谷胱甘肽还原酶活性的测定

谷胱甘肽还原酶活性的测定一、目的要求学习果蔬组织中谷胱甘肽还原酶活性的测定原理和方法。二、基本原理谷胱甘肽还原酶（Glutathionereductase，GR）是一种黄素酶，每分子酶蛋白含有一分子的黄素腺嘌呤二酸（FAD）。谷胱甘肽还原酶在许多组织中都有分布，维持细胞内充足的还原型谷胱甘肽（GSH）水平。还原型谷胱甘肽（GSH）可使含巯基（-SH）的蛋白质或酶处于还原状态或活性状态，对于维持蛋白质或酶的正常功能，维持细胞内较高的还原势具有很大意义。在还原型辅酶Ⅱ（Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate[reducedform]，NADPH）提供氢的条件下，GR能将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原成还原型谷胱甘肽（GSH），同时，NADPH形成NADP+。反应式如下：NADPH在波长340nm处有吸收峰，因此可以通过测定OD340的减小来计算谷胱甘肽还原酶的活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料各种水果和蔬菜（如梨、马铃薯）。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、试管、计时器、水浴锅、容量瓶（100mL、200mL、1000mL）、紫外分光光度计。（三）试剂1．100mmol/L、pH7.5的磷酸缓冲液（含1mmol/LEDTA），母液A（200mmol/LNa2HPO4溶液）：称取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解，定容至1000mL。母液B（200mmol/LNaH2PO4溶液）：称取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解，定容至1000mL。取84.0mL母液A和16.0mL母液B混合后，调节pH至7.5，然后稀释至200mL，即为100mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液。称取29.2mgEDTA，用100mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液溶解、定容至100mL即可。2．5mmol/LGSSG溶液称取20.3mgGSSG，用蒸馏水溶解、定容至10mL。配制成GSSG溶液后，适当分装，于-20℃保存，或者4℃保存，现用现配。3．4mmol/LNADPH溶液称取33mgNADPH-Na4，用蒸馏水溶解、定容至10mL。所配得溶液宜于-70℃保存。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0g果蔬样品置于经预冷的研钵中，加入5.0mL经4℃预冷的100mmol/L、pH7.5的磷酸缓冲液（含1mmol/LEDTA），冰浴研磨匀浆后，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液用于酶活性测定。（二）活性测定取1支试管，依次加入2.7mL100mmol/L、pH7.5的磷酸缓冲液（含1mmol/LEDTA）、0.1mL5mmol/LGSSG溶液和0.2mL酶液。最后加入40μL4mmol/LNADPH溶液以启动酶促反应，立即混合，并开始计时。对分光光度计进行调零，从启动后15s开始测定、记录反应混合液在波长340nm处的吸光度值，每隔30秒记录一次OD340值，至少连续测定3分钟，获得6个点的数据。实验重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)340nm吸光度值样品中GR活性(0.01△OD340·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD340计算值平均值±标准偏差1232．计算结果记录反应体系在波长340nm处的吸光度值，制作OD340值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD340。谷胱甘肽还原酶（GR）活性以测定条件下每分钟每克鲜重（FW）果蔬样品反应体系在340nm吸光度值减少0.01时为一个酶活性单位（U），即U=0.01△OD340·min-1·g-1FW。计算公式：式中：△OD340——反应混合液吸光度值的变化；△t——酶促反应时间，min；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；W——样品重量，g。也可以用每分钟反应体系吸光度值减小0.01所需的酶量为1个酶活性单位（U），表示为0.01△OD340·min-1·mg-1蛋白质。六、注意事项1．配制的NADPH溶液宜立即于-70℃保存。在4℃可以保存一天；在-20℃保存一周后NADPH会减少10%以上。2．一