基因工程原理练习题及其答案(完整资料)

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基因工程复习题基因工程原理练习题及其答案(完整资料）(可以直接使用，可编辑优秀版资料，欢迎下载）题型：名词解释(10个）3０分；填空（每空１分）20分；选择题(每题1分）１0分；简答题（4个）20分;论述题（2个）20分。第一章绪论1．名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图,利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物(供体）的基因转移到另外一种生物（受体)中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作,以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义:基因工程。克隆：无性（繁殖）系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DＮA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。2．什么是基因克隆及基本要点?３。举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件.A）限制性内切酶和ＤＮA连接酶的发现（标志着ＤNA重组时代的开始)；B)载体的使用；C）１９70年,逆转录酶及抗性标记的发现。4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究:基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释:限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶.回文结构：双链DＮＡ中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后,可形成发夹结构。同尾酶:来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。同裂酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。平末端:DNA片段的末端是平齐的。限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）：在酶的最适反应条件下，在50μｌ容积中,６0分钟内完全切割１mgｌＤNA所需的酶量为1个酶活性单位（ｕnｉt或Ｕ)限制性核酸内切酶的星活性:指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应,导致出现非特异性的DNA片段的现象。连杆（linkeｒ）：化学合成的8~12个核苷酸组成的寡核苷酸片段.以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列,酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。衔接头(aｄaｐtor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。底物位点优势效应:酶对同一个DＮＡ底物上的不同酶切位点的切割速率不同。激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶.2．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的３个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I,IＩ,IＩＩ等.如：Eschｅrｉchiacoli用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。例：HindＩII从流感嗜血菌株(ＨaemophilｕsInflｕｅnzuｅ)d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Eschericｈｉａcoli中的抗药性R质粒上。前三个字母用斜体,其他用正体表示.如果酶存在于一种特殊菌株中,三个字母后加上菌株名称符号，名称最后部分往往包含罗马数字，表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。３。引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？若使用buffer不当,会有sｔarａcｔｉvitｙ，而ｓtaｒａcｔiviｔｙ是指限制酶对所作用的DＮＡ及序列失去专一性，当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用,而产生错误的结果。所以当DNＡ同时以两种限制酶处理时，选择可使两种酶之活性反应均可达75﹪以上的rｅstrictionbuffeｒ，若找不到适当的ｂｕffer则先加低盐的buffer使其中一酶作用后，在加入高盐buｆfeｒ使另一酶作用，若无法以盐的高低分别加入不同的bｕｆfer，则先加入一种bufｆer作用后,加3MNａOAc/95﹪aｌcoｈoｌ沉淀DＮA，再加另一种buffer作用。４．DNA片段之间的连接方式有哪些?具黏性末端的DNA片段之间的连接、具平末端ＤＮA片段之间的连接、DNA片段末端修饰后进行连接、DNA片段加连杆（linker）后的连接。5。什么是Ｋlenoｗ酶？有哪些活性?在基因工程中有什么作用？KlenowDＮA聚合酶是E．cｏliDNＡｐolymｅraseⅠ经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5’－－3’外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和３'--5’外切活性不受影响。也称为Kｌｅnoｗ片段（Kｌｅnowｆragment）,或Ｅ．colｉDNA聚合酶Ⅰ大片段。5®¢３¢聚合酶3®¢５¢外切酶无小亚基活性6。DNA聚合酶、RＮA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶有哪些主要特性?它们在基因工程中的主要用途分别是什么?第三章基因工程的载体１．名词解释：载体：指能够运载外源DＮＡ片段（目的基因）进入受体细胞,具有自我复制能力，使外源ＤNA片段在受体细胞中得到扩增和表达,不被受体细胞的酶系统所破坏的一类ＤNA分子.克隆载体:用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体.一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。表达载体：使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体.可将重组体DNA导入适合的受体细胞,使所载的目的基因能够复制、转录和翻译.穿梭载体：称双功能载体（bｉfunctionaｌvectｏr）。能在两种不同的生物体内复制的载体.质粒:指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子.松弛型质粒：拷贝数多于１0个的质粒。严谨型质粒；拷贝数为１至几个的质粒.接合质粒；指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触,以便将质粒DNＡ从供体细胞转移至受体细胞。如:质粒上的tra基因使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛,合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合.质粒的不亲和性;显性质粒;隐性质粒；质粒的迁移作用;多拷贝质粒；整合质粒;穿梭质粒；表达质粒；探针质粒；pUCl8质粒;pBR322质粒;溶菌生长；溶源生长；原噬菌体；烈性噬菌体；溶原化;柯斯载体或粘粒（coｓｍｉｄ）;cｏs位点；人工染色体2。作为工程载体必备哪些基本条件？3。