微生物基因工程培训讲义

微生物基因工程

李刚副教授教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧；

二、基因组文库的建立与筛选；

三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中的应用；

四、原核表达系统的选择和高效表达策略；五、真核表达系统的选择和高效表达策略。四、原核表达系统的选择和高效表达策略

原核生物表达系统主要包括：

大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等,其中应用最广泛的是大肠杆菌表达系统。原核表达系统的优点1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉；2、外源基因表达产物的水平高(如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%)；3、基因背景和表达特性清楚。大肠杆菌表达系统自20世纪70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。大肠杆菌表达系统的优缺点优点：大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、可以高效表达不同外源基因产物等特点,是许多外源基因表达系统中最好的一种,是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统,大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达。缺点：大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比,也具有一些缺点:①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工修饰,如糖基化、磷酸化及酰基化等。大肠杆菌表达系统的操作流程

大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下：

获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。大肠杆菌表达系统的基本概念首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。

大肠杆菌表达系统的基本概念复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。

大肠杆菌表达系统的基本概念对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的GFP），其他还有半乳糖苷酶，荧光素酶等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。

启动子、终止子和核糖体结合位点：

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。

转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，分别是Rho因子作用下使mRNA转录终止的终止子和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA转录的终止子。常见的是rrnB

、rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。

大肠杆菌菌表达系系统的基基本概念念核糖体结结合位点点：启动动子下游游从转录录起始位位点开始始延伸的的一段碱碱基序列列，其中能与与rRNA16S亚基3'端互补的的SD序列对形形成翻译译起始复复合物是是必需的的，多数载载体启动动子下游游都有SD序列，也也有些载载体没有有，适合合自带SD序列的基基因表达达，要留留意。大肠杆菌菌表达系系统的几几种表达达方式组成型表表达：表达载体体的启动动子为组组成型启启动子，，也就是是一直努努力不停停表达目目的蛋白白的启动动子，如如pMAL系统。持续性表表达通常常表达量量比较高高，成本本低，但但是不适适合表达达一些对对宿主细细菌生长长有害的的蛋白。。