基因工程基础知识梳理【实用文档】doc

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基因工程基础知识梳理（二）基因工程基础知识梳理【实用文档】doc文档可直接使用可编辑，欢迎下载三、基因工程的应用1．植物基因工程的成果提高农作物的____＿能力、改良农作物的品质、利用植物生产_＿_＿＿等.(１)抗虫转基因植物①方法:将_＿__＿导入植物体，使其具有抗虫性。②成果：各种抗虫作物，如抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米等。③意义:减少＿__＿＿，降低生产成本,减少环境污染.④主要杀虫基因：＿＿＿__、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。(2）抗病转基因植物①方法：将__＿＿_导入植物体中,使其具有抗病特性。②成果:多种抗病作物,如抗病的烟草、小麦、甜椒、番茄等。③意义：提高作物抗病力,增产。④主要抗病基因:抗病毒的_＿_＿＿和病毒的复制酶基因；抗真菌的＿＿__＿基因和抗毒素合成基因.（3)抗逆转基因植物①方法：将_＿_＿_基因导入植物体，获得抗逆作物。②成果：多种抗逆植物，如抗盐碱和干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂大豆和玉米等。③意义：提高作物抗逆能力,稳定高产.④主要抗逆基因：抗盐碱、抗干旱的_＿_＿_基因、耐寒的___＿＿基因、抗除草剂基因。（４)利用转基因改良植物的品质①方法：将优良性状基因导入植物体，获得__＿__。②成果:＿__＿_含量较高的玉米、耐储存番茄、新花色的矮牵牛。③意义：改良植物的某些品种。④主要优良性状基因:＿＿___的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因.2．动物基因工程的成果（1)提高动物的生长速度①生长基因:外源__＿_＿基因.②成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼。（2)改善畜产品的品质①优良基因:肠＿＿＿＿＿基因.②成果:转基因牛乳汁中_＿＿_＿含量少.（3)转基因动物生产药物①基因来源：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的__＿__.②成果：乳腺生物反应器.(４)转基因动物作器官移植的供体①器官供体：抑制或除去＿＿＿＿_。②成果：利用＿＿___培育没有免疫排斥反应的猪器官。3．基因工程药物(１)来源:转基因＿＿＿_＿。（２）成果：_＿_＿＿、抗体、疫苗、激素等。(3）作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、＿＿＿_＿、类风湿等疾病。4．基因治疗（1）特点:把＿____导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的。(２)成果：将腺苷酸脱氨酶基因导入患者的_＿＿＿_，治疗复合型免疫缺陷症.（3）方法：分为体外基因治疗法和_＿__＿基因治疗法。四、蛋白质工程1．蛋白质工程的崛起（1）实质：将一种生物的_＿＿_＿转移到另一种生物体内，后者产生它本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。(2）目的：生产符合人们生活需要的、并非自然界已存在的＿__＿＿。（３)实例:天冬氨酸激酶和＿_＿____＿的活性受细胞内__＿＿__＿＿__的影响，当赖氨酸浓度达到一定量时会抑制这两种酶的活性，改变两种酶的特性后，玉米游离赖氨酸含量提高。2。蛋白质工程原理（1）目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。（2）原理：__＿_＿＿____＿_＿＿＿。(3）过程：预期蛋白质功能→设计_＿＿_＿结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的＿＿＿__序列（基因）。3．蛋白质工程进展前景广阔，但目前成功的例子不多。【答案】三、1。抗逆药物杀虫基因农药用量Ｂｔ毒蛋白基因抗病基因病毒外壳蛋白基因几丁质酶抗逆渗透压调节抗冻基因优良品质植物赖氨酸提高必需氨基酸含量2．生长激素乳糖酶乳糖启动子抗原决定基因克隆技术3．工程菌淋巴因子糖尿病4．正常基因淋巴细胞体内四、1．基因蛋白质二氢吡啶二羧酸合成酶赖氨酸浓度２．基因改造预期的蛋白质脱氧核苷酸活动（二)基因工程的基本工具(能级要求A）完成下列关于基因工程的基本工具概念图：活动(三)基因工程的操作程序（能级要求B)完成下列基因工程的操作程序填空：活动四：基因工程的应用(能级要求B）完成下列基因工程应用的相关内容:活动五:蛋白质工程(能级要求A）1.完成下列蛋白质工程流程图的填空：2。阐述蛋白质工程的优点及实施的困难：基因工程概述1。什么是基因工程，基因工程的基本流程?基因工程(Genetiｃengiｎeeｒｉng）原称遗传工程.从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体(供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状.因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。１.分离目的基因2。限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DＮA在体外连接4．将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6。培养、观察目的基因的表达基因工程的载体和工具酶１．基因工程载体必须满足哪些基本条件？具有对受体细胞的可转移性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有合适的筛选标记。分子量小,拷贝数多。具有安全性。2.质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1．克隆质粒２．测序质粒３。整合质粒４．穿梭质粒５．探针质粒6.表达质粒3。质粒的构建(1)删除不必要的DNA区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于２0Ｋb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定.(2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mｏb基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNＡ重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数(3)加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞.(4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的ＤNＡ序列，即多克隆接头（Ｐolylinkeｒ)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。4。什么是人工染色体载体？将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体5．什么是穿梭载体？人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。6。入－噬菌体载体及构建ｌ－DNＡ为线状双链ＤNA分子，长度为４8。5kb，在分子两端各有1２个碱基的单链互补粘性末端。1缩短长度提高外源ＤNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DＮＡ片段克隆的可操作性灭活某些与裂解周期有关基因.使λ—DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测７.M13单链噬菌体DNA载体过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口.引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列（ｌａcＺ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段(ｈｉs)以及抗生素抗性基因等。将人工合成的多克隆位点接头片段插在laｃＺ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。(4)在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列，使得重组DＮA分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。8.IＩ类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclｅases）是一类能在特异位点上催化双链DNＡ分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶.识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由４、5或6核苷酸组成的特定序列(靶序列）.识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。切割位点的规范性:双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶.同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶（Isoｃanｄamｅrs）:识别位点不同,但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。9。甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使ＤNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。10.DNA连接酶连接作用的特点：①DNA连接酶需要一条ＤNA链的3’末端有一个游离的羟基(－OH)，另一条ＤＮA链的5’末端有一个磷酸基（-P)的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DＮA分子的作用.②只有当３’－OＨ和5'－Ｐ彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。③DNA连接酶不能连接两条单链的ＤNA分子或环化的单链ＤNＡ分子,被连接的DＮA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。④ＤNA连接酶只能封闭双螺旋ＤNＡ上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口(nick),而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此，DＮA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP)11。大肠杆菌DNＡ聚合酶和Klenow大片段各有什么作用?ＤNＡ聚合酶作用的特点:要有底物4种dNTP为前体催化合成ＤNA。接受模板指导。需要有引物（3'羟基）的存在。不能起始合成新的DNＡ链.催化dＮＴP加到生长中的DＮA链３’—OH末端。催化DNA的合成方向是５’→３’。Kｌenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的Ｃ末端604个氨基酸残基片段，即Kｌenｏw酶。分子量为７6kDa。Klenow酶仍拥有５’→3’的DＮＡ聚合酶活性和5’→３’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：修复由限制性核酸内切酶造成的３’凹端，使之成为平头末端.以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNＡ片段进行标记。用于催化ｃDNA第二链的合成。用于双脱氧末端终止法测定DＮA的序列。1２。Ｔ4—DNＡ聚合酶T4—DNA聚合酶酶的基本特性：有3’→5’的核酸外切酶活性和5'→3’的DＮA聚合酶活性。在无dNTＰ时，可以从任何3’-OＨ端外切。在只有一种dＮTP时，外切至互补核苷酸。在四种dＮＴP均存在时,聚合活性占主导地位。Ｔ4-DNA聚合酶的基本用途:切平由核酸内切酶产生的3'粘性末端13。影响连接效率的因素有：温度（最主要的因素)离子浓度ATP的浓度(１0mM－1mＭ）连接酶浓度(平末端较粘性末端要求高）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比DNA末端性质DNA片段的大小14.如何将不同DNＡ分子末端进行连接?1。相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DＮA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种DNA分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺利的连接成一个重组ＤＮA分子2．平头末端的连接T４—DNＡ连接酶在ATＰ和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。3．不用粘性末端的连接３’端的粘性末端用T４-DＮA聚合酶切平５’端的粘性末端用ｋlｅnow酶补平，或者用S１核酸酶切平最后用T4-DＮA连接酶进行平末端连接15.碱性磷酸酶有什么作用?１.该酶用于载体ＤNＡ的5’末端除磷操作,以提高重组效率;2.用于外源DNA片段的5’端除磷，则可有效防止外源DNA片段之间的连接.