色光的影响：139（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液140四、透光率的测量误差——ΔT影响测定结果的相对误差两个因素：T和ΔTΔT影响因素：仪器噪音

1）暗噪音2）讯号噪音四、透光率的测量误差——ΔT影响测定结果的相对误差两个因素：141续前1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关与光讯号无关续前1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关142续前2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，对测定有利续前2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围1431.紫外-可见光谱属于______。

a.原子光谱b.电子光谱c.振转光谱d.冷光谱2.衡量物质吸光能力的参数是：

吸光度摩尔吸光系数透光度桑得尔指数3.摩尔吸光系数的大小与下列哪项有关。

试样浓度比色皿厚度入射光波长不变的常数1.紫外-可见光谱属于______。

a.原子光谱1444.吸光度与透光度的关系为：

A=T/M

A=-lgTA=T·M

A=lgT4.吸光度与透光度的关系为：

A=T/M145第四节紫外分光光度计

1．光源：2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm第四节紫外分光光度计1．光源：2．单色器：包括狭缝146续前3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器续前3．吸收池：5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池147类型：1．单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池→移动误差对光源要求高比色池配对类型：1．单光束分光光度计：特点：148续前2．双光束分光光度计：

特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱续前2．双光束分光光度计：特点：149续前3．双波长分光光度计特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差续前3．双波长分光光度计特点：150第五节定性和定量分析一、定性分析二、定量分析

定性鉴别纯度检查和杂质限量测定单组分的定量方法多组分的定量方法第五节定性和定量分析一、定性分析定性鉴别单组分的定量方法151一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征152续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，153续前2．对比吸收光谱的特征值续前2．对比吸收光谱的特征值154续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例：续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例：155续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：

找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：

主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）156续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A310≤0.05即符合要求的杂质限量≤0.06%续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含157二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法158续前1．吸光系数法（绝对法）续前1．吸光系数法（绝对法）159练习例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度解：练习例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为160练习例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？（）解：练习例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100m161练习例：解：练习例：解：162续前2．标准曲线法续前2．标准曲线法163示例

芦丁含量测定0.710mg/25mL示例芦丁含量测定0.710mg/25mL164续前3．对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时续前3．对照法