因为过量量或者有有害的表表达产物物会影响响细菌的的生长，，反过来来影响表表达量的的积累。。诱导调控控型表达达：表达载体体采用诱诱导型启启动子，，只有在在诱导剂剂存在的的条件下下才能表表达目的的产物。。这种方法法有助于于避免菌菌体生长长前期高高表达对对菌体生生长的影影响，又又可减少少菌体蛋蛋白酶对对目标产产物的降降解。特特别适合合解决有有毒蛋白白的表达达。另外也有启启动子是组组成型的，，但是启动动子所依赖赖的转录酶酶是诱导表表达的，也也属于诱导导表达系统统。大肠杆菌表表达系统的的几种表达达方式融合表达：表达载体的的多克隆位位点上有一一段融合表表达标签（（Tag），表达产产物为融合合蛋白（有有分N端或者C端融合表达达），方便便后继的纯纯化步骤或或者检测。。对于特别小小的分子建建议用较大大的Tag（如GST）以获得稳稳定表达；；而一般的的基因多选选择小Tag以减少对目目的蛋白的的影响。His-Tag是最广泛采采用的Tag。分泌表达：：在起始密码码和目的基基因之间加加入信号肽肽，可以引引导目的蛋蛋白穿越细细胞膜，避避免表达产产物在细胞胞内的过度度累积而影影响细胞生生长，或者者形成包涵涵体，而且且表达产物物通常是可可溶的活性性状态，不不需要复性性。通常这种分分泌只是分分泌到细胞胞膜和细胞胞壁之间的的周质空间。可溶性表达达：大肠杆菌表表达效率很很高，特别别是强启动动子，目的的蛋白来不不及折叠而而形成不溶溶的包涵体体颗粒，包涵体容易易纯化但是是复性效率率不高。分分泌表达可可以得到可可溶的产物物，也有部部分融合Tag有助于提高高产物的可可溶性，比如Thio，pMAL系统。提高大肠杆杆菌表达系系统重组蛋蛋白可溶性性的策略大致有八种种策略：（1）在细胞中中表达分子子伴侣（天天然或异源源），辅助助新生肽链折叠，，避免肽链链相互聚合合（例如Takara的ChaperoneplasmidSet）；（2）共表达折折叠酶，催催化共价键键形成；（3）通过降低低培养温度度和摇床速速度来降低低蛋白合成成速度，以以降低有聚聚合倾向的中中间体的浓浓度；（4）选择中等等强度或低低强度的启启动子代替替强启动子子，降低重重组蛋白的的合成速度；（5）选择适合合的宿主菌菌株；（6）表达含可可溶性多肽肽或信号肽肽的重组蛋蛋白，提高高可溶性；；（7）蛋白质的的可溶性往往往与自身身的氨基酸酸序列有关关，因此可可利用诱突突技术改变其其氨基酸序序列，提高高目的蛋白白的可溶性性；（8）诱导过程程中加入化化学物质，，以增加渗渗透压或改改变培养基基的pH值。大肠杆菌表表达系统中中几个常用用的启动子子最早应用于于大肠杆菌菌表达系统统的是Lac乳糖操纵子子，由启动动子Plac、操纵基因因lacO和结构基因因组成。其其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在在没有CAP的存在下更更有效地起起始转录，，该启动子子在转录水水平上只受受lacI的调控，因因而随后得得到了更广广泛采用。。lacI产物是一种种阻遏蛋白白，能结合合在操纵基基因lacO上从而阻遏遏转录起始始。乳糖的类似似物IPTG可以和lacI产物结合，，使其构象象改变离开开lacO，从而激活活转录。这这种可诱导导的转录调调控成为了了大肠杆菌菌表达系统统载体构建建的常用元元件。大肠杆菌表表达系统中中几个常用用的启动子子tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合合启动子，，且转录水平更更高，比lacUV5更优越。trc启动动子子是trp启动动子子和和lac启动动子子的的拼拼合合启启动动子子，，同样样具具有有比比trp更高高的的转转录录效效率率和和受受lacI阻遏蛋白白调控的的强启动动子特性性。在常规的的大肠杆杆菌中，，lacI阻遏蛋白白表达量量不高，，仅能满满足细胞胞自身的的lac操纵子，，无法应应付多拷拷贝的质质粒的需需求，导导致非诱诱导条件件下较高高的本底底表达，，为了让让表达系系统严谨谨调控产产物表达达，能过量表表达lacI阻遏蛋白白的lacIq突变菌株株常被选选为Lac/Tac/trc表达系统统的表达达菌株。大肠杆菌菌表达系系统中几几个常用用的启动动子现在的Lac/Tac/trc载体上通通常还带带有lacIq基因，以以表达更更多lacI阻遏蛋白白实现严严谨的诱诱导调控控。