基因重组技术生产胰岛素课件

基因重组技术生产胰岛素课件第七章克隆基因的表达第七章克隆基因的表达外源基因在宿主细胞中表达外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞基因重组技术生产胰岛素课件原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统丝状真菌表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统植物生物反应器常见表达系统的类型原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统大肠杆菌表达系统酵母用原核生物作宿主AdividingE.coli

第一节

外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子用原核生物作宿主AdividingE.coli第一节识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。很多功能上相关的3.转录和翻译偶联、连续进行。3.转录和翻译偶联、连续进行。4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统5.调控主要在转录水平上位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处，同核糖体16SrRNA3’末端序列互补，帮助从起始AUG处开始翻译。6.mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列Shine-Dalgarno（SD）sequence:4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统5.调控主要在转录水1.外源基因不能带有内含子2.一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达4.利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害为何？二、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子2.一般用cDNA，不能直三、原核生物基因表达的调控大肠杆菌基因表达载体基本结构特征三、原核生物基因表达的调控大肠杆菌基因表达载体基本结构特征是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。

1.启动子TTGACA

TATAAT

转录起始位点17bp5’

核糖体结合位点-35Box和

-10Box是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。2.核糖体结合位点（

RBS）Shine-Dalgarno（SD）

sequence翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子SD

5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCASD序列距离AUG的距离影响翻译2.核糖体结合位点（RBS）Shine-Dalgarn3.转录终止子

在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子，mRNA转录终止信号。3.转录终止子在表达载体克隆位点的下游一四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位包涵体（inclusionbody）

是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。1.细胞质中表达四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位包涵体（inclusion在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。例：

使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。①优点②缺点在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthh周质（periplasm）

革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。优点：2.周质中表达

容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。周质（periplasm）革兰氏阴性菌位于内膜由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素基因构建分泌性融合蛋白

使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。或与细菌素释放蛋白共表达3.胞外表达由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中基因重组技术生产胰岛素课件（1）一致顺序1.启动子的结构对表达效率的影响五、影响外源基因表达效率的因素TTGACA

TATAAT

转录起始位点17bp5’

核糖体结合位点-35Box和

-10Box（1）一致顺序1.启动子的结构对表达效率的影响五、影响外源

（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACA

TATAAT

一致顺序lactrpPL

recAtacItacII5’-TTTACA

TATGTT

5’-TTGACA

TTAACT

5’-TTGACA

GATACT

5’-TTGATA

TATAAT

5’-TTGACA

TATAAT

5’-TTGACA

TTTAAT

-35box-10box（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子（1）SD序列2.翻译起始序列对表达效率的影响

翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子SD

5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCA①

SD序列距离AUG的距离影响翻译（1）SD序列2.翻译起始序列对表达效率的影响5’-UAAGGAGG-3’

如果是A（T），翻译效率最高；如果是G（C），效率只有50%或25%。②

mRNA-rRNA互补区域长短影响基因的翻译5’-AGGAGGU-3’

？？？？5’-AAGGA-3’

>③

SD序列后面的4个碱基5’-UAAGGAGG-3’如果是A（T），翻译效率最高；AUG左侧的三个碱基也有影响（2）起始密码AUGAUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；AUG右侧的三个碱基也有影响。-半乳糖苷酶的mRNA中：是UUC、UCA或AGG时下降20倍。AUG左侧的三个碱基也有影响（2）起始密码AUGAUG左侧3.启动子与外源基因之间的距离3.启动子与外源基因之间的距离

转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费资源和能量、不会干扰正常表达。

增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。4.转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪转录水平的优化（1）使用强启动子或诱导型启动子（2）强终止子，或将两个终止子串联（3）提高mRNA的稳定性

如：在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列六、提高表达水平常用的方法转录水平的优化（1）使用强启动子或诱导型启动子六、提高表达水2.翻译水平的优化（1）优化翻译起始区①起始密码子ATG②mRNA-rRNA互补区域长短，SD序列距离AUG的距离，及碱基种类③翻译增强子2.翻译水平的优化（1）优化翻译起始区（2）翻译的终止①三个终止密码子，防止核糖体跳跃②终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU为大肠杆菌最有效的翻译终止序列。（3）密码子的选择①受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因②将稀有密码子改为偏爱密码子（2）翻译的终止（3）密码子的选择（1）表达分泌蛋白

细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。3.提高目的产物稳定性防止被宿主的酶降解。（1）表达分泌蛋白细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变也减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（2）

