叶绿体中甘油醛-3-磷酸脱气酶活性的测定

叶绿体中甘油醛-3-磷酸脱气酶活性的测定340nm处测定NADPH向NADP*的转化，从而测定GAP脱氢酶的活性。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料称取新鲜的小麦叶片20g，洗净后，吸干表面水分，在4℃下放置过夜。（二）仪器设备紫外分光光度计，高速组织匀浆器，秒表，冷冻离心机，恒温水浴。（三）试剂（1）分离叶绿体的介质。含有0.35mol/L山梨醇（或0.4mol/L蔗糖）、0.05mol/LTris、0.002mol/LEDTA、0.005mol/L半胱氨酸（或用0.1%巯基乙醇代替），用盐酸调至pH7.8，冰箱内保存。（2）涨破叶绿体的介质。含有0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液，pH8.4，内含0.002mol/LEDTA和0.10%巯基乙醇，冰箱内保存。（3）酶反应体系。见表2-19-1。三、实验步骤（一）制备叶绿体将20g4℃下冷冻过的小麦叶片剪碎，放入高速组织匀浆器中，用大约3倍于叶重的试剂（1），制成匀浆，匀浆化的时间不得超过1min，用4层纱布过滤，滤液在0℃下以1000×g离心2min，弃去沉淀，绿色上清液再在0℃下以4500×g离心1.5min，弃去上层悬浮液，所得沉淀即为叶绿体。向沉淀部分加入大约10ml试剂（1），用玻棒轻轻使沉淀悬浮（注意动作要轻，并在0～4℃下操作），在0℃下以4500×g再次离心1.5min，收集沉淀，用于制备粗酶液。（二）制备GAP脱氢酶将上述叶绿体沉淀先用圆头玻棒搅匀，再用约10mL试剂（2）充分悬浮，低渗涨破叶绿体。在0℃下以10000×g高心15min，黄色上清液即为酶的粗提取液，小心吸取上清液，放入试管中，于冰箱内保存，备用。（三）GAP脱氢酶的活性测定（1）取一试管，按表2-19-1中所列成分，除粗酶液和NADPH外，依次吸取4倍于各成分的量、混合均匀，放在30℃恒温水浴中预温5min，同时将部分粗酶液一同预温。取光径0.5cm的石英比色杯2只，用蒸馏水代替PGA-Na和粗酶液，其余均按表内比例混匀、放入一只比色杯内，作为对照。依次准确吸取预温后的反应介质0.7mL、NADPH0.2mL、0.3~0.4mL粗酶液，放入另一只比色杯中，立即混匀。同时将这两只比色杯放入分光光度计光路中，立刻记时，先记录30s时的340mm处吸光度，以后每隔30s记录一次，共记录5min。（2）ATP和DTT对GAP脱氢酶的影响。取2支试管，按表2-19-1中所列成分，依次吸取2倍于各成分的量，于一支试管中加入水代替ATP，另一支也用水代替DTT，混合均匀于30℃水浴中预温5min，按（1）的方法，分别测定缺ATP和缺DTT时，GAP脱氢酶在5min内吸光度的变化。（四）酶蛋白含量的测定用福林-酚法测定蛋白含量、将粗酶液稀释10倍、取1ml.稀释液，加1mL碱性铜试剂（新配制的），室温下放置10min，再加入3mL约0.1mol/L酸度的Folin试剂，30℃下保温15min，取出后，测650nm处吸光度，并记录之，计算出蛋白含量。或者按照本书实验29考马斯亮蓝（G-250）法测定酶粗液中蛋白质的含量，该方法更简便、准确。四、结果计算1.蛋白含量计算NADPH时的吸光系数；C为反应体系中酶蛋白的含量；酶活力单位为：单位蛋白在单位时间内的NADPH含量【mmol/（mg·min）】。分别计算出全体