试述质粒载体、噬菌体载体、柯斯载体、M１3单链丝状噬菌体载体和酵母人工染色体载体各自的组成特点及其在基因工程中的应用.4．简述质粒的生物学特性有哪些？5.构建人工质粒的目的?６.理想质粒载体应具备的条件及构建需遵循的原则是什么？7．λ-DNＡ作为载体的优点是什么？8。为什么野生型的l噬菌体ＤＮA不宜作为基因工程载体？该如何改造？第四章目的基因的制备1.名词解释：目的基因；基因文库ｃDNA文库；2.常规分离目的基因的方法有哪些？其原理分别是什么？3.克隆目的基因的方法有哪些？4．什么是基因组文库（genomiｃlibrarｙ)？构建基因组文库的原理,涉及哪些基本过程？它同遗传学上的基因库、cDNA文库有什么不同？第五章目的基因的导入和重组子的筛选1.名词解释：受体细胞;感受态细胞;转化；转导;转染；体外装配;转换子；重组子；转化率；负筛选；正筛选;ａ-互补筛选２。试述几种常用的转化方法。3。试述根据载体的选择标记进行重组子筛选的方法和原理。试述根据插入序列的表型特征进行重组子筛选的方法和原理。5．DNA片断之间的连接方式有哪些?各种连接方式的优缺点及DNＡ重组中需要注意什么问题?6.受体细胞选择的原则？第六章外源基因的表达1．名词解释:融合蛋白；分泌蛋白；包涵体；外源基因表达体系2．大肠杆菌表达载体构成的重要元件有哪些？3。试比较大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞基因表达载体各自组成的特点.4.真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题和高效表达的对策是什么?５.基因表达产物的检测方法有哪些?第七章基因操作的基本技术1．名词解释：分子杂交；探针；PCＲ;引物；随机引物；切口位移；热启动;缺口翻译;Ｎorthｅｒn印迹;Soｕｔｈern印迹2.DNA制备的基本步骤有哪些？３．碱裂解法和CTAＢ法的原理。４.凝胶电泳有哪几类?影响琼脂糖凝胶电泳的参数有哪些？5。PＣR的基本原理是什么？PCＲ反应体系的组成成份是什么?6．试述PCR反应的程序及参数。7．PCR反应引物设计需遵循的原则有哪些？8.试述核酸分子杂交的类型和基本步骤。9.探针标记的方法有哪些？１0．说明Sｏｕtｈｅｒn杂交的原理和方法。11。Nｏrtheｒn印迹与Sｏｕtherｎ印迹有什么不同?第八章植物基因工程及应用1．植物遗传转化方法主要有？2.基因枪转化的优点？3.天然的Ti质粒能作为表达载体使用吗?为什么？4．理想杀虫剂应具备什么特性？第九章动物基因工程及应用1。名词解释：转基因生物;共抑制效应；多效性胚胎干细胞2．转基因共机制效应的特征？３。导致转基因失活的原因可能有哪些？4.试述动物基因工程的载体有？5．如何筛选转基因多效性干细胞?第十章医学基因工程及应用1.名词解释:胰岛素；基因诊断；基因治疗；２。基因鉴定的作用？3。如何进行基因治疗？基因工程原理练习题及其答案一、填空题1。基因工程是____＿＿___年代发展起来的遗传学的一个分支学科.２.基因工程的两个基本特点是:（1)_____＿__＿＿＿_,（2)__＿______＿_。3．基因克隆中三个基本要点是：_____＿_____；＿_____＿＿_和___＿___＿__。４．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段,可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的_＿＿__＿_____。5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的,第一个大写字母取自＿＿_____，第二、三两个字母取自_______＿＿，第四个字母则用____＿＿_____表示。6．部分酶切可采取的措施有：（1)__＿＿__＿＿＿＿_＿(2）____＿__＿___（3）_______＿__＿等.7．第一个分离的限制性内切核酸酶是__＿______＿_；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是＿_＿____＿___＿＿。８．限制性内切核酸酶BsuRI和HａeⅢ的来源不同,但识别的序列都是_＿___＿___,它们属于___＿_________。9．DNA聚合酶I的Kｌeｎoｗ大片段是用__＿_____＿_＿__切割DＮA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段,具有两种酶活性：（1）____＿＿______；(2）_＿______＿____＿__的活性.10．为了防止DNA的自身环化,可用_＿____＿＿___＿_去双链DNA＿___＿__＿＿_＿＿______。1１．EGTＡ是_____＿___＿__离子螯合剂。12．测序酶是修饰了的Ｔ7DＮA聚合酶，它只有_＿____＿______酶的活性，而没有_______酶的活性。13．切口移位（nｉcktranslation)法标记DNA的基本原理在于利用__＿_＿____的______＿和＿_＿＿__的作用。1４．欲将某一具有突出单链末端的双链ＤNＡ分子转变成平末端的双链形式,通常可采用____＿____或____＿_＿__＿＿_＿__.15．反转录酶除了催化ＤNＡ的合成外，还具有＿＿_＿_＿____＿_的作用，可以将ＤＮA—ＲNA杂种双链中的___＿＿______水解掉。1６．基因工程中依据应用对象分有3种主要类型的载体：________＿_＿＿__＿、_＿____＿__＿_＿_、__＿________＿＿_。17.就克隆一个基因（ＤNA片段）来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分:＿_________＿____、_＿______＿__＿_、_＿_＿__＿__＿_＿__。另外,一个理想的质粒载体必须具有低分子量。18。一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫.１9。ｐBR3２2是一种改造型的质粒,它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。2０.ＹAC的最大容载能力是,BAC载体的最大容载能力是。21。ｐSＣl01是一种复制的质粒.22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。ｐUＣ系列的载体是通过和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp抗性基因则是来自。2３．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。24.野生型的M１3不适合用作基因工程载体，主要原因是和.2５．黏粒(cｏｓｍiｄ)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。2６。野生型的l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是:(1）(2）（3)。2７。噬菌粒是由质粒和噬菌体DＮＡ共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。2８.l噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DＮA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。29。在分离DNA时要使用金属离子螯合剂,如EDＴA和柠檬酸钠等，其目的是.3０.用乙醇沉淀DＮA时，通常要在DNＡ溶液中加人单价的阳离子，如ＮaCl和NaＡc,其目的是.31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：（1）（2）（３）（4）。32．Clａｒk发现用ＴaqDNA聚合酶得到的ＰＣR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆ＰCＲ产物的.33．在cDNＡ的合成中要用到Ｓ1核酸酶,其作用是切除在。34．乙醇沉淀ＤNA的原理是。3５．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件:(1)_＿＿＿＿____＿_＿＿__＿＿_____＿_______＿＿(２）___＿__＿__＿_____＿＿＿_______＿_＿_(３）__＿___________＿_＿_＿____＿＿________.