使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解

减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶（1）强启动子提高转录效率；（2）使用高拷贝表达载体。4.质粒的拷贝数增加mRNA数量，提高核糖体与mRNA的结合速度宿主大量生长后，诱导载体质粒复制，增加拷贝数宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制可调控的诱导型复制子（1）强启动子提高转录效率；4.质粒的拷贝数增加mRNA（1）培养基（2）环境因素（3）诱导时间和剂量5.宿主菌的选择表达载体与宿主相互匹配6.培养条件优化（1）培养基5.宿主菌的选择表达载体与宿主相互匹配6.1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变性、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。七、原核细胞表达的缺陷1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。七、原核细胞表达的缺陷4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无1.胰岛素的结构及其生物合成2.人胰岛素的生产方法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建七、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素1.胰岛素的结构及其生物合成2.人胰岛素的生产方法31.胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内的特异性肽酶NC信号肽B肽C肽A肽信号肽酶1.胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（302.人胰岛素的生产方法（1）直接提取法制人胰岛素迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。2.人胰岛素的生产方法（1）直接提取法制人胰岛素迄今为止（2）化学合成法制人胰岛素

根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：（2）化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素A链和B链（3）化学转型法制人胰岛素

猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：（3）化学转型法制人胰岛素猪的胰岛素可从原料丰2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：

上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。（3）化学转型法制人胰岛素2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。（4）基因工程法制人胰岛素2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素

上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：（4）基因工程法制人胰岛素上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外2.3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（1）A链和B链分别表达法化学合成:A、B链的编码序列3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（1）A链和B链分表达产物的后处理路线：（1）A链和B链分别表达法表达产物的后处理路线：（1）A链和B链分别表达法生产技术的评价：

由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。为了进一步降低生产成本，美国ElyLiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。（1）A链和B链分别表达法生产技术的评价：由于A链和B链上共存在六个半胱氨（2）人胰岛素原表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（2）人胰岛素原表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的（2）人胰岛素原表达法表达产物的后处理路线：（2）人胰岛素原表达法表达产物的后处理路线：二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前美国ElyLiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。（2）人胰岛素原表达法生产技术的评价：二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这（3）A链和B链同时表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（3）A链和B链同时表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程（4）分泌型重组人胰岛素表达法

上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式存在于胞质中。3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（4）分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠

一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。（4）分泌型重组人胰岛素表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛第二节

外源基因在真核细胞中的表达酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因第二节外源基因在真核细胞中的表达酵母菌、植物原生质体、一、真核生物表达的优越性和必要性1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA2、具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。一、真核生物表达的优越性和必要性1、真核生物具有转录后加工系3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。4、另外，真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控机制。一、真核生物表达的优越性和必要性3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯（一）外源基因在酵母中表达（二）植物细胞表达系统（三）昆虫培养细胞表达系统（四）哺乳动物细胞表达系统二、真核生物表达系统（一）外源基因在酵母中表达（二）植物细胞表达系统（三）昆虫（一）外源基因在酵母中表达１．酵母菌表达外源基因的优势２．酵母转化和表达的一般过程３．在啤酒酵母中表达的重组蛋白４．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌

５．利用重组酵母生产乙肝疫苗（一）外源基因在酵母中表达１．酵母菌表达外源基因的优势２．酵1.酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；已经分离出很强的启动子；能将外源基因表达产物分泌至培养基中；生长迅速、大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。1.酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2

PEG整合到染色体上或独立在酵母细胞内转化Ura3+营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长带有目的基因的重组载体鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化2.酵母转化和表达的一般过程酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2整合到染色体上转化Ur将目的基因克隆至载体1.基因及载体分别用限制酶切割；2.回收切割的基因和载体，然后用T4DNA连接酶连接；3.将构建的重组质粒转化至大肠杆菌受体菌；4.提取重组质粒DNA，酶切鉴定重组质粒，筛选出阳性重组菌株。将目的基因克隆至载体1.基因及载体分别用限制酶切割；2.HIV-1抗原丙肝病毒蛋白诊断试剂HIV-1外壳蛋白疟原虫环子孢子蛋白乙肝病毒表面抗原疫苗名称种类凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶集落刺激因子成纤维细胞生长因子胰岛素前体血小板源生长因子类胰岛素生长因子胰岛素上皮生长因子人类治疗用蛋白药物3.在啤酒酵母中表达的重组蛋白HIV-1抗原丙肝病毒蛋白诊断试剂HIV-1外壳蛋白疟原虫环4.广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌酵母属如酿酒酵母克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属如多态汉逊酵母