１6.末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用?给载体或目的ＤNＡ加上互补的同聚物尾.DＮA片段3’末端的同位素标记。１7.2、细菌转化的步骤:感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素)的合成，使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的DＮA结合蛋白和核酸酶等。转化因子的结合.受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DＮA结构特异性结合，单链ＤＮA或ＲNA双链RNA以及DNＡ/RNＡ杂合双链都不能结合在膜上。转化因子的吸收.双链DＮＡ分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中.整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DＮA与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。转化因子单链DNＡ的整合。供体单链DNＡ片段通过同源重组，置换受体染色体DＮＡ的同源区域,形成异源杂合双链DNA结构。１8。Ｃa2+诱导转化原理：①在0℃的Ｃacl２低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀，同时Cａcｌ2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca２+能与加入的DNＡ分子结合，形成抗DＮA酶（ＤNａse）的羟基－磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当4２℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道.③Mg2+对DNＡ分子有很大的稳定性作用，因此利用Mｇcl２与Cａｃl２共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率.但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。19.ＰEG介导细菌的原生质体转化PEＧ是乙二醇的多聚物，存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组，此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。20．电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔，ＤNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法。Ｐ5２接合转化，入噬菌体感染未归纳2１．转化率的影响因素。载体及重组ＤNA方面载体本身的性质:不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体。插入片段大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：Cａ2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程λ噬菌体转染后的3０℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。表达外源基因,便于筛选和鉴定.2３．抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法.抗药性筛选法的基本原理:抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DＮＡ片段插在EcoRＩ位点:非重组子呈Aｐｒ、Ｔcr重组子呈Apr、Tcr将外源ＤＮA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcｒ重组子呈Aｐｒ、Ｔcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Aｐ的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ａp平板上生长,但在Tｃ平板上不长的转化子即为重组子P56抗药性标记插入失活选择法经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子.为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活，这种抗药性标记就会消失，从而筛选出阳性重组子。24．什么是蓝白斑筛选法？这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体.主要是在ｌ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的基因片段，携带有ｌａｃ基因片段的l载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴-4-氯-3—引哚—b—D—半乳糖苷（X—gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lａc(或laｃ基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-ｇａl的能力,转入ｌac—宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3-引哚-b—Ｄ-半乳糖苷（X—gａｌ)平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。25。ＰＣR筛选法利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCＲ，通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中。由于在载体ＤNA分子中，外源ＤNＡ插入位点的两侧序列多数是已知的，可以设计合成相应的PCR引物，以待鉴定的转化子或重组子的DＮＡ为模板进行PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带，并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子。基因工程的常规技术1。探针有哪些类型?探针标记有哪些方法?类型:同源或部分同源探针cDNＡ探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法４．什么是ＡBC荧光(显色酶)标记法？ABC标记法。Ａ为Aviｄin（生物素抗性蛋白),每个Avidｉn分子可结合３—４个生物素分子；B为Biｏtｉn（生物素），每个Biotiｎ分子可结合2个Ａvｉｄｉn分子;Ｃ为Cｏｍplex,首先将Biotiｎ共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Ａvｉdin上,两者形成复合物，即可将荧光胺标记在探针上，发出的荧光也能使普通胶片感光。如果将某一生色酶接在Ａvidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测，这一技术称为酶标技术５．亚克隆法亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定，获得含有目的基因的重组子。此时，该重组分子中的无关ＤNA区域以被大量删除。6.菌落(嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，经溶菌和变性处理后使DNＡ暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNＡ探针杂交,筛选出含有插入序列菌落。操作步骤：①菌落生长②转移到NC膜上③DＮA释放和变性（变成单链DＮA）:10%SDS０。５MNaOH④中和0。５MTｒis－HClpH8．０⑤固定８0℃１20'⑥杂交（包括预杂交，加探针DNA杂交)⑦放射自显影⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNＡ片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子。鸟枪法制备目的基因的主要步骤①目的基因组DNＡ片段的制备超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。（原核生物的基因长度大都在2Kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达1０0Kb以上）.全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开,大小不可控.部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端，目的基因完整。②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体。③重组DNＡ分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞。④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的DNＡ片段,必须通过次级克隆或插入灭活，在已克隆的DNA片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列。8。ｃDNA法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大，转录产物mＲNA易分离的目的基因。这种方法以目的基因的mRＮA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的ＤNＡ，即ｃＤＮA，然后在DＮA聚合酶的催化下合成双链ｃDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的ｃDNA克隆。9.mＲNＡ的分离纯化绝大多数的真核生物mRＮA在其３’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴，利用它可以迅速的将mRＮＡ从细胞总的混合物中分离出来，将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离，mＲＮＡ会挂在层析住上,后洗脱即可分离10.简述ＰCR技术的基本原理,ＰCＲ反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？PＣR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。过程：ＰCR由变性——退火—－延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNＡ的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNＡ解离,使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火（复性):模板DＮＡ经加热变性成单链后，温度降至5５℃左右,引物与模板DＮA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:ＤＮA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTＰ为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DＮＡ链互补的半保留复制链。重复循环变性-－退火-—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需２～4分钟,2～３小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。11．什么是基因组文库?其构建方法是怎样的？是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称ＤNＡ文库。基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备。②高纯度、大分子量基因组DＮＡ的提取.③基因组DＮＡ的部分酶切与分级分离。④载体与DNA片段的连接。⑤转化或侵染宿主细胞.⑥筛选鉴定基因组及保存.1２。基因组ＤＮA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DＮＡ文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选.基因文库的构建通常采用鸟枪法和ｃDNA法13。外源DNA片段的切割原则1。ＤNA片段之间要有一定的重叠序列2．ＤNA片段大小要均一14。ｃDＮA文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mＲNＡ的分离第一链cＤNA合成第二链cDNA合成双链cDNA的分级分离双链cＤＮA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖重组体的筛选与鉴定基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1.启动子启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小在20～30０个碱基，是控制基因转录的重要调控元件。在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关，而转录又在很大程度上影响基因的表达。