３6.受体细胞的感受态是__＿_____＿＿__________＿___＿＿_＿_＿_____。3７．DNＡ重组连接的方法大致分为四种：（1)__＿________＿_(2）＿＿___＿＿_＿＿___＿＿(３)＿＿__＿__＿__＿__＿_____＿＿______(4）_________＿_______＿＿___＿____。３8.将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个__＿＿_＿__＿__，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个＿_＿____________＿_。３9．将含有一个mRNA的DＮA拷贝的克隆称作一个_＿_____＿＿___，源于同一批ＲＮA制备物的克隆群则构建了一个____＿____________。40．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成,用________＿＿_可以将这段DＮA进行百万倍的扩增。41．人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为___＿＿＿＿____时吸附DNA，__＿_______＿时摄人DNA。42.目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为:（1）________＿____＿_（2)__________＿____（3）____＿＿＿__＿____＿____(4)____＿________________＿__＿___等.43。PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法,它适合于＿____＿_____＿___＿____＿_____＿。４4。核酸杂交探针可分为两大类:ＤNＡ探针和RNA探针。其中DＮＡ探针又分为___＿＿_____探针和___＿＿_______＿＿_＿__探针。４5.如果用限制性内切核酸酶切割双链ＤNA产生5'突出的黏性末端，则可以用＿___＿___＿＿进行3’末端标记.如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3’突出的黏性末端，可以用______＿＿___＿＿＿____进行3'末端标记。46．单链DＮA探针的标记可以采用下列方法：（1)_＿_______＿＿＿__＿__＿_＿_＿______＿_＿__＿__（2）＿__＿_＿_____＿__＿___________（３)_______＿_＿＿＿____＿_______＿___＿________。４７。根据Nｏｒｔｈeｒn杂交的结果可以说明：_____＿___＿＿_______＿________________＿_＿____。48.差示杂交(diffeｒenｔialhybｒidizａｔion）技术需要__＿＿＿____＿_______＿_____＿_＿_____＿_。４9.RＮA分子经凝胶电泳后按大小不同分开,然后被转移到一张硝酸纤维素膜（尼龙膜）上，同一放射ＤNA探针杂交的技术称__＿___＿___＿___＿__＿__＿_＿。50。在_______＿_＿_____＿技术中,DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜（或尼龙膜)上，然后与放射性的DNＡ探针杂交。51。可用T４DＮA聚合酶进行平末端的ＤNＡ标记，因为这种酶具有_________＿＿_和＿_＿＿_＿_的活性。５2。根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素：(1）_____________＿_（2)＿____＿＿__＿＿_＿__＿____＿___（３）____＿______＿＿_______＿＿.５３．Northerｎ印迹和Ｓouｔｈerｎ印迹有两点根本的区别：（1）＿＿_______＿_________＿_______________＿_____＿__＿_＿_______＿___＿_＿_____＿____（２）__________＿_＿_＿_＿＿___＿_____________＿＿_＿_______＿_＿＿_＿____＿____＿_____＿＿＿_.５4.放射免疫筛选的原理基于以下三点：(1）_____＿_____＿＿＿_＿______＿_＿__＿______(２）＿_＿__＿____＿_＿_____＿___＿_＿__（3）_＿_＿＿＿＿＿___＿__＿_＿_____＿___＿___＿_＿＿。

答案１。702．(1）分子水平上的操作;(２）细胞水平上的表达3.克隆基因的类型；受体的选择;载体的选择4．限制性酶切图谱５．属名的第一个字母;种名的前两个字母；株名6。(1）减少酶量；（2）缩短反应时间;(3）增大反应体积７．EｃoK；EcｏＲl８．GGCＣ;异源同工酶9．枯草杆菌蛋白酶;(1）5'—3’合成酶的活性;（2）３’－5＇外切核酸酶10。碱性磷酸酶；５’端的磷酸基团１１.Cａ2+1２.5＇—3’合成;3’-5’外切１3.DNA聚合酶I:５’一3’外切核酸酶；5'一3’合成酶14．S1核酸酶切割;DNＡ聚合酶补平１5．核酸水解酶H；RNA16．质粒DNA；病毒DNＡ;质粒和病毒ＤＮＡ杂合体1７。复制区：含有复制起点；选择标记:主要是抗性基因；克隆位点:便于外源DNA的插入１8.质粒消除（或治愈)19，pMBl；pＳCl０1；pSＦ2124(Ｒ质粒)2０.1000kｂ；300kb21。严紧22．ｐBＲ322和M１3；pMＢl;转座子2３．它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNＡ的扩增;对某些噬菌体(如l噬菌）的遗传结构和功能研究得比较清楚,其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽24.没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记25．质粒;l噬菌体；４5２6.(1）分子量大,(2)酶的多切点，（3)无选择标记27．复制区；IＧ区28．7５％～105%29．螯合Mｇ2+离子,抑制核酸酶的活性30．中和DNA分子的负电荷，增加DＮＡ分子间的凝聚力31.（1)合成探针;(2)合成cＤNA；(3）用于PCＲ反应；（4)进行序列分析３2.T—载体３3．第二链合成时形成的发夹环•３4。乙醇使DNA分子脱水35.（1)保持正确的可读框（2）能够使其转录的启动子(3）具有翻译的起始和终止信号36.接受外源DNA的生理状态3７。（1）黏性末端连接；（２）平末端连接;（3)同聚物接尾连接；（4）接头连接法38.基因组DＮA克隆；基因组DＮA文库３９.cDNA克隆；cDNA文库40．聚合酶链式反应(PCR)４1.0°Ｃ；42°C42．（１)遗传学方法；(２)物理筛选法；（３)核酸杂交法；(4）表达产物分析法43．插入外源片段的种类较多,大小又极为相似的重组体的筛选４4.基因组DNA；cDNA45．Klenｏw酶填补的方法；T4DNA聚合酶4６．（1）用Ｍ13噬菌体载体合成单链ＤNA探针；(2）从mRＮA反转录合成单链cDＮA探针;（3)用不对称PCR合成单链ＤNA探针4７．外源基因是否进行了转录４８.两种不同的细胞群体能够表达不同的基因，即在一个群体中能够表达一些基因，而在另一个细胞群体中不能表达这些基因４９．Ｎoｒthｅrｎ印迹50．Southern印迹51．5’®３’合成酶;3’®５’外切核酸酶52．（１）克隆的是完整的基因；（2)使用的是表达载体；（３）不含内含子53．（1)印迹的对象不同：Norｔhern是ＲNA,Ｓｏuthern是DNA；(2）电泳条件不同,前者是变性条件，后者是非变性条件５４.（１)抗体能够被吸附到固体支持物上;（2)同一个抗原可以同几种抗体结合；(３)抗体能够被标记

