SN∕T 5439.4-2022 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法 第4部分：克罗诺杆菌

S70SC3中华人民共和国出入境检验检疫行业标准T2出口食品中食源性致病菌快速检测方法试纸条法 第4部分克罗诺杆菌wkr4发布 1实施中华人民共和国海关总署 发布T2前 言本文件按照标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是9的第4部分9已经发布了以下部分:第1部分沙门氏菌;第2部分金黄色葡萄球菌;第3部分副溶血性弧菌;第4部分克罗诺杆菌;第5部分产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌;第6部分空肠弯曲菌;第7部分单核细胞增生李斯特氏菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位中华人民共和国南京海关中华人民共和国上海海关南京农业大学合肥工业大学苏州蝌蚪生物技术有限公司广东省科学院微生物研究所广东环凯生物科技有限公司杭州傲敏生物科技有限公司。本文件主要起草人袁辰刚孙欣薛峰蒋原曾海燕蔡淑珍曲晓莹申进玲陈伟曾德新、戴建君苏静陆寿祥曾静。ⅠT2出口食品中食源性致病菌快速检测方法试纸条法 第4部分克罗诺杆菌范围本文件规定了出口食品中食源性致病菌克罗诺杆菌快速检测的试纸条方法。本文件适用于出口食品中克罗诺杆菌的定性检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。6食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属阪崎肠杆菌检验2分析实验室用水规格和试验方法8实验室质量控制规范食品分子生物学检测术语和定义下列术语和定义适用于本文件。克罗诺杆菌r其为革兰氏阴性无芽孢杆菌具有周生鞭毛有动力兼性厌氧大多数产黄毒素具有葡萄糖苷酶活性是一种常见的病原菌。缩略语下列缩略语适用于本文件。脱氧核糖核酸)脱氧核苷酸三磷酸)乙二胺四乙酸)异硫氰酸盐)三羟甲基氨基甲烷]方法原理对样品中克罗诺杆菌进行增菌培养后提取采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的克罗诺杆菌的特异性检测引物进行扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体可与产物上的异硫氰酸盐标记分子结合在检测线位置上有抗地高辛抗体产物上的地高辛标记分子结合从而显色。如模板未扩增则无R产物与地高辛抗体及C抗体结合,从而不能在检测线T线位置显示颜色。1T2试剂和材料除另有规定外试剂为分析纯或生化试剂实验用水符合2的要求。引物克罗诺杆菌扩增引物详见表靶基因序列参见附录。表1试验用引物致病菌种类引物序列)端标记物靶基因片段长度克罗诺杆菌’地高辛Ap’异硫氰酸盐G&试剂A提取液0L2L2 n。R预混液。引物。5;展开液5;展开液0L1 1体积分数0以及浓度为5L的

或采用等效的商品化产品。仪器设备离心机离心力g。2微量移液器。3R仪。: 。4恒温水浴锅01℃天平感量。计。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。检验步骤样品制备和增菌按照6的方法进行样品制备和增菌。提取增菌液模板的制备对于1获得的增菌液采用如下方法制备模板:吸取1L菌液加入5L离心管中g离心3弃上清;加入15无菌生理盐水完全溶解沉淀g离心3弃上清;2加入LA提取液混匀后沸水浴0置冰上冷却;

T2g离心2上清液即为模板。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。可疑菌落模板的制备对于1分离到的可疑菌落可直接挑取可疑菌落再按照步骤制备模板A以待检测。也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。浓度和纯度的测定取LA溶液加双蒸水稀释至1使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测m和m处的吸光值0和0A的浓度按公式计算:式中:

AN0 1)cA浓度单位为纳克每微升m处的吸光值;核酸稀释倍数。当0比值在9之间时适宜于R扩增。扩增反应体系见表。表2反应体系组分总体积)预混液L上游引物)L下游引物)L模板a5μL无菌水7μLaA模板的浓度限定在L之间。反应条件5℃预变性55℃变性8℃退火2℃延伸15个循环后进入2℃,74℃保存。检测过程中分别设阳性对照