启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2。启动子类型组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异.组织特异启动子:又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等.3．终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNＡ序列，基因转录时，该序列被转录为mRNA的一部分，并形成特殊的二级结构，由此终止基因的转录.4。SD序列SD序列:mＲNA中起始密码子上游8—13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与3０S亚基中的1６SrRＮA3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合,有助于mＲＮＡ的翻译从起始密码子处开始5。密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2．密码子与反密码子的相互作用的自由能3．细胞内tRNA的含量6．密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择.一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因7。包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8。包涵体的形成机理①折叠状态的蛋白质集聚作用.②非折叠状态的蛋白质集聚作用③蛋白折叠中间体的集聚作用。9。包涵体的分离检测包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤。10．分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素)分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶Ａ,导致细菌内外膜的通透性增大因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞.此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。11融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游,为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下,并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件.两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺.两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。１２.理想变性剂的特点1。变形溶解速度快２。对包含体中残留细胞碎片的分离没有干扰3。无温度依赖性4。对蛋白酶没有抑制作用５。对蛋白质的氨基酸侧链基团无化学反应活性１3．哺乳动物细胞的物理转化法１。磷酸钙共沉淀法２。电击转化法３.脂质体介导法４.显微注射法基因治疗1.基因治疗的概念与策略是什么？基因治疗：指应用DNA重组技术,将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗的目的。为达到这一目的,实施相应的策略。基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗2。基因治疗的基本程序是怎样的?基因治疗包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项基本内容。3.基因治疗的分子机制①正常基因：从健康人体内分离克隆，它或通过同源重组方式置换病变基因，或依靠其表达产物弥补病变基因的非功能性蛋白的生理作用。这类基因通常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病,如血友病、地中海贫血病以及由腺苷脱氨酶（ADA)基因缺陷所致的重度联合免疫缺陷症等。②反义基因：用于治疗病毒感染或肿瘤疾病。反义基因的体内表达产物（反义RＮA）或与病毒的激活因子编码基因互补(如艾滋病毒HIV)，或与肿瘤基因的mRＮA互补（如食道癌癌基因cmyc)，从而阻断其表达.③自杀基因：用于治疗癌症.很早人们就发现在病毒、细菌和真菌中存在一些酶，它们能将细胞中一些原本无毒的代谢物转化为毒性化合物,而这些酶在动物体内是不存在的.如果将它们转入肿瘤细胞,再辅以原代谢物或药物，就能杀灭癌细胞。因此这类酶称为自杀酶，相应的基因则为自杀基因.第八章途径工程1．途径工程定义根据底物在代谢反应中对通用性酶和特异性酶的使用要求,可将细胞内所有的生物分子分成两大类：一级基因产物，如tRNＡ、rＲＮA、多糖、酯类、蛋白质和核酸等,其生物合成和分解只需要有限的几种通用性的酶及蛋白因子，包括ＲNA聚合酶、RＮA剪切酶、DNA聚合酶、糖苷酶、脂酶、氨酰基－tRNA合成酶、肽基转移酶、核酸酶等二级基因产物，如氨基酸、维生素、抗生素、核苷酸等小分子化合物,它们的生物全合成和降解少则涉及几个基因多则需要几十个基因所编码的酶系,而且这些酶大都具有使用的特异性。上述合成和分解二级基因产物的酶系及其催化的生化反应，构成了一个个相互联系的代谢网络.它们均由若干个串联和并联的简单子途径组成，其中各子途径的并联交汇点称为节点。细胞代谢途径实质上就是与一组特定的流入和流出代谢物质相联系的任何一个合理可观察的生化反应序列。途径工程（ＰａtｈｗayＥnｇineering）：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DＮA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰、进而完成细胞特性改造的应用性学科。2.途径工程基本过程靶点设计根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点，通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或者拟阻断途径的靶点等.值得强调的是,靶点设计对途径工程的成败起着关键作用，任何精细的靶点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡的检验。基因操作利用途径工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNＡ上的稳定整合。效果分析对新途径进行全面的效果分析,由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷可以作为新一轮实验的改进目标。正像蛋白质工程实验所采用的研究策略，如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。