二、选择题(单选或多选）1。因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是（）（a）Ａ。Koｒnｂerg（ｂ)W。Gilｂert（c)P。Berg（d）B.McCｌｉntｏcｋ２。第一个作为重组ＤNA载体的质粒是（）(a）pBR322（ｂ)ColＥl(c）pSCl01(d)pUCl83．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当。（a）由作用于同一DNＡ序列的两种酶构成（b）这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶（ｃ)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(ｄ）不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统4.Ⅱ型限制性内切核酸酶：(）（a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列（ｂ)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供（c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(ｄ）有外切核酸酶和甲基化酶活性(e）仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供5．下面有关限制酶的叙述哪些是正确的？（）（a）限制酶是外切酶而不是内切酶（b)限制酶在特异序列（识别位点）对ＤＮA进行切割(c）同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的（ｄ）一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNＡ，产生黏末端（e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端6.第一个被分离的Ⅱ类酶是：（）(a)EｃｏK（b）HｉndⅢ（c）ＨindⅡ(d）EｃoＢ7．在下列进行DＮＡ部分酶切的条件中，控制那一项最好？(）（a）反应时间（b）酶量（c）反应体积(d)酶反应的温度8．在下列试剂中,那一种可以螯合Ｃa2＋离子?(）(a）EＤTA(ｂ)柠檬酸钠(c)SDS（ｄ）EGＴA9．在下列工具酶中，那一种可以被EGTＡ抑制活性?（）(a）S1单链核酸酶（b)末端转移酶(c）碱性磷酸酶(d)Bal31核酸酶１０．限制性内切核酸酶可以特异性地识别：()（a）双链ＤNＡ的特定碱基对(b)双链DＮＡ的特定碱基序列（ｃ）特定的三联密码（d)以上都正确１1.下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是(）。(a)Saｕ3AI（b)E。coＲI(c）hindIII(ｄ)Sau3Ａ1１2．限制性内切核酸酶的星号活性是指：()（a)在非常规条件下,识别和切割序列发生变化的活性。(b）活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同13．下面哪一种不是产生星号活性的主要原因？（）(a)甘油含量过高(b）反应体系中含有有机溶剂(c）含有非Mｇ2＋的二价阳离子（d)酶切反应时酶浓度过低14．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当（ａ)由作用于同一DNＡ序列的两种酶构成(ｂ)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶(c）这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对ＤNＡ进行修饰（d）不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统15．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用（）（a）T4DＮA聚合酶（b)Klenow酶。（c）大肠杆菌ＤＮA聚合酶I(d)T7DNA聚合酶16．末端转移酶是合成酶类，（)（a)作用时不需要模板（ｂ）在Ca2＋的存在下，可以在突出的3，末端延长ＤNＡ链(c)在Ca2+的存在下，可以在隐蔽的3，末端延长DＮA链（ｄ）上述说法有两种是正确的17．在基因工程中，可用碱性磷酸酶（）(a)防止ＤNＡ的自身环化（b)同多核苷酸激酶一起进行ＤNＡ的5，末端标记（c）制备突出的3，末端（ｄ)上述说法都正确1８．下列酶中，除（)外都具有磷酸酶的活性（a)λ核酸外切酶（ｂ）外切酶Ⅲ（c）单核苷酸激酶(ｄ）碱性磷酸酶19。下列哪一种酶作用时需要引物？()(a）限制酶（b）末端转移酶(c)反转录酶（d）DNA连接酶20．S1核酸酶的功能是（)（a）切割双链的DNＡ（b）切割单链的RNA（c）切割发夹环(d）以上有两项是正确的21。Klｅnoｗ酶与DＮA聚合酶相比,前者丧失了(）的活性.（a）5,——３，合成酶，(b)3，-—5，外切酶(c）5，-－-3,外切酶(d)转移酶22．下面关于松弛型质粒(relaxedｐlasmiｄ）性质的描述中，()是不正确的(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制,而不受染色体复制机制的制约,因而有较多的拷贝数(b）可以在氯霉素作用下进行扩增(c)通常带有抗药性标记(ｄ）同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子23。基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少,在下列载体中只有（）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体(a）pBR３２２(b)pSＣl０1（c)pＵBｌｌ0（d）ｐUCl824。下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?（)（a）质粒（b）黏粒（c)酵母人工染色体(YAC）(d）l噬菌体(e）cＤNA表达载体２5。松弛型质粒：（)（ａ）在寄主细胞中拷贝数较多（b）可用氯霉素扩增(c）一般没有选择标记（d)上述(a）、(b)两项正确2６．CｏｌEｌ是惟一用作基因工程载体的自然质粒,这种质粒:（)（a）是松弛复制型（b)具有,四环素抗性(c）能被氯霉素扩增（d)能产生肠杆菌素27。同一种质粒ＤNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：（）(a）OCDNA>ＳCＤNA>ＬＤＮA（b)SCDNA〉ＬDNＡ〉OCＤNA(c）LDＮA〉ＯＣＤNA>SCDNA(d)SＣDNA>ＯCDNＡ＞LDＮA28．ｐＢＲ322是一种改造型的质粒,含有两个抗性基因,其中四环素抗性基因来自：()(a）CoｌEl（b）Rｉ质粒（c)pSCl01(d)pＵＣl82９．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确？(）（ａ）在不同的宿主中具有不同的复制机制(b）在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点（c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率30．能够用来克隆3２ｋb以下大小的外源片段的质粒载体是(）（ａ)charomｉd(ｂ）pｌａsmid（C）cｏsｍid(d)phagｅｍid31。第一个作为重组DNA载体的质粒是()（a)pBR3２2(b)ColEl(c）ｐSＣl０1(d)pUCl8３2．Ti质粒:()（a)可从农杆菌转到植物细胞中（b)作为双链ＤNA被转移(c）在植物中导致肿瘤(ｄ)介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素（e）需要细菌的ｖiｒ基因帮助转移（f)在植物细胞中作为染色体外质粒33．黏粒(cosmｉｄ)是一种人工建造的载体，(）（ａ)它具有COS位点，因而可进行体外包装（ｂ)它具有质粒DNA的复制特性(c）进入受体细胞后,可引起裂解反应（d）进入受体细胞后,可引起溶源化反应34．有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Gｌｂerｔ）和酶学序列分析法(Sanｇer）.