IPTG广泛用用于诱诱导表表达系系统，，但是是IPTG有一定定毒性性，有有人认认为在在制备备医疗疗目的的的重重组蛋蛋白并并不合合适，，因而而也有有用乳乳糖代代替IPTG作为诱诱导物物的研研究。。另外外一种种研究究方向向是用用lacI的温度度敏感感突变变体，，30度下抑抑制转转录，，42度开启转转录。热诱导不不用添加加外来的的诱导物物，成本本低，但但是由于于发酵过过程中加加热升温温比较慢慢而影响响诱导效效果，而而且热诱导本本身会导导致大肠肠杆菌的的热休克克蛋白激激活，一一些蛋白白酶会影影响产物物稳定。。大肠杆菌菌表达系系统中几几个常用用的启动动子以λ噬菌菌体体载载体体转转录录启启动动子子PL、PR构建的载体体也为大家家所熟悉。。这两个强强启动子受受控于λ噬菌体cI基因产物。。cI基因的温度度敏感突变变体cI857(ts)常常被用于于调控PL、PR启动子的转转录。同样样也是30度下阻遏启启动子转录录，42度下解除抑抑制开发转转录。同样样的，PL、PR表达载体需需要携带cI857(ts)菌株作为表表达载体，，现在更常常见的做法法是在载体体上携带cI857(ts)基因，所以以可以有更更大的宿主主选择范围围。另外一种思思路是通过过严谨调控控cI产物来间接接调控PL、PR启动子的转转录。比如如Invitrogen的PL表达系统，，就是将受受trp启动子严谨谨调控的cI基因溶源化化到宿主菌菌染色体上上，通过加加入酪氨酸酸诱导抑制制trp启动子子，抑抑制cI基因的的表达达，从从而解解除强强大的的PL启动子子的抑抑制。。大肠杆杆菌表表达系系统中中几个个常用用的启启动子子T7启动子子是当当今大大肠杆杆菌表表达系系统的的主流流，这个功功能强强大兼兼专一一性高高的启启动子子经过过巧妙妙的设设计而而成为为原核核表达达的首首选，，尤其其以Novagen公司的的pET系统为为杰出出代表表。强大的的T7启动子子完全全专一一受控控于T7RNA聚合酶酶，而而高活性性的T7RNA聚合酶酶合成成mRNA的速度度比大大肠杆杆菌RNA聚合酶酶快5倍——当二者者同时时存在在时，，宿主主本身身基因因的转转录竞竞争不不过T7表达系系统，，几乎所所有的的细胞胞资源源都用用于表表达目目的蛋蛋白；诱导表表达后仅仅几个小小时目的的蛋白通通常可以以占到细细胞总蛋蛋白的50%以上。由由于大肠肠杆菌本本身不含含T7RNA聚合酶，，需要将将外源的的T7RNA聚合酶引引入宿主主菌，因因而T7RNA聚合酶的的调控模模式就决决定了T7系统的调调控模式式——非诱导条条件下，，可以使使目的基基因完全全处于沉沉默状态态而不转转录，从从而避免免目的基基因毒性性对宿主主细胞以以及质粒粒稳定性性的影响响；通过过控制诱诱导条件件控制T7RNA聚合酶的的量，就就可以控控制产物物表达量量，某些些情况下下可以提提高产物物的可溶溶性部分分。常用的几几种大肠肠杆菌表表达系统统1、GE（原安玛玛西亚））-pGEX系列，特特点：使使用该系系列载体体可以很很方便进进行下一一步重组组蛋白的的纯化。。GE（原安玛玛西亚））-pGEX系列Invitrogen-Champion™pETExpressionSystem等四个系系列比起其它它公司的的原核表表达系列列来说Invitrogen有个非常常突出的的地方就就是它的的重组克克隆技术术。像之之前Novagen大部分载载体都是是用传统统的酶切切、链接接方式做做重组质质粒，但但是Invitrogen的表达系系统大量量运用了了它的TOPO技术和Gateway技术。Invitrogen公司总共共有四个个原核表表达系统统它们分别别是：Champion™pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。这四个个系列的的载体可可谓把原原核表达达的发展展史中出出现过的的几种启启动子都都囊括进进去了，，包括T7、pL、pBAD和trc启动子，，同时几几种经典典的调控控方式也也都出现现了，包包括有乳乳糖操纵纵子、色色氨酸操操纵子和和阿拉伯伯糖操纵纵子。Champion™pETExpressionSystem之所以取取了个冠冠军系统统的称号号是因为为它结合合了经典典的T7表达系统统和Invitrogen的王牌定定向TOPO技术及Gateway技术，，这可可谓是是强强强联手手。