不同强度经颅直流电刺激对帕金森大鼠旋转行为学的影响

12/12不同强度经颅直流电刺激对帕金森大鼠旋转行为学的影响*蒋巍巍，田学隆，李一言，钱龙，俞雪鸿EffectsoftranscranialdirectcurrentstimulationonpraxiologyofparkinsonratwithdifferentintensitiesJiangWeiwei,TianXuelong,LiYiyan,QianLong,YuXuehong*基金资助：第四届国家大学生创新性实验课题(101061138)作者单位：重庆大学生物工程学院，重庆市400030BioengineeringCollegeofChongqingUniversity,Chongqing400030蒋巍巍，男，1991年生，重庆丰都，重庆大学在读本科生。主要从事生物医学信息检测的研究。电话E-mail:20087123@Correspondingauthor:JiangWeiwei,20087123@,doudouxiaobei@田学隆，男,1957年生，重庆市，教授，硕士研究生导师，主要从事生物医学信息检测与仪器等方面的研究。电话E-mail:xltian@中图分类号：Q-31摘要目的研究不同强度经颅直流电刺激（TranscranialDirectCurrentStimulation，tDCS）对帕金森病（Parkinson'sdisease，PD)大鼠旋转行为学的影响。方法根据完全随机原则，将成功的32例PD大鼠随机分成3个刺激组和1个对照组，每组8只PD大鼠。给予3个刺激组的左侧初级运动皮层（M1）区直流电强度分别为20μA、80μA、200μA（电流密度分别为6.36A/㎡，25.48A/㎡，63.70A/㎡）的阳极刺激,给予对照组假刺激，刺激时间持续30min。tDCS后，对PD大鼠腹腔注射阿朴吗啡（Apomorphine，APO），记录PD大鼠旋转的潜伏期、持续时间和平均转速(30min内)，采用SPSS进行统计学分析。结果刺激后，刺激组和对照组的平均转速组间存在显著差异性(P<0.05)。刺激组与对照组的潜伏期和持续时间组间不存在显著性差异（P>0.05）。结论tDCS的合适强度为80μA左右，因为刺激强度再加大至200μA后，平均转速的数值虽有变化，但和80μA刺激组间无显著性差异（P>0.05）。关键字经颅直流电刺激（tDCS）；帕金森病(PD)；旋转行为；动物模型AbstractObjective:DiscusstheefficacywhendifferentintensityTranscranialDirectCurrentStimulation(tDCS)onParkinsondisease(PD)rats.Methods:Accordingtocompletelyrandomprinciple,32successfulmodelswereevenlydividedinto4groupsincluding1controlgroupand3tDCSgroup.Inthisexperiment,weweregivenanodaltDCSgroupsreceivedsinglestimulationat20μA,80μA,200μA(currentdensityis6.36A/㎡，25.48A/㎡，63.70A/㎡)forupto30minoverprimarymotorcortex,whiledidn'tapplytDCSinthecontrolgroup.Afterstimulating,eachratwasassessedeffectsofapomorphineonrevolvingbehavior,thenwerecordthelatency,theduration,theaveragespeed,statisticalanalysiswasdoneatlast.Results：Afterstimulating,itwasfoundthattDCScanleadtostatisticallysignificantdecreaseofaveragespeedinPDrats(P<0.05).However,nosignificantchangeswerefoundinlatencyandduration(P>0.05).Conclusion:80μAtDCSmaybeanappropriateroleonimprovementofrats’movement.Becausewhenincreasetheintensityto200μA,theaveragespeedchanges,buttheredoesn’texistsignificanttimeeffectsondecreasingaveragespeedbetweentDCSgroupgroupsandcontrolgroups.KeyWords:TranscranialDirectCurrentStimulation,ParkinsonDisease,RotationalBehavior,AnimalModelsSupportedbythefourthinnovativeexperimentalsubjectsofChina(101,061,138)0.引言tDCS作为一种无创、无痛的皮层刺激方式,通过在靶位置施加一定强度的弱电流，从而极化局部大脑区域，引起皮层兴奋性可逆的改变，调节大脑皮层的功能[1]；同时调节皮层神经康复活动，缓解视觉病患者的疲劳和不适[2]；另外还有辅助治疗厌食症的功能[3]。DavidBenninger[4]等人的实验结果显示，经过重复tDCS之后，患者的步态在短时间内得到有效提高、上肢的迟缓程度在3个多月的时间里的有一定好转，并且统一帕金森病评定量表、反映时间和生理心理的综合评分都得到了提高。FelipeFregni等人[5]的实验显示，阳极刺激M1后，被刺激的受试者相对于假手术组的受试者的运动功能得到了显著改善。另外PauloBoggio[6]等采用2mA和1mA的阳极经颅直流电刺激初级运动皮层(M1)和左背外侧前额叶皮层（LDLPFC），发现2mA刺激组的患者的工作记忆能力显著提高。我们的研究与以往最大区别是较好地解决了电极固定在自由活动动物身上的问题，同时研究大量的PD大鼠模型，分析刺激后PD大鼠旋转行为学的变化，试图探究tDCS对帕金森病的改善机制。1.材料和方法1.1动物及材料健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重180–260g，鼠龄为60–80d，中国人民解放军第三军医大学动物中心提供；6-OHDA（美国Sigma公司）；Apomorphine(APO)（美国Sigma公司）；大鼠脑立体定位仪（成都仪器厂）；牙科钻；抗坏血酸（美国Sigma公司）。1.2方法实验采用单侧注射6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）制备PD大鼠模型。术前给大鼠注射APO确认其无旋转行为。采用GeorgePaxinos[7]等所著大鼠脑立体定向图谱，采用黑质致密部（SNC）和腹侧被盖区（VTA）两点注射法[8]：对PD大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉。头颅水平位固定在大鼠脑立体定位仪上，保证前囟和后囟处于同一水平面。剃除大鼠头部毛发，手术区消毒3次，于颅中部正中切开头皮和筋膜，切口长度1.5cm左右，剥离骨膜，使前囟充分暴露，确定左侧SNC、VTA三维坐标位置。左侧SNC区坐标:前囟后5.6mm,中线左侧1.7mm,硬膜下7.8mm；左侧VTA区坐标:前囟后5.0mm,中线左侧0.9mm,硬膜下7.8mm。标记坐标后使用牙科钻钻透颅骨，用微量注射器抽取2ug/μL的6-OHDA溶液（含0.2%VitC的生理盐水）每点注射4uL。注射进针速度为1uL/min，注射完毕停针10min。按1.0mm/min速度缓慢拔针，最后缝合皮肤、筋膜。1.3旋转行为学检测术后4周进行行为学检测，应用腹腔注射阿朴吗啡（0.5mg/kg体重），观察其旋转行为变化。若大鼠旋转时，首尾相接并恒定转向右侧，且旋转圈数大于210r/30min，则视为成功PD大鼠模型。1.4动物分组共成功造模32只PD大鼠，完全随机分为4组，每组8只，3实验组和1对照组。1.5经颅直流电刺激实验采用底面直径为2mm的圆柱形塑料小管，管内填充0.9%生理盐水浸泡的棉花制作成刺激电极（接触面积为3.14mm2），手术后使用牙科水泥固定在大鼠的左侧M1区。参考电极的接触面积为10cm2，通过一件由橡胶制成的紧身衣固定于胸腹部。为防止电流的中断，刺激时用生理盐水不断地浸湿电极。电极在帕金森大鼠身上固定的示意图见图1。