酶学测序法的基本原理/优点是：（）（a）碱基与特殊染料间不同的相互作用（b）一个合成引物的延伸和ＤＮA修复合成的可靠终止（c）限制性位点与ＤNA末端标记的相关性（ｄ）可同时对DＮA双螺旋的两条链进行测序（ｅ)反应是DNA特异的,ＲNＡ不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支。35．关于cDNA的最正确的说法是：(）（a)同mRNA互补的单链DNA（ｂ）同mRＮA互补的双链ＤNA（c）以mRＮA为模板合成的双链DＮA(d）以上都正确3６．用碱法分离质粒DNＡ时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为:（）(ａ）染色体DNA断成了碎片(b）染色体DNA分子量大,而不能释放(c）染色体变性后来不及复性（d)染色体未同蛋白质分开而沉淀37.关于碱解法分离质粒ＤＮA，下面哪一种说法不正确？()(a）溶液I的作用是悬浮菌体(ｂ）溶液Ⅱ的作用是使DNA变性(c)溶液Ⅲ的作用是使DNA复性(d）质粒DＮA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性3８。Clark做了一个有趣的实验，发现ＴaｑDNA聚合酶可以不需要模板,在双链DNA的末端加一个碱基,主要是加(）。（ａ)dＧTP(ｂ）dATP（c）ｄCTP（d）dTＴP３９．根据构建方法的不同,基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中,()属cDNＡ文库（a）ＹAC文库（b)MＡC文库(c）扣减文库（d）BAC文库4０.下面关于多克隆位点（multipｌecｌoｎesite，MCS)的描述，不正确的—句是()（a)仅位于质粒载体中（b)具有多种酶的识别序列(c)不同酶的识别序列可以有重叠(d）一般是人工合成后添加到载体中4１．在cDＮA技术中，所形成的发夹环可用（)(a）限制性内切核酸酶切除(b)用3¹外切核酸酶切除(c)用S1核酸酶切除（ｄ）用5¹外切核酸酶切除42．在DNＡ的酶切反应系统中，通常：()(a)用SＳＣ缓冲液(b)加入Mｇ２+作辅助因子(c）加入BSA等保护剂(d）上述说法中，有两项是正确的43。黏性末端连接法，不仅操作方便，而且（）（a)产生新切点（b)易于回收外源片段（c）载体不易环化（d）影响外源基因的表达４4．在下列表型中，()是基因工程上理想的受体菌表型（a）ｒ+m＋rec*(b）r—ｍ-rｅｃ－(C）r—m—reｃ＋(d)ｒ＋ｍ+rec-45．关于DNA接头在基因工程中的作用,下列说法中哪一项不正确?(）（a）给外源ＤNA添加适当的切点（b）人工构建载体（c）调整外源基因的可读框（d)增加调控元件４6.cＤNA文库包括该种生物的（）(a）某些蛋白质的结构基因(b)所有蛋白质的结构基因（ｃ)所有结构基因（d）内含子和调控区47.下列关于建立cＤNＡ文库的叙述中，哪一项是错误的？（)（a）从特定组织或细胞中提取ＤNA或ＲNA（b）用反转录酶合成ｍRＮA的对应单链ＤNA(c）以新合成的单链ＤNA为模板合成双链DＮA（d)新合成的双链ＤNA甲基化４８．下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的？()(a）操作方便(b)易于回收片段(c)易于定向重组（ｄ）载体易于自身环化，降低重组率４９．关于感受态细胞性质的描述,下面哪一种说法不正确?（）（功具有可诱导性(b)具有可转移性(c)细菌生长的任何时期都可以出现（d）不同细菌出现感受态的比例是不同的5０．下面关于用T4多核苷酸激酶标记5＇端制备探针的描述中(）是不正确的。（a)既能标记DＮＡ,又能标记ＲＮA（b）既能标记双链DNA又能标记单链DNA（c)只能标记突出的5＇端不能标记其他类型末端(d)DNA或RNA必须有5'—OH的存在５1．Sｏｕｔheｍ印迹的DＮＡ探针（）杂交.（a)只与完全相同的片段（b）可与任何含有相同序列的DＮＡ片段(c）可与任何含有互补序列的DNA片段’.（d)可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段(e)以上都是5２．用下列方法进行重组体的筛选,只有()说明外源基因进行了表达.(a)Soutｈem印迹杂交（ｂ）Ｎortｈem印迹杂交（c)Weｓtern印迹（ｄ)原位菌落杂交53．下列哪一个不是Souｔheｒn印迹法的步骤？()（ａ）用限制酶消化ＤNA(a)DＮA与载体的连接（c)用凝胶电泳分离ＤNＡ片段（ｄ)ＤNA片段转移至硝酸纤维素膜上(ｅ）用一个标记的探针与膜杂交54。报告基因（）(a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列（b）以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区(c）能用于检测启动子的活性（d）能用于确定启动子何时何处有活性55．在利用ｌacZ失活的显色反应筛选法中,IＰTＧ的作用是（）（a）诱导宿主的α肽的合成（b)诱导宿主的ω肽的合成（c）作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂56.切口移位是指在()作用下，使（)带上放射性标记。（ａ）DNA聚合酶I,RNA(b）DNA聚合酶I,DNＡ(c)DＮA聚合酶Ⅲ，ＲNA（d）ＤNA聚合酶Ⅲ,DＮA57．用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的（）（a）DNA(ｂ）RNＡ（c)抗体(d）抗原58．Sｏｕtｈｅrｎ印迹是用DNA探针检测DNA片段，而Northern印迹则是:（）（a)用ＲＮA探针检测DNA片段（b）用ＲNA探针检测RNA片段(ｃ）用DＮＡ探针检测RNA片段（d)用DNA探针检测蛋白质片段59.用免疫化学法筛选重组体的原理是()（a)根据外源基因的表达(ｂ)根据载体基因的表达（c)根据mRＮＡ同DNＡ的杂交(d）根据DNA同DNA的杂交6０。随机引物标记探针,下列各项中哪一项是不正确的?()(a）双链ＤNA、单链DNＡ、RＮA都是可以标记的（b)不需要用DnａsｅＩ预处理(c)反应时可用Klｅnow酶（d)反应时可用DNA聚合酶161.在切口移位标记DNA探针时只能使用（）（a）Kｌｅnow酶（b)DNA聚合酶I(c）DＮA聚合酶Ⅱ(ｄ）ＤNA聚合酶Ⅲ6２.要对一双链的DNA分子进行3¹末端标记,可用（)（a)Klｅnow酶（b）DNA聚合酶I（ｃ）T４DNＡ聚合酶（d)T7DNA聚合酶

答案１.c；2.c；３．b;４．ｂ５．b,C，d，e；6．ｃ；7．b;8。d;9．ｄ；10．B；１1。d;１2。a；13。d；14.ｂ１5．d;1６.c；１7．ａ,b；１８。a;19.c;２０.d;21。c;２２。C;23．ｂ；24.C；25．d；2６．a，C,d；27．b；28.c;2９。b；３０．a；３1．c;32。a，c，ｄ,ｅ,３3．a,b,c；34.b；3５。c；36．ｃ；37．d；38.b;39.c；40。a；41。ｃ;42.ａ，ｂ，c；43。b；44．ｂ；４５．d；46。a；47.a；48.c；４９．c；50。b；51．c;５２。ｃ;53.b；５4.ａ，ｃ,d；５５．a；56．b；５７。a,b；58．ｃ；59。ａ；60。d;61.b；62.c;