InvitrogenpET100/D-TOPO载体图图谱Novagen公司-pET表达载载体序序列Novagen公司（Merck的子公公司））出品品了多多种原原核表表达载载体系系列，，其中中的pET系列载载体是是目前前应用用最为为广泛泛的原原核表表达系系统，已经经成功功地在在大肠肠杆菌菌中表表达了了各种种各样样的异异源蛋蛋白。。pET系列载载体是是利用用大肠肠杆菌菌T7噬菌体体转录录系统统进行行表达达的载载体。。Novagen公司的的pET表达载载体系系列pETVectorswithuniquefeaturesinclude:pET-31b(+)forhighyieldbioproductionofpeptidesandsmallproteinspET-32a-cforproductionofsoluble,activetargetproteinsinE.colipET-33bforproductionoftargetproteinssuitableforsite-specific32P-labelingpET-39band40busingDsbtagsforexportandperiplasmicfoldingoftargetproteinspET-41a-cand42a-cwithpopularGSTfusiontagsforenhancedproductionandsolubilitypET-43.1a-cdesignedforcloningandhigh-levelexpressionofpolypeptidesequencesfusedwiththe495aaNusA(Nus•Tag™)proteinpET-44a-cwithNus•Tag™sequenceplusN-andC-terminalHis•TagsequencespET-45b(+)withamino-terminalHis•Tag™sequenceandminimalextraneoussequencespET-46Ek/LICpreparedvectorforligation-independentcloning,withamino-terminalHis•Tag™sequencepET-47b(+)throughpET-50b(+)withHRV3CProteasecleavagesiteforefficientfusiontagremovalAdditionalvectorsinthistableinclude:pLacIpLysEandpLysSNovagen公司的PET32a表达载体图图谱Novagen公司的pET表达载体选选择从开始涉及及表达的时时候可以根根据是否要要用基因本本身的起始始密码子进进行选择，，Novagen公司仅提供供三个载体体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打打算利用载载体的起始始密码子，，那么就有有许多选择择。根据是否要要可溶性表表达，选择择加有不同同标记的载载体。一般般说来在大大肠杆菌中中不加标记记外源蛋白白都会以不不溶的包涵涵体形式表表达。为了了让外源蛋蛋白融合表表达一般说说来有三个个策略：1.与一个高度度可溶的多多肽联合一一起表达，，比如：谷谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase,GST）、硫氧还还蛋白（thioredoxin,Trx）和N利用底物A蛋白（NutilizationsubstanceA,NusA）。2.转入一个酶酶催化二硫硫键的形成成，如：硫硫氧还蛋白白，DsbA，DsbC。3.插入一个定定位到周质质空间的信信号肽序列列。以上载体都都是采用抗抗生素抗性性筛选，如如果你希望望用蓝白斑斑筛选可以以使用pETBlue系列载体。。在重组技技术上，，Novagen除了传统统的酶切切、连接接方式外外，还有有不需要要连接的的克隆方方式：Ligation-Independentcloning，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线线性化的的，在末末端有12-15个突出的的碱基以以在退火火时和目目的片断断互补。。在设计计PCR扩增引物物时加入入与LIC载体互补补的序列列，PCR产物用3’→5’的内切酶酶消化出出单链与与载体互互补的序序列。通通过这种种方式就就可以把把目的片片断定向向、高效效地插入入LIC载体上。。