图1：电极在帕金森大鼠身上固定的示意图Image1:TheschematicoftheelectrodesfixedontothePDrat分别给予实验组20μA、80μA、200μA的直流电刺激；在相同环境下，给予对照组30s的直流电刺激后便不给予直流电刺激的假刺激。刺激时保证大鼠处于自由清醒状态。1.6刺激后旋转行为检测刺激结束后，对PD大鼠腹腔注射APO，记录大鼠潜伏期、持续时间和平均转速(30min内)，观察大鼠旋转过程中行为学的变化。1.7染色制片方法取得洁净的大鼠大脑，使用50ml的10％甲醛固定大鼠大脑24h，然后用30％的蔗糖溶液浸泡之后，先后置于30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇浸泡4h脱水，使用1：1的二甲苯无水乙醇过度后用二甲苯透明置换，再使用1:1的二甲苯石蜡过度，在不高于56°的石蜡液体中浸泡4次，每次30min，包埋后，使用石蜡切片机片，切片厚度为40um。然后贴片于载玻片上，置于烘箱中烘干。使用苏木精-伊红染色，成功之后自然晾干后封藏。1.8统计方法本实验所有结果用x±s表示，用SPSS统计软件对所获得的数据进行分析处理。对于tDCS刺激前后的旋转参数，利用单因素方差分析(One-wayANOVA)处理实验数据，置信区间为0.95。2.结果2.1经颅直流电刺激给予参照组假刺激，分别给予刺激组PD大鼠20μA、80μA和200μA的tDCS，刺激完毕5min，注射APO，记录其旋转行为。实验刺激前后各组旋转参数的记录见表1。表1：不同强度tDCS作用下各组大鼠旋转行为的比较Tab1:Comparisonoftherotationalbehavioroftheratsineachgroupwithdifferentcurrentintensities分组对照组20μA刺激组80μA刺激组200μA刺激组tDCS潜伏期(min)3.5±0.423.82±0.743.62±0.583.64±0.82作用前持续时间(min)58.72±6.4457.96±4.1657.95±5.2254.20±4.92平均转速(r/min)9.63±1.5310.12±1.549.62±1.5810.07±1.48tDCS潜伏期(min)4.66±0.545.14±0.815.02±0.624.82±0.73作用后持续时间(min)55.72±4.8351.66±3.1754.02±8.3853.1±4.32平均转速(r/min)9.48±1.328.38±1.447.03±1.20★■6.28±0.86★■★：与对照组比较P<0.05；■：与20μA刺激组比较P<0.05；2.2刺激前后PD大鼠旋转行为学的变化分别做出刺激前后PD大鼠的潜伏期、持续时间和平均转速的交互式线条图为图2、图3、图4。刺激前后各组各项参数的差异性分析如下：⑴刺激后各组间的潜伏期均不存在显著性的差异（P>0.05）。由图2分析而得：对照组，20μA刺激组，80μA刺激组，200μA刺激组刺激前的潜伏期为3.6min左右。刺激后的潜伏期数值相比刺激前均有所上升，其中80μA刺激组上升幅度最大从刺激前的3.62min到5.02min。图中误差线为刺激前后各个组潜伏期的标准差值。图2：不同强度tDCS前后各组PD大鼠潜伏期的变化ThelatencychangesofthePDratsineachgroupbeforeandaftertDCSwithdifferentcurrentintensities.⑵由图3分析而得：刺激后各组的持续时间较刺激前均有所下降，其中20μA刺激组的持续时间减少得最多，从57.96min减少到51.66min，与刺激之前不存在显著性差异（P>0.05）。刺激后各组的持续时间均不存在显著性差异（P>0.05）。图中误差线为刺激前后各个组持续时间的标准差值。图3：不同强度tDCS前后各组PD大鼠持续时间的变化ThedurationchangesofPDratsineachgroupbeforeandaftertDCSwithdifferentintensities.⑶由图4可知，刺激前各组的平均转速都约为10r/min（P>0.05）。分别给予不同强度刺激后，20μA刺激组、80μA刺激组、200μA刺激组的平均转速分别下降到8.38r/min，7.03r/min和6.28r/min。