三、简答题1.说明ＳaｎｇerDＮA测序法的原理。2。某学生在用ＥcoRＩ切割外源DＮＡ片段时，出现了星号活性,请分析可能的原因?3.在序列5'—ＣGＡACATＡTGＧAＧT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,该位点的序列可能是什么？４．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列:GAAＴCG，AＡATTT，GATAＴC，AＣＧGCA？为什么？５．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时,若要进行双酶切,应采取什么措施？为什么？6.为什么反转录酶在聚合反应中会出错?7．什么是测序酶（sｅqｕｅnａseTM）？8。什么是S1核酸酶作图（Ｓ1nｕcｌeaｓemａppiｎg）？９ＹAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，ＹＡC具有优越性?１0。列举质粒载体必须具备的4个基本特性。11．什么叫穿梭载体？1２.如何将野生型的ｌ噬菌体改造成为一个理想的载体？1３．ＰＣＲ的基本原理是什么?用PCＲ扩增某一基因,必须预先得到什么样的信息？14。cDNA克隆与基因组克隆有何不同？1５.怎样将一个平末端DＮA片段插入到EｃｏＲI限制位点中去?1６.简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。17。酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?18。何谓YAC？主要特性是什么？1９。Mｕllｅr的ＰCＲ反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里？20。欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物（如Ｅ.coli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题？21。假定你分离到一个E。ｃolｉ的Thｙ—突变体,并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因,测定突变的序列。（注：E.coｌi野生型的ThyA基因的序列是已知的）22．你在做Ｓouthern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案,下面一步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶，使ＤNA变性为单链.为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNＡ从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交,最后发现放射自显影片是空白。错在哪里？2３.切口移位（niｃktranｓlａtｉon)标记探针的主要步骤有哪些?24.用EcｏRＩ和HｉｎdⅢ分别切割同一来源的染色体DＮＡ，并进行克隆,在前者的克隆中筛选到Ａ基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。25。什么是Wｅsｔerｎ印迹?它与Southｅｒｎ印迹有什么不同?26。用一限制性内切核酸酶切割Lac＋Teｔ＋的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DＮA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端,然后重新连接成环,转化Lac-Teｔs受体菌,筛选Tｅｔr转化子，问：Lac的基因型是什么？并说明原因。2７．在基因工程中,为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物,为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在ｃDNA前加上细菌的启动子?

答案1．答:SangerＤＮA测序法是建立在两个基本原理之上:(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由５’端向３'端聚合（DＮA聚合酶参与了细菌修复DNＡ合成过程）；(2)可延伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的３’羟基末端，因此会终止聚合反应的进行.如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得４组长度不同的DNA片段.通过比较所有ＤNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。2．答：盐离子浓度不对，温度不对,甘油浓度过高。3.答：回文序列是:5'—CATAＴG-３,4．答：GATAＴＣ;AAATTT,因为它们是回文序列.5.答：注意星活性,先低盐,后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活,再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。6．答：由于反转录酶缺少在E．cｏliＤNA聚合酶中起校正作用的3’-5’外切核酸酶活性,所以聚合反应往往会出错,在高浓度的ｄＮＴP和Mg2＋下，每５00个碱基中可能有一个错配。７.答:所谓测序酶即是修饰了的Ｔ7ＤNA聚合酶,是采用缺失的方法,从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸,这样使T7DＮA聚合酶完全失去了3'－5’的外切核酸酶活性,只有５'－-—3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～９倍，测序时常用此酶。８.答:Ｓ1核酸酶作图是一种对RＮA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法.9.答:YAC带有天然染色体所有的功能元件,包括一个着丝粒,一个DＮA复制起点，两个端粒。YAＣ能够容纳长达几百kｂ的外源DNＡ,这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。1０．答：（1）独立复制；（２）有选择标记;（3)有独特的酶切位点;（4）能转化但不扩散.11．答：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNＡ片段的杂种质粒,有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以,很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭）。12．答：（1）削减分子量（除去非必需区和整合区）；(2)削减酶切位点；(3）添加选择标记；(４）引入终止突变1３．答：（1）DＮA半保留复制的原理，在体外进行ＤNA的变性、复性和引物延伸。(２)至少要预先知道足够合成一对引物的靶ＤNA序列。１4。答：基因组克隆包含所有不在cDＮＡ中出现的内含子。1５．答：化学合成一些长为10bp含有EcｏRＩ识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来,如果用EcｏＲＩ切割这种连接片段,就会产生ＥcoＲI的单链末端.这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。16。答：（1）CＯＳ位点可以自身环化；(2）可以利用ＣOS位点包装l噬菌体颗粒；(3）可以感染寄主细胞；（4）利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。17．答:（1)着丝粒;（２）端粒；(3)ＡRS序列。1８。答:（1）含有来自其他生物DNＡ的酵母人工染色体，叫ＹAC；(2）主要特性是可以克隆较大的外源片段。19.答：PCR用双引物，体内复制用单引物。20。答：应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。21。答：为了扩增突变体的thyA基因,先设计一对引物,其中一个引物的序列与thｙＡ基因的5’端相同,另一个引物同该基因的3'端互补。在引物的5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序.22．答：如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。23．答:(１）DNaｓｅＩ造成切口；（2)DＮA聚合酶IIＩ的5’®３’外切核酸酶进行切割；(３）DＮＡ聚合酶Ⅲ的5’®3’合成酶进行修补；（4）在修补过程中,随着切口（ｎick）的移动，将放射性的底物掺人到双链ＤＮＡ中。２4.答：原因是：ＨindⅢ的切点在A基因内。2５.答：Ｗestern印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Wｅｓtern印迹中使用的探针是抗体(蛋白质）.26。答：基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变,所以Lａc的基因是缺陷的。27．答:这是因为细菌没有内含子剪接系统,并且不能识别真核生物的启动子之故.