Novagen公司的大大肠杆菌菌菌株选选择Novagen提供多种种表达使使用的菌菌株，为为了提高高表达量量做出了了各种改改造，它它们大致致分为以以下几个个种类：：1.蛋白酶缺缺陷型所有B菌株的衍衍生株都都是lon蛋白酶和和ompT蛋白酶缺缺陷型的的，这包括括有B834,BL21,BLR,Origami™B,Rosetta™和Tuner™。因此在在纯化时时可以保保持蛋白白的稳定定不被降降解。BL21(DE3)是应用最最多的表表达的表表达菌株株。另外它的的衍生株株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆杆菌中介介导同源源重组的的重要蛋蛋白之一一。它的的缺失，，可以保保证质粒粒的稳定定。2.保证证所所有有细细胞胞以以同同样样量量进进行行表表达达Tuner™™株及及它它的的衍衍生生株株（（Origami™™B和Rosetta™™）是是BL21菌株株的的lacY1缺失失突突变变型型，，在这这些些菌菌株株中中可可以以使使蛋蛋白白以以同同样样水水平平在在所所有有细细胞胞中中表表达达。。Lac渗透透酶酶的的突突变变使使进进入入每每个个细细胞胞的的IPTG量都都是是一一致致的的，，这这样样使使蛋蛋白白表表达达浓浓度度可可以以随随着着IPTG浓度度而而改改变变。。通过过对对IPTG浓度度的的控控制制可可以以使使细细胞胞微微量量表表达达或或者者大大量量表表达达。。一般般说说来来，，低低浓浓度度表表达达有有利利于于蛋蛋白白的的可可溶溶性性和和活活性性。。Novagen公司的大大肠杆菌菌菌株选选择3.二硫键形形成与溶溶解性增增强二硫键的的形成对对某些蛋蛋白的可可溶性起起到重要要的作用用，而Novagen也专门设设计了一一些菌株株是谷胱胱甘肽还还原酶（（gor）和/或硫氧还还蛋白还还原酶（（trxB）缺陷型型的，包包括AD494，BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami™™。在这些些菌株中中表达蛋蛋白，可以更大大程度促促进二硫硫键的形形成，并并使蛋白白以可溶溶形式和和有活性性形式出出现的可可能增加加。4.稀有密码码子的补补给不同物种种有不同同的密码码子偏爱爱性，如如果外源源蛋白中中含大量量大肠杆杆菌的稀稀有密码码子，特特别当这这些稀有有密码子子呈连续续分布的的时候，，就会造造成蛋白白表达量量极低，，或者翻翻译提前前终止。。Rosetta™是为了表达达真核蛋白白而特别设设计的，它它含有大肠肠杆菌稀有有的密码子子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以氯氯霉素抗性性的质粒形形式存在。。Rosetta系列是来自自BL21lacY1，所以它具具有BL21lacY1的所有特性性。5.硒蛋氨酸标标记B834是来源于BL21的蛋氨酸（（met）营养缺陷陷型菌株。。它在高度度特异活性性35S-met标记和晶体体成像蛋氨氨酸标记中中非常有用用。原核表达需需要考虑的的问题在原核蛋白白表达过程程中，选择择构建一个个合适原核核表达体系系需要综合合考虑3大因素：表达载体、、宿主菌株株、表达诱诱导条件,以获得最满满意的表达达效果。大肠杆菌表表达系统的的高效表达达策略1、采用高强强度启动子子-如T7启动子；2、将目的基基因所有密密码子都换换成大肠杆杆菌偏好的密码码子（需要要重新合成成基因），，或采用含有有大肠杆菌菌稀有密码码子tRNA的Rosetta系列菌株。。3、采用丰富富培养基（（如TB）代替普通通的LB培养基；4、优化大肠肠杆菌的生生长条件和和目的基因因的诱导表表达条件。使用pET表达系统的的常见问题题分析几个常见问问题如下表表：原核表达常常见的几个个问题及回回答（1）1、目的蛋白白总是以不不可溶的形形式出现。。解决办法：：采用以下下八种策略略提高目的的蛋白的可可溶性。提高大肠杆杆菌表达系系统重组蛋蛋白可溶性性的策略大致有八种种策略：（1）在细胞中中表达分子子伴侣（天天然或异源源），辅助助新生肽链链折叠，避避免肽链相互聚聚合；（2）共表达折折叠酶，催催化共价键键形成；（3）通过降低低培养温度度和摇床速速度来降低低蛋白合成成速度，以以降低有聚聚合倾向的中中间体的浓浓度；（4）选择中等等强度或低低强度的启启动子代替替强启动子子，降低重重组蛋白的的合成速度；（5）选择适合合的宿主菌菌株；（6）表达含可可溶性多肽肽或信号肽肽的重组蛋蛋白，提高高可溶性；；（7）蛋白质的的可溶性往往往与自身身的氨基酸酸序列有关关，因此可可利用诱突突技术改变其其氨基酸序序列，提高高目的蛋白白的可溶性性；（8）诱导过程程中加入化化学物质，，以增加渗渗透压或改改变培养基基的pH值。