阴性对照和空白对照

。用克罗诺杆菌模板作阳性对照

用非克罗诺杆菌模板作阴性对照用等体积的无菌水代替模板作空白对照。试纸条检测取LR产物加入4L上样稀释液混匀后垂直缓慢滴加于试条样品垫中3n观察结果。3T2质量控制以下条件有一条不满足时实验视为无效:空白对照质控线变红检测线未变红。阴性对照质控线变红检测线未变红。阳性对照质控线变红检测线变红。结果判断与表述结果判定试纸条质控线变红色且检测线变红色R扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证。试纸条质控线变红色检测线不变色R扩增产物为阴性。表述产物试纸条检测为可疑阳性同时测序结果正确者继续按照传统方法进行分离若确分离到该菌判为含克罗诺杆菌表述为检出克罗诺杆菌;产物试纸条检测为阴性判为不含有克罗诺杆菌表述为未检出克罗诺杆菌。检测过程中防止交叉污染的措施按照8中附录D的规定执行。废弃物处理检测过程中的废弃物收集后在焚烧炉中焚烧处理。检出限本文件所规定方法的最低检出限为。4T2附 录A资料性)PCR产物测序结果克罗诺杆菌的基因扩增靶标参考序列A到G&A区域如下所示。5T2附 录B资料性)含有金标记的抗C的单克隆抗体和固定有地高辛抗体的通用核酸检测试纸条组成成分地高辛抗体。羊抗鼠二抗。C抗体。1L。0 蔗糖溶液。1L碳酸钾3溶液。1 柠檬酸三钠溶液。2L磷酸盐缓冲液。0 牛血清白蛋白溶液。金标垫处理液蔗糖吐温海藻糖0和1L。样品垫处理液曲拉通l和1L。聚酯膜。硝酸纤维膜

C膜。。吸水纸。。底板试纸条结构见图。标引序号说明:吸水滤纸垫;结合物垫附有C抗体与胶体金颗粒的交联体;侧向层析基质硝酸纤维素膜检测带附有地高辛抗体;质控带附有羊抗鼠二抗;衬底;吸水垫。图1试纸条结构试纸条的制备试纸条材料准备制金利用柠檬酸三钠作为还原剂把氯金酸还原为单质金的方法制备金纳米粒子。准备干净的锥形瓶和搅拌子向锥形瓶中加入双蒸水和氯金酸并置于磁力加热搅拌器上加热待瓶中液体沸腾6T2后加入柠檬酸三钠溶液最好现配现用边继续加热边搅拌直到瓶内液体状态变为透明的酒红色即为制得的金纳米粒子需质控金纳米粒子粒径为关闭热源后继续搅拌5n至液体保持为透明酒红色不变后停止取下锥形瓶待冷却后取出搅拌子金纳米粒子置于2℃8℃保存备用。金标垫制作聚酯膜裁切成550宽×长的预处理膜于金标处理液中浸泡再取出烘干备用。样品垫制作聚酯膜板裁切成70宽×长长条于样品垫处理液中浸泡再取出放置烘箱中烘干备用。吸水垫制作将纸板用定位裁切机裁切90宽×长长条备用。胶体金标记C抗体取上述制备的1L胶体金经3溶液调节H后加入C抗体工作液充分混匀后置于室温振荡反应1再向溶液中加入0的A溶液继续振荡反应04℃离心0沉淀重悬于A溶液中2℃8℃保存备用。喷金利用喷金划膜仪将上述制备好的金标记抗体的重悬液喷至准备好的金标垫上最终每个金标垫上的金标抗体重悬液的量约为67L再置于7℃烘箱中烘干裁剪至6m~70宽×长备用。划膜制备羊抗鼠二抗H和地高辛抗体工作液再将其通过喷金划膜仪喷至硝酸纤维膜上即制得印有分别代表质控线和检测线的两条隐形印迹线的C膜再置于7℃烘箱中烘干备用。试纸条的组装依次将上述制备好的样品垫金标垫膜和吸水垫粘于底板上每部分衔接处多出2于切条机上切成64宽×长即为所制的试纸条质控合格后置于恒温恒湿箱中密封保存备用。试纸条检测原理对样品中致病菌增菌培养提取采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的致病菌特异性检测引物进行扩增阳性扩增产物的两端会分别带有地高辛和。检测用试纸条上在吸水垫上含有金标记的C单克隆抗体可与R产物一条链上的C标记分子结合在T检测线位置上固定有抗地高辛抗体可与产物另一条链上的地高辛标记分子结合。在展开液的作用下R扩增产物首先与金标记的C抗体结合通过毛细作用带动胶体金向前端移动在经过固定有地高辛抗体的检测线位置时因带有地高辛标记而被地高辛抗体捕获在该位置上显示棕红色过量的金偶联物继续向上移动至固定有羊抗鼠二抗的C质控线位置与二抗结合从而显示出两条色带。如模板未扩增则无R产物与地高辛抗体及C抗体结合从而不能在检测线T线位置显示颜色。未参与反应的胶体金偶联物向上一直扩散至质控线C线被羊抗鼠二抗捕获而显色。7—