四、问答题：1．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。2．什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？3.影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？４。什么是Ｋlenｏｗ酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5.细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途?６.λ外切核酸酶(1amｂｄａｅxｏｎuｃlease）基本活性是什么？在基因工程中有什么应用?7.Mn２+、Mg２+对DnaseI(deoxyribonucleaｓe？)的活性有什么影响？ＤnａseI在基因工程中有什么作用?８。质粒如何维持在细胞中的稳定?9．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的.请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面？１０。为什么野生型的l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？１1．什么是蓝白斑筛选法?12.蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性？13．M１3系列载体具有哪些优缺点？1４．黏粒载体具有哪些特点与不足?15。辅助噬菌体DＮA和相应的噬菌粒是如何协同工作的？16．如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因？１７．什么是基因文库？1８．什么是基因组文库(ｇｅnｏmｉｃlibｒarｙ）？构建基因组文库，涉及哪些基本过程？它同遗传学上的基因库有什么不同？1９．什么是ｃＤNA文库(compｌemｅnｔＤNAlibｒarｙ)?同基因组文库有何差别?20．黏性末端连接法是最常用的连接方法,具有许多优点,但是也有一些不足，请指出这些不足之处。21．什么是同聚物加尾连接法(hｏmｏｐｏｌｙｍeｒtailsｊoｉning）？用何种方法加尾?具有哪些优缺点？2２。何谓接头连接法(１ｉnkeｒligaｔiｏn）?２3。什么是同裂酶？为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高？24。为了大量获得许多用于生化鉴定的产物,你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?25。某一质粒载体具有Ｔｅｔr和Kａnr的表型,在Kan抗性基因内有一BglI的切点。现用BglI切割该载体进行基因克隆，问:(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？（3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？２6．以pBR32２DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DＮA时,可采用环丝氨酸富集法筛选重组体,说明其基本原理和基本操作过程.27．放射性抗体检测法(rａdioaｃｔｉvｅａnｔｉｂodyｔest)的基本原理是什么?28．什么是随机引物（randompｒimer）?如何标记DNA？２9.什么是印迹（bｌotｔing)杂交?30.什么是原位菌落杂交（colonyｈybridization）？3１。说明Southern杂交的原理和方法.32．Noｒthern印迹与Southｅrn印迹有什么不同?33.建立了一个基因文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆？答案：1.答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名＋种名+株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则：3-4个字母组成，方式是:属名＋种名＋株名＋序号；首字母:取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母:取种名的第一个字母，斜体小写;第三字母:（1)取种名的第二个字母，斜体小写;（2）若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。２。答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性,但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性.条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变,改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种:(１）高甘油含量(〉5％，v／v）;(2)限制性内切核酸酶用量过高（〉10０U/ugＤNA）；（3）低离子强度（<2５mmol/L）；（4）高pＨ（８．0以上);（5)含有有机溶剂，如DMＳO，乙醇等；（6）有非Mg２＋的二价阳离子存在(如Mｎ2+,Cu2+，Ｃ0２+，Zｎ2+等)。3．答：影响DNＡ连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以1２°C一15°C最好,这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性.平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DＮA的退火问题,但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高１0－1０0倍。ＤNA中有残存的tRＮA不会抑制ＤNＡ连接酶的活性，但是，如果NaCｌ的浓度高于１5０mmｏl/Ｌ，则对连接反应有强的抑制作用。另外反应体系中有NＨ４+离子的存在，对Ｅ。coｌiDNA连接酶具有激活作用.Ｅ。coliＤNA连接酶需要NAD+作辅助因子,而T４ＤNA连接酶需要ATP。4．答：Kｌenoｗ酶是1９74年Kｌenｏｗ用枯草杆菌蛋白酶水解DＮA聚合酶I，得到两个片段,其中大片段的分子量为75kDａ，它具有5'—3＇聚合酶和3'-5’外切核酸酶的活性，小片段具有５'-３’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNＡ聚合酶Ｉ中会降解５＇引物的５'－3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用.Kｌenoｗ酶主要有下列用途：（１）修复反应，制备平末端可用Klｅｎow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5＇或3'突出末端,制备平末端,这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNＡ片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备３’末端标记的探针。用Kｌenow酶修复5’突出末端的反应主要是利用了Klｅｎoｗ酶的DNA聚合酶活性,是填补反应；而修复３’突出末端则是用Ｋlenow酶的3＇—5’外切核酸酶的活性，是切割反应.用Klｅnow酶的切割反应来修复3＇突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。（2）标记DＮA３＇突出末端（ｐrotrｕdinｇend）该反应分两步进行：先用３＇-5'的外切核酸酶活性除去3＇突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物(-32ｐ—dＮTP）存在下,使降解(3’—5＇）作用与聚合(5’—3＇）作用达到平衡.这种反应也叫交换或取代反应（exｃhaｎge／rｅｐlａｃemeｎtrｅaction)。不过这一反应用T4DＮA聚合酶的效果更好，因它的3'-5’外切核酸酶活性较强.（3)其他的一些用途:包括用双脱氧末端终止法进行ＤＮA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(ｐriｍerｅxｔension)制备单链DNA探针等。5．答：主要差别是：CIP68°C时失活,而BＡP６8°Ｃ稳定，且耐酚抽提。应用:(1）ｄｓDNA的5'端脱磷酸，防止ＤＮA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应.(2)DNＡ和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。6.答：外切核酸酶是从噬菌体感染的E．ｃoli中分离纯化的，能够从双链DNA上依次切下5’单核苷酸，作用底物是双链ＤNＡ的５'磷酸末端,不能切割羟基化5’端.该酶虽然能切割单链ＤNA,但效率较低(下降200倍）。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的.