其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。4.广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌酵母属5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的结构蛋白包裹的双链DNA病毒，具有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg

）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的结构（1）乙型肝炎病毒的结构除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的结构除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝（2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因5.利用重组酵母生产

乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。（3）传统乙肝疫苗的制备5.利用重组酵母生产乙肝疫苗乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一（4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母20世纪80

目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%~2%。进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。（4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母5.利用重组酵母生产乙肝疫苗目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作（5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母（5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母重组菌经甲醇诱导表达HBsAg，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的2~3%，在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。（5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母5.利用重组酵母生产乙肝疫苗重组菌经甲醇诱导表达HBsAg，最终S蛋白的产量可达细胞（二）植物细胞表达系统1.植物受体系统的特点（1）细胞具有全能性（2）光合作用，培养条件简单，生产成本低（3）表达产物具有免疫原性和生物活性（4）灵活性及实用性强（5）稳定的外植体来源（二）植物细胞表达系统1.植物受体系统的特点（1）细胞具2.在植物品种改良中的应用（1）控制果实成熟

乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。（2）抗病虫害的转基因植物

苏云金芽孢杆菌的BT基因、蛋白酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个。2.在植物品种改良中的应用（1）控制果实成熟乙烯由基因重组技术生产胰岛素课件（3）抗除草剂的转基因植物

抑制农作物对除草剂的吸收、降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性（4）抗环境压力的转基因植物高效表达能提高植物胞内渗透压的同源或异源蛋白，提高植物细胞渗透压。2.在植物品种改良中的应用（3）抗除草剂的转基因植物抑制农作物对除草剂的吸收、（5）提高粮食中必需氨基酸的含量将蚕豆中一种富含赖氨酸和甲硫氨酸的蛋白编码基因植入玉米中。2.在植物品种改良中的应用（6）改变花卉的颜色抑制矮牵牛细胞内的苯基苯乙烯酮合成酶CHS基因表达，使花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，及一系列中间类型的花色。（5）提高粮食中必需氨基酸的含量将蚕豆中一种富含赖氨酸和3.植物生物反应器（1）转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶

治疗高歇斯症遗传病，称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗2000-8000只人类胎盘，将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，每克新鲜叶片中，hGC的含量高达1mg。3.植物生物反应器（1）转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶（2）转基因烟草生产植酸酶

饲料中添加植酸酶则可以提高动物对植酸磷元素的利用率，减少动物粪便中磷酸盐含量。从黑曲霉菌中克隆到植酸酶基因，导入到烟草的种子中表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。3.植物生物反应器（2）转基因烟草生产植酸酶饲料中添加植酸酶则可以提高（3）转基因拟南芥生产聚羟基丁酸将真养产碱菌的聚羟基丁酸PHB生物合成基因导入拟南芥中，转基因植物在整个生命周期中，PHB的含量逐步增加，每克湿重植物产PHB高达10mg，大约相当于细胞干重的14%。3.植物生物反应器（3）转基因拟南芥生产聚羟基丁酸将真养产碱菌的聚羟基丁酸转基因植物的潜在的安全隐患？②转基因植物的“杂草化”问题即作物与野生近缘种天然杂交形成恶性杂草。如海甜菜和甜菜杂交形成的恶性杂草曾对欧洲甜菜生产造成很大影响。①转基因植物的“基因漂移“风险产生超级杂草、新的病毒、病虫害等。如加拿大“超级杂草”事件。③基因工程产品对人类健康的潜在影响④可能使生物多样性受到损害转基因植物的潜在的安全隐患？②转基因植物的“杂草化”问题1、酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？2、有哪些方法可以将外源目的基因转移到植物体内？转基因植物的潜在的安全隐患主要表现在哪些方面？思考题1、酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？思考题演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！基因重组技术生产胰岛素课件第七章克隆基因的表达第七章克隆基因的表达外源基因在宿主细胞中表达外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞基因重组技术生产胰岛素课件原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统丝状真菌表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统植物生物反应器常见表达系统的类型原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统大肠杆菌表达系统酵母用原核生物作宿主AdividingE.coli

