核酮糖-15-二磷酸化酶活性的测定

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶活性的测定核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1，5-bisphosphalecarboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。本实验分别用分光光度法和同位素法测定酶的羧化能力。I.分光光度法一、原理在RuBPCase的催化下，1分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA），PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：这里1分子CO2，被固定，就有2分子还原型辅酶1被氧化。因此，由辅酶1氧化的量就可计算RuBPCase的活性，由340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化的量。为了使NADH的氧化与CO2之的固定同步，从而需要加入磷酸肌酸（Cr~P）和磷酸肌酸激酶的ATP再生系统。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料菠菜叶片、小麦及水稻叶片。（二）仪器设备紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器，移液管，秒表。试剂（1）5mmol/LNADH。（2）25mmol/LRuBP。（3）0.2mol/LNaHCO3。（4）RuBPCase提取介质：40mmol/L（pH7.6）Tris-HCl缓冲溶液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA、5mmol/L谷胱甘肽。（5）反应介质：100mmol/LTris-HCl缓冲液，内含12mmol/LMgCl2。和0.4mmol/LEDTA·Na2,pH7.8。（6）160u/ml.磷酸肌酸激酶溶液。（7）160u/mL甘油醛-3-磷酸脱氢酶溶液。(8)50mmol/LATP。（9）50mml/L磷酸肌酸。（10）160u/mL磷酸甘油酸激酶溶液。菠菜的RuBPCase提取液。三、实验步骤1.酶粗提液的制备取新鲜菠菜叶片10g，洗净擦干，放匀浆器中，加入10mL预冷的提取介质，高速匀浆30s，停30s，交替进行3次；匀浆经4层纱布过滤，滤液于20000×g4℃下离心15min，弃沉淀；上清液即酶粗提液，置0℃保存备用。RuBPCase活力测定按表2-14-1配制酶反应体系。将配制好的反应体系播匀，倒人比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1ml.RuBP加于比色杯内，并马上计时，每隔30s测一次吸光度，共测3min。以零点到第一分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力。由于酶提取液中可能存在PGA，会使酶活力测定产生误差，因此除上述测定外，还需做一个不加RaBP的对照。对照的反应休系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后马上测定此反应体系在340mm处的吸光度，并记录前一分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。四、结果计算二、材料、仪器设备及试剂（一）材料菠菜叶。（二）仪器设备液体闪烁仪，冷冻离心机，水浴锅，移液管。（三）试剂（1）0.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.8。（2）10mmol/LRuBP。（3）0.1mol/LNaHΛ14'CO3（25μCi/mL）。（4）0.1mol/LMgCl2。（5）20mmol/LDTT。（6）6mol/LHCl)（7）2-苯基-5-（4-二苯基）-1，3，4-噻二唑。（8）1，4-双-2-（5-苯基噻唑基）苯。（9）1，4-二氧六环。（10）茶。三、实验步骤在总体积为100μl的反应混合液中，含有：10μmol/ETris-HCl缓冲液（pH7.8），1μmol/LMgCl2，4μmol/LNaHΛ14CO3，0.2μmol/LDTT和10μL稀释酶液。混合液在25℃下预温10min，使酶活化，再加入0.1μmolRuBP为反应开始。反应5min后，加入100μL6mol/LHCl终止反应。终止反应后的反应液在闪烁管中于90℃下干燥，并除去未固定的CO2。干燥后，向管中加入0.1mL蒸馏水，使之溶解，再加入5