刺激后20μA刺激组和对照组不存在显著性差异（P>0.05）；80μA刺激组和200μA刺激组与对照组之间的存在显著性差异（P<0.05）；但是200μA刺激组与80μA刺激组却不存在显著性差异（P>0.05）。自1998年以来tDCS在帕金森患者身上的应用近100例，大多数研究者选择的电流密度为0.57A/㎡或者0.29A/㎡，本已远远小于本实验的电流密度（20μA、80μA、200μA的电流密度分别为6.36A/㎡，25.48A/㎡，63.70A/㎡）。80μA的刺激对PD大鼠有效，增大到200μA后改组PD大鼠与80μA刺激组无显著性差异（P>0.05）。显然，80μA的tDCS更有意义。图中误差线为刺激前后各个组平均转速的标准差值。图4：不同强度tDCS前后各组PD大鼠平均转速的变化TheaveragespeedchangesofthePDratsineachgroupbeforeandaftertDCSwithdifferentintensities.2.3PD大鼠的M1区切片为了观察刺激对PD大鼠运动皮层的影响，取对照组和200μA刺激组的PD大鼠大脑分别染色制片，观察M1区的变化，见图5、图6。由图观察不到诸如水肿、坏死、血肿和细胞的改变。图5：对照组PD大鼠的M1区图6：200μA刺激组PD大鼠的M1区3.讨论3.1PD大鼠旋转行为的机制制作PD大鼠模型时，将6-OHDA微量注射于左侧SNC和VTA，使VTA的多巴胺能神经纤维发生退行性病变，从而使左侧纹状体内多巴胺(dopamine，DA)含量明显下降，使该侧纹状体内多巴胺D2受体数量和敏感性随自身调节而显著增加，导致两侧多巴胺受体不平衡。当注射APO时，其便与损毁侧纹状体内大量增加的多巴胺D2受体结合，导致其呈致敏现象，即可使大鼠产生不对称行为，引起动物向健侧发生旋转[9]。3.2tDCS的影响机制最近，一些tDCS的影响机制已经被提出。Ardolino等人[10]发现tDCS的后效有一个基于神经细胞膜功能的变化的非突触原理。Nitsche等人[11]揭示了长期持久的tDCS后效与取决于刺激的极性的NMDA受体活动的增强与削弱有关。直接电流刺激改变了受体静息膜电位改变。BesanconE[12]和ManningSM[13]的研究表明，多种渠道包括谷氨酸及NMDA受体与细胞死亡有关，而且NMDA受体阻断剂减轻中风模型大鼠的脑白质损伤。考虑到tDCS可能会影响NMDA受体激动剂或拮抗剂的疗效，tDCS可能通过调制NMDA受体影响脑白质从而产生对中风急性期缺血性损伤的保护。尽管tDCS对PD患者的运动功能具有康复作用，但是目前关于tDCS在PD大鼠上的实验并不多见，tDCS的作用机制也尚不完全清楚。在正常强度下tDCS对PD是有改善作用而且有一定时间的后效。Nitsche和Paulus就发现增加电流密度或刺激的持续时间，将得到更持久和更强的影响效果。但是由于电流密度的增加会增加皮肤疼痛的感觉，因为电流密度越大，有效电场的穿透深度越大，如果是想延长tDCS的影响时间，建议增加刺激持续时间和不改变电流密度[14][15][16]。3.3tDCS的安全性整个刺激过程PD大鼠表现得非常安静，DavidLiebetanz[17]使用阴极直流电刺激大鼠探究安全性时发现，当刺激电流密度达到142.9A/㎡，或刺激电荷密度为85714C/㎡时，对大鼠大脑会造成损伤。3.4tDCS的应用意义以及对帕金森病的治疗前景帕金森病是一种常见的神经损伤类疾病，主要病理改变是位于中脑的黑质多巴胺能神经元变性或缺失，使得合成的多巴胺减少，抑制乙酰胆碱的功能降低，乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便导致患者出现静止性震颤、僵化、动作迟缓与姿势不稳定等症状。tDCS用于治疗帕金森病的现状如下：一是帕金森病患者样本量小，PauloBoggio[6]和FelipeFregni[5]的受试者分别只有18人和17人；二是无法在自由活动的动物上固定好电极等原因，关于PD动物模型的研究也很少；三是tDCS的作用机制尚不完全清楚。基于以上原因，尽管经颅直流电刺激近年取得了一些令人鼓舞的研究成果，该方法一直未获得在临床的普及。tDCS与药物治疗相比，可能有较少的不利影响，尤其是运动障碍，运动波动和磨损现象。tDCS和rTMS相比有优势，tDCS提供了可靠的假刺激的条件，而且可能会导致更持久的调节作用，皮质功能，并易于管理和执行。