在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5’末端,以便让末端转移酶加尾。7．DＮaｓeI是一种内切核酸酶，在Mg2+存在下,DＮａsｅＩ随机切割DNA两条链中的任意一条链；当Ｍn2＋代替Mｇ2+时,DNａseI几乎是在双链ＤNＡ两条链相对的位置上打开缺口，使双链ＤNA断裂,产生的末端几乎是平末端或只突出1～2个核苷酸的ＤＮA片段。ＤNａseI有许多用途:(1）在切口移位标记中，制造切口;(2）在足迹法中保护DＮA;(3）除去RＮＡ制备物中的DNA；（4)体外转录中除去DNA模板;（5）检测染色体中的转录活性区；(6）产生可在噬菌体Ｍ13载体上进行测序的随机克隆。8.质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定：(1）多聚体质粒的分解如果质粒在复制时形成多聚体的话,在细胞分裂过程中质粒丢失的可能性就会增加。一个多聚体是由多个单体相互连接而成的。多聚体的形成可能是由于在复制终止时发生错误或者是由于单体间重组的结果。由于多聚体在细胞分裂时将作为一个质粒进入一个子细胞，这样，多聚体的形成就大大降低了质粒的有效拷贝数，因此，多聚体也就大大增加了细胞分裂时质粒丢失的机会.为了避免这种情况的发生，很多质粒都具有位点专一性重组的系统，可以破坏多聚体。（2）分离（parｔitｉoniｎｇ)质粒通过一种分离系统来防止在细胞分裂过程中质粒的丢失,这种机制保证在细胞分裂过程中每个子细胞至少可得到一个质粒拷贝，这是由称为par功能（Parfunｃｔioｎs）完成的.所谓pａr功能是指某些质粒，包括F、Ｒ1等质粒上具有的一些短的区域，这些区域能够增强质粒拷贝的合适分配。如果从质粒中将这种区域拿掉，质粒丢失的频率就会相当高。已经深入研究过Ｐ1质粒的分离系统,发现Ｐ1质粒的分离系统由一个顺式激活pａr序列和两个蛋白ParA和,PａrB的基因构成,其中一个蛋白同ｐar位点结合.关于par位点是怎样增强质粒适当分离的机制有两种模型，按照这两种模型，细菌的膜具有真核生物有丝分裂纺锤体的功能,在细胞分裂之前将质粒分开。par位点是质粒同质膜结合的区域，在细胞分裂时,由于膜的生长,质粒的两个拷贝就被拉到两个子细胞中。这两个模型对于细胞分裂时，质粒同质膜的结合是怎样保证每个细胞至少得到一个质粒的解释是不同的。模型.A:ｐar位点同细菌质膜的一个假定位点结合。在这个模型中，每一种质粒都有它自己独特的同质膜结合的位点。当细胞生长时，位点也加倍,每一个质粒拷贝结合一个位点.由于这些位点随着细胞分裂而分开,每一个质粒拷贝将分配到一个子细胞。这就保证了质粒不会丢失.该模型要解决的问题是质膜上必须有许多独特的位点以供不同的质粒拷贝结合,这似乎不太可能。将模型Ａ稍微改动一下，就可以满足质粒分离所需的位点。如果我们假定质粒结合的位点不在质膜而是在细菌的染色体上就可以了。染色体上有很多的位点,并且随着DNA的复制而加倍，这些位点可供质粒结合。剩下的唯一问题就是在质膜上有同染色体结合的独特位点,这样，质粒将随着染色体的分离而分离。模型B同模型A基本类似，在这个模型中，质粒的两个拷贝在同质膜结合之前必须通过它们的ｐar位点相互配对。然后这两个质粒在细胞分裂过程中随着质膜位点的分离而分离。高拷贝数的质粒常常具有增加质粒适当分离的位点，但是这些区域并没有相同的结构，并不以相同的机制起作用。例如，质粒ｐSCl01的par区可以增加质粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何帮助质粒的适当分离是不清楚的。可能是增强了质粒分离后的迅速复制，防止了下次分裂时的丢失。（３）质粒溺爱（plasmidａｄｄictiｏｎ）即使质粒具有分离功能,质粒也会从增殖的细胞中丢失。在一类复仇的细胞中，质粒能够编码一些杀死丢失了质粒的细胞。像F质粒、R1质粒、以及P1噬菌体都有这种功能。这些质粒编码一些毒性蛋白质，这些蛋白质一旦表达就会杀死细胞。根据质粒的来源不同，毒性蛋白质可通过各种方式杀死细胞。例如，质粒的毒性蛋白Ccd，通过改变DNA螺旋酶来杀死细胞,由于螺旋酶的改编，引起了双螺旋DNA的断裂。质粒R1的杀手蛋白Ｈok,破坏细菌细胞质膜的功能，引起细胞活力的丧失。为什么毒性蛋白仅仅是在细胞丢失了质粒之后立即杀死细胞？当细胞含有这种质粒时,沉溺系统的蛋白质或ＲNA可作为一种解毒药,既能阻止毒蛋白的合成,又能同毒蛋白结合并阻止毒蛋白起作用。然而,这些其他基因的产物要比毒性蛋白不稳定得多,所以它们会很快失活。如果一个细胞丢失了质粒，既没有毒性蛋白也没有解毒剂的合成。但是,由于解毒剂更不稳定,当解毒剂失活后,毒性蛋白就可以起杀伤作用。这些系统使细胞对质粒产生溺爱，并防止细胞丢失质粒。9。（１）非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移。（２)具有条件致死突变，如温度敏感质粒pＪC30７（CoｌEl的衍生质粒）在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力,可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中.（3）一般情况下不希望与宿主染色体发生重组,因为重组后有可能给宿主带来突变。（４）有较小的宿主范围。10．（１）菌体DNA没有容载能力,因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的,不能大于基因组的10５%，所以要将l噬菌体改造成载体，必须削减分子量.（２)野生型的lDNＡ对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆。（３）没有可供选择的标记。（4)野生型的ｌ噬菌体具有感染性,因此不够安全.11．这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在l载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌ｂ—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的l载体转入ｌac的宿主菌后，在含有5—溴-４—氯—3—引哚-ｂ—D—半乳糖苷（X－gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lａc(或lａc基因部分被取代)后,重组的噬菌体将丧失分解X－gaｌ的能力，转入laｃ－宿主菌后，在含有5—溴-4—氯—3—引哚—b—Ｄ—半乳糖苷（Ｘ-gａl）平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。12.b—半乳糖苷酶的Ｎ末端是非必需的,，可以进行修饰,并不影响酶的活性或a肽的互补性。如果插入的外源DＮA引起a肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑.如果插入DＮA的碱基数正好是３的倍数，或者插入的DNA中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。１3。M13克隆系统具有很多优点：(1）克隆的片段大:M13噬菌体的DNＡ在包装时不受体积的限制,所以容载能力大，有报道,有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体ＤNＡ长６—7倍的ＤNA(插人片段可达40kb）。(2)可直接产生单链DNＡ，这对于DNＡ测序、DNＡ诱变、制备特异的单链DNＡ探针都是十分有用的。（3）单链ＤNA和双链ＤNA都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13克隆系列的不足：(1）较大的外源片段插入后,在扩增过程中往往不够稳定，一般说,克隆的片段越大，发生丢失的机率越大.（2）单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。1４.主要特点有：（１）具有质粒复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制,并且能够被氯霉素扩增。（2)具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。（3)具有l噬菌体的包装和转导特性。(4)容载能力大。克隆的最大片段在4５ｋb，最小片段为１9kb。(5)简化了筛选.如果载体的分子量在5kb的话，得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性，因为要被成功包装，至少要７个分子的载体自连,尽管如此，也是不能被包装的，因为COS位点太多了。黏粒载体也有如下不足：（1）如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失.(2)含不同重组DNA片段的菌落生长速度不同，会造成同一个子板上菌落大小不一.另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同,会造成文库扩增量的比例失调.(3)包装过程复杂，包装效率不稳定,代价高。１5.虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是