基因工程习题2０17．9.８1．利用细菌大量生产人类胰岛素,下列叙述错误的是（)Ａ．用适当的酶对运载体与人类胰岛素基因进行切割与粘合B。用适当的化学物质处理受体细菌表面,将重组DNA导入受体细菌C．通常通过检测目的基因产物来检测重组DＮＡ是否已导入受体细菌D．重组DＮＡ必须能在受体细菌内进行复制与转录，并合成人类胰岛素2.采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的作法正确的是（)①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的ＤＮA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNＡ序列,与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列,与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中。A．①②ﻩB．②③ﻩC.③④ﻩD．④①3。基因工程是在DNA分子水平进行设计施工的，在基因操作的以下步骤中，不进行碱基互补配对的是（）①人工合成目的基因②E.coliDNA连接酶结合目的基因与运载体③将目的基因导入受体细胞④目的基因的检测和表达⑤个体生物学水平的鉴定。A．①③B．①⑤ﻩC．③⑤D。②③④4.．如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法．下列相关叙述中正确的是(）A.这三种方法都用到酶，都是在体外进行B．①②③碱基对的排列顺序均相同C．图示ａ、b、c三种方法均属人工合成法D.方法a不遵循中心法则5。．如图表示基因工程中目的基因的获取示意图,不正确的是（）Ａ。③表示ＰCR技术，用来扩增目的基因B.从基因文库中要得到所需的目的基因可以根据目的基因的相关信息来获取C.若获取的目的基因相同,则图中基因组文库小于cDNA文库D．若基因比较小，核苷酸序列又已知,则可以直接通过人工合成的方法获取6．。以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图．据图分析，下列说法正确的是（）A．催化②⑤过程的酶都是DＮA聚合酶，都能耐高温Ｂ。催化①过程的酶是ＲNA聚合酶C．④过程发生的变化是引物与单链DNＡ结合Ｄ．如果RNA单链中Ａ与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链ＤNA中,A与U之和也占该DNA碱基含量的40%7。.下列关于质粒的叙述，正确的是(）Ａ．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器Ｂ.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的Ｃ．质粒只有在导入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制D.质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状ＤNA分子８。。科学家常选用的细菌质粒往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是（）A．提高受体细胞在自然环境中的耐热性B.有利于检测目的基因否导入受体细胞Ｃ．增加质粒分子的相对分子质量D．便于与外源基因连接9。.下列关于基因工程工具的说法不正确的是（）A．构建基因文库和构建基因表达载体都需要限制酶和DＮA连接酶B。DＮA连接酶对所连接的DNＡ两端碱基序列有专一性要求Ｃ。载体能将外源基因导入受体细胞并使其在受体细胞中稳定遗传并表达D。在基因工程操作中,被用作载体的质粒，都是经过人工改造的1０．下列叙述符合基因工程概念的是（）Ａ。在细胞内将ＤNＡ进行重组,赋予生物新的遗传特性B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌,使其DＮA发生改变,通过筛选获得青霉素高产菌株Ｄ。自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DＮA上1１。下列四条DNA分子,彼此间具有互补粘性末端的一组是（)Ａ。①② Ｂ．②④ C.③④ D．②③12．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是()Ａ．重组DNＡ技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快Ｄ．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达１3。下列提到的物质不是基因工程常用的工具的是（)①限制性核酸内切酶②ＤNA聚合酶③DNA连接酶④运载体⑤解旋酶．A。②④⑤ﻩB．①③④ C。①②③ﻩD。②⑤１４.如图是利用基因工程技术培育转基因植物,生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SｍａⅠ、EcｏＲⅠ、ＡｐaⅠ为四种限制酶。下列说法错误的是（）Ａ.图示过程是基因工程的核心步骤B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC。抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D。除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构１5.一种质粒和人的胰岛素基因存在的限制酶的酶切位点(用Ｅ１表示)如图所示，ａ表示标记基因，ｂ表示胰岛素基因．现用该种限制酶分别切割质粒和胰岛素基因,然后用DNA连接酶连接切割后的质粒和胰岛素基因，最不可能出现的是（）A。ﻩＢ．ﻩC。ﻩＤ．１6.利用乳腺生物反应器生产药用蛋白是动物基因工程的重要应用，目前科学家已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α﹣抗胰蛋白酶等医药产品．下列有关乳腺生物反应器的叙述错误的是(）Ａ。受体细胞可选用受精卵或胚胎干细胞Ｂ。获得转基因动物需利用胚胎移植技术C．鉴别药用蛋白基因是否导入受体细胞一般利用分子杂交法Ｄ。转基因动物产生的生殖细胞可能含有药用蛋白基因１7。美国科学家将萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达，长成的植物通体光亮，堪称奇迹．下列有关发光烟草培育的叙述正确的是()A．在培育过程中需用同一种限制酶分别切割荧光素基因和质粒Ｂ．将目的基因直接导入烟草细胞常用的方法是显微注射法Ｃ．受体细胞只能用烟草的受精卵，因为受精卵的全能性最高D．导入目的基因的烟草细胞不需进行植物组织培养就能发育成一个完整的植株18。现有一长度为10０0碱基对（by）的ＤNA分子，用限制性核酸内切酶EcoＲ1酶切后得到的ＤNＡ分子仍是１０00ｂy，用Kpｎ１单独酶切得到40０by和6０0bｙ两种长度的DＮA分子,用EｃｏRⅠ，KpnⅠ同时酶