tDCS已作为一种非侵入性工具来调节皮质功能。虽然tDCS可能具有以下副作用，如头痛，头晕，恶心，瘙痒感以及对皮肤的刺痛感，但tDCS却可以与药物治疗相结合，这可能会比其他神经刺激试验技术如经颅磁刺激的功效更好。然而对于临床适应性，tDCS还需要更稳定、更强、更多的刺激。即使现在仍处于实验研究阶段，但是随着tDCS在动物身上的实验进度加快、研究进一步的加深，未来tDCS必定造福于人类。（感谢田学隆导师对本文的悉心指导，感谢李一言师兄的帮助，感谢钱龙、俞雪鸿等同学的合作，感谢中国人民解放军第三军医大学温惠中对实验的支持。）4参考文献[1]HummelFC,CohenLG.Non-invasivebrainstimulation:anewstrategytoimproveneurorehabilitationafterstroke?LancetNeurology.2006,5(8):708-12.[2]PrateekGandiga,FriedhelmHummela,LeonardoCohena.TranscranialDCstimulation(tDCS)Atoolfordouble-blindsham-controlledclinicalstudiesinbrainstimulation.ClinicalNeurophysiology,2006,117(4):845-850.[3]DavidHecht,Transcranialdirectcurrentstimulationinthetreatmentofanorexia.MedicalHypotheses,2010,74(6):044-1047.[4]BenningerD,LomarevM,LopezG.TranscranialdirectcurrentstimulationforthetreatmentofParkinson'sdisease.JournalofNeurologyNeurosurgeryandPsychiatry,2010,81(10):1105-1111.[5]FelipeFregniMD,PauloBoggio,MarceloSantos,et.al.NoninvasivecorticalstimulationwithtranscranialdirectcurrentstimulationinParkinson'sdisease.MovementDisorders,2006,21(10):1693-1702.[6]PauLoS.Boggio,RobertaFerrucci,SergioP.Rigonatti,et.al.EffectsoftranscranialdirectcurrentstimuLationonworkingmemoryinpatientswithParkinson'sdisease,JournaloftheNeurologicalSciences,2006,249(1):31-38.[7]PaxinosG,WatsonC.Theratbraininstereotaxiccoordinates[J].AcademiaPressSydney,1985,26(3):87-92.[8]周广厚，陆建明，鲍远程.6-羟基多巴胺帕金森病大鼠模型的建立于评价.中国行为医学科学,2002,11(1)：4-7.[9]周嘉伟，武义鸣，徐慧君，等。帕金森病大白鼠动物模型的建立[J]。南通医学院学报，1989,9：84。[10]ArdolinoG,BossiB,BarbieriS.PrioriA.Non-synapticmechanismsunderlietheafter-effectsofcathodaltranscutaneousdirectcurrentstimulationofthehumanbrain.JPhysiol2005,568:653–663.[11]NitscheMA,SeeberA,FrommannK,et.al.Modulatingparametersofexcitabilityduringandaftertranscranialdirectcurrentstimulationofthehumanmotorcortex.JPhysiol2005;568:291–303.[12]BesanconE,GuoS,LokJet