第一节

外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子用原核生物作宿主AdividingE.coli第一节识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。很多功能上相关的3.转录和翻译偶联、连续进行。3.转录和翻译偶联、连续进行。4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统5.调控主要在转录水平上位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处，同核糖体16SrRNA3’末端序列互补，帮助从起始AUG处开始翻译。6.mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列Shine-Dalgarno（SD）sequence:4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统5.调控主要在转录水1.外源基因不能带有内含子2.一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达4.利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害为何？二、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子2.一般用cDNA，不能直三、原核生物基因表达的调控大肠杆菌基因表达载体基本结构特征三、原核生物基因表达的调控大肠杆菌基因表达载体基本结构特征是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。

1.启动子TTGACA

TATAAT

转录起始位点17bp5’

核糖体结合位点-35Box和

-10Box是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。2.核糖体结合位点（

RBS）Shine-Dalgarno（SD）

sequence翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子SD

5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCASD序列距离AUG的距离影响翻译2.核糖体结合位点（RBS）Shine-Dalgarn3.转录终止子

在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子，mRNA转录终止信号。3.转录终止子在表达载体克隆位点的下游一四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位包涵体（inclusionbody）

是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。1.细胞质中表达四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位包涵体（inclusion在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。例：

使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。①优点②缺点在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthh周质（periplasm）

革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。优点：2.周质中表达

容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。周质（periplasm）革兰氏阴性菌位于内膜由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素基因构建分泌性融合蛋白

使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。或与细菌素释放蛋白共表达3.胞外表达由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中基因重组技术生产胰岛素课件（1）一致顺序1.启动子的结构对表达效率的影响五、影响外源基因表达效率的因素TTGACA

TATAAT

转录起始位点17bp5’

核糖体结合位点-35Box和

-10Box（1）一致顺序1.启动子的结构对表达效率的影响五、影响外源

（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACA

TATAAT

一致顺序lactrpPL

recAtacItacII5’-TTTACA

TATGTT

5’-TTGACA

TTAACT

5’-TTGACA

GATACT

5’-TTGATA

TATAAT

5’-TTGACA

TATAAT

5’-TTGACA

TTTAAT

-35box-10box（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子（1）SD序列2.翻译起始序列对表达效率的影响

翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子SD

5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCA①

SD序列距离AUG的距离影响翻译（1）SD序列2.翻译起始序列对表达效率的影响5’-UAAGGAGG-3’

如果是A（T），翻译效率最高；如果是G（C），效率只有50%或25%。②

mRNA-rRNA互补区域长短影响基因的翻译5’-AGGAGGU-3’

？？？？5’-AAGGA-3’

>③

SD序列后面的4个碱基5’-UAAGGAGG-3’如果是A（T），翻译效率最高；AUG左侧的三个碱基也有影响（2）起始密码AUGAUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；AUG右侧的三个碱基也有影响。-半乳糖苷酶的mRNA中：是UUC、UCA或AGG时下降20倍。AUG左侧的三个碱基也有影响（2）起始密码AUGAUG左侧3.启动子与外源基因之间的距离3.启动子与外源基因之间的距离

转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费资源和能量、不会干扰正常表达。

增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。4.转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪转录水平的优化（1）使用强启动子或诱导型启动子（2）强终止子，或将两个终止子串联（3）提高mRNA的稳定性

如：在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列六、提高表达水平常用的方法转录水平的优化（1）使用强启动子或诱导型启动子六、提高表达水2.翻译水平的优化（1）优化翻译起始区①起始密码子ATG②mRNA-rRNA互补区域长短，SD序列距离AUG的距离，及碱基种类③翻译增强子2.翻译水平的优化（1）优化翻译起始区（2）翻译的终止①三个终止密码子，防止核糖体跳跃②终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU为大肠杆菌最有效的翻译终止序列。（3）密码子的选择①受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因②将稀有密码子改为偏爱密码子（2）翻译的终止（3）密码子的选择（1）表达分泌蛋白

细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。3.提高目的产物稳定性防止被宿主的酶降解。（1）表达分泌蛋白细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变也减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（2）