原核表达常常见的几个个问题及回回答（2）2、必须去除除融合多肽肽或蛋白质质标签才能能使目的蛋蛋白获得活活性吗？回答：大多多数情况下下目的蛋白白带有His-Tag,S-Tag,11个氨基酸的的T7-Tag或HSV-Tag等小肽时仍仍能表现出出完全的活活性。这些些肽段都较较为亲水，，理论上都都不会干扰扰蛋白的三三维结构。。我们建议议首先测试试蛋白活性性，再看是是否一定要要去除前导导序列才能能适合特定定的应用要要求。原核表达常常见的几个个问题及回回答（3）3、如果目的的蛋白包含含信号序列列，它会不不会被运至至细胞周质质并以可溶溶、活性形形式存在？？还是目的的蛋白甚至至可以被分分泌到生长长培养基中中？回答：如果果目的蛋白白包含ompT或pelB这样的前导导序列，理理论上它应应该被运至至细胞周质质并以可溶溶、活性形形式存在。。如果在生生长培养基基中发现目目的蛋白的的话，多半半是因为细细胞壁受到到破坏，而而并不代表表蛋白是被被分泌到培培养基中的的。除了信信号肽对蛋蛋白质的运运输有影响响，现在发发现蛋白质质的成熟区区对蛋白质质的运转也也有影响。。因此在细细胞质、细细胞周质及及其它区域域发现目的的蛋白都很很正常。某某些情况下下降低诱导导时的培养养温度至25-30℃，可能提高高蛋白运输输的比例。。原核表达常常见的几个个问题及回回答（4）4、IPTG诱导后细胞胞停止了生生长，是不不是表示细细胞死了？？回答：：T7RNA聚合酶酶非常常活跃跃，T7转录和和翻译译信号号极强强，因因此，，一旦旦诱导导，细胞的的主要要生理理活动动都向向着目目的蛋蛋白表表达的的方面面转化化。在通通常情情况下下，细细胞将将停止止生长长，形形成克克隆的的能力力大大大降低低，但但并未未死亡亡。菌菌落形形成试试验可可以用用来检检测表表达系系统的的性能能。但也有有一些些例外外情况况，例例如特特别的的目的的基因因以及及一些些极为为严紧紧的载载体/宿主菌菌组合合(比如含含有plysE的宿主主菌)等，这这时在在诱导导后菌菌落还还是会会继续续生长长。原核表表达常常见的的几个个问题题及回回答（（5）5、除了了毒性性和降降解，，还有有些什什么因因素会会影响响目的的蛋白白的表表达水水平？？回答：：（1）mRNA转录子子中的的二级级结构构会干干扰AUG翻译起起始密密码子子和/或核糖糖体结结合位位点。。所有有pET载体的的转录录产物物都是是下列列两种种之一一：RbsNdeI/NcoI5’……AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’5’……AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’如果发发现表表达很很差，，你可可以通通过检检查编编码插插入序序列的的链上上的与与上述述序列列互补补的序序列：：5‘-CATATGTATATCTCCTTCTT-3’或5’-CCATGGTATATCTCCTTCTT-3‘以确定定是否否因为为存在在潜在在的二二级结结构造造成麻麻烦。。原核表表达常常见的的几个个问题题及回回答（（5）（2）目的的基因因中稀稀有密密码子子比较较多也也是常常见的的表达达水平平低的的原因因。如果稀稀有密密码子子集中中出现现在氨氨基端端情况况更为为严重重。应该注注意，，根据据现有有对大大肠杆杆菌高高表达达的基基因研研究发发现的的有限限的稀稀有密密码子子，已已经观观察到到由于于其对对应的的tRNAs水平很很低，，直接接导致致了翻翻译延延伸的的困难难。（3）序列中中的意意外的的终止止密码码子可可能造造成突突变，，这在在PCR克隆产产物的的情况况下较较为突突出。。可以通通过测测序发发现此此类问问题，，也可可以用用体外外翻译译的方方法确确认重重组子子的表表达能能力。。原核表表达常常见的的几个个问题题及回回答（（6）有时除了了全长的的目的蛋蛋白以外外，还能能看到截截短的产产物，这这时怎么么回事？？回答：一个最直直接原因因就是蛋蛋白水解解了。然然而第二二点翻译译起始也也非常有有可能。。起始密码码子AUG（Met）的上游游在RNA编码区有有类似于于核糖体体结合位位点序列列（AAGGAGG）的间隔隔序列（（通常是是5-13个核苷酸酸）时，，容易出出现这种种问题。