使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解

减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶（1）强启动子提高转录效率；（2）使用高拷贝表达载体。4.质粒的拷贝数增加mRNA数量，提高核糖体与mRNA的结合速度宿主大量生长后，诱导载体质粒复制，增加拷贝数宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制可调控的诱导型复制子（1）强启动子提高转录效率；4.质粒的拷贝数增加mRNA（1）培养基（2）环境因素（3）诱导时间和剂量5.宿主菌的选择表达载体与宿主相互匹配6.培养条件优化（1）培养基5.宿主菌的选择表达载体与宿主相互匹配6.1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变性、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。七、原核细胞表达的缺陷1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。七、原核细胞表达的缺陷4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无1.胰岛素的结构及其生物合成2.人胰岛素的生产方法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建七、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素1.胰岛素的结构及其生物合成2.人胰岛素的生产方法31.胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内的特异性肽酶NC信号肽B肽C肽A肽信号肽酶1.胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（302.人胰岛素的生产方法（1）直接提取法制人胰岛素迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。2.人胰岛素的生产方法（1）直接提取法制人胰岛素迄今为止（2）化学合成法制人胰岛素

根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：（2）化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素A链和B链（3）化学转型法制人胰岛素

猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：（3）化学转型法制人胰岛素猪的胰岛素可从原料丰2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：

上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。（3）化学转型法制人胰岛素2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。（4）基因工程法制人胰岛素2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素

上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。2.人胰岛素的生产方法迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：（4）基因工程法制人胰岛素上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外2.3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（1）A链和B链分别表达法化学合成:A、B链的编码序列3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（1）A链和B链分表达产物的后处理路线：（1）A链和B链分别表达法表达产物的后处理路线：（1）A链和B链分别表达法生产技术的评价：

由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。为了进一步降低生产成本，美国ElyLiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。（1）A链和B链分别表达法生产技术的评价：由于A链和B链上共存在六个半胱氨（2）人胰岛素原表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（2）人胰岛素原表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的（2）人胰岛素原表达法表达产物的后处理路线：（2）人胰岛素原表达法表达产物的后处理路线：二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前美国ElyLiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。（2）人胰岛素原表达法生产技术的评价：二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这（3）A链和B链同时表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（3）A链和B链同时表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程（4）分泌型重组人胰岛素表达法

上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式存在于胞质中。3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（4）分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠

一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。（4）分泌型重组人胰岛素表达法3.重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛第二节

外源基因在真核细胞中的表达酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因第二节外源基因在真核细胞中的表达酵母菌、植物原生质体、一、真核生物表达的优越性和必要性1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA2、具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。一、真核生物表达的优越性和必要性1、真核生物具有转录后加工系3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。4、另外，真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控机制。一、真核生物表达的优越性和必要性3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯（一）外源基因在酵母中表达（二）植物细胞表达系统（三）昆虫培养细胞表达系统（四）哺乳动物细胞表达系统二、真核生物表达系统（一）外源基因在酵母中表达（二）植物细胞表达系统（三）昆虫（一）外源基因在酵母中表达１．酵母菌表达外源基因的优势２．酵母转化和表达的一般过程３．在啤酒酵母中表达的重组蛋白４．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌

５．利用重组酵母生产乙肝疫苗（一）外源基因在酵母中表达１．酵母菌表达外源基因的优势２．酵1.酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；已经分离出很强的启动子；能将外源基因表达产物分泌至培养基中；生长迅速、大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。1.酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2

PEG整合到染色体上或独立在酵母细胞内转化Ura3+营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长带有目的基因的重组载体鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化2.酵母转化和表达的一般过程酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2整合到染色体上转化Ur将目的基因克隆至载体1.基因及载体分别用限制酶切割；2.回收切割的基因和载体，然后用T4DNA连接酶连接；3.将构建的重组质粒转化至大肠杆菌受体菌；4.提取重组质粒DNA，酶切鉴定重组质粒，筛选出阳性重组菌株。将目的基因克隆至载体1.基因及载体分别用限制酶切割；2.HIV-1抗原丙肝病毒蛋白诊断试剂HIV-1外壳蛋白疟原虫环子孢子蛋白乙肝病毒表面抗原疫苗名称种类凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶集落刺激因子成纤维细胞生长因子胰岛素前体血小板源生长因子类胰岛素生长因子胰岛素上皮生长因子人类治疗用蛋白药物3.在啤酒酵母中表达的重组蛋白HIV-1抗原丙肝病毒蛋白诊断试剂HIV-1外壳蛋白疟原虫环4.广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌酵母属如酿酒酵母克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属如多态汉逊酵母

其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。4.广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌酵母属5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的结构蛋白包裹的双链DNA病毒，具有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg

）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的结构（1）乙型肝炎病毒的结构除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的结构除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝（2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因5.利用重组酵母生产乙肝疫苗（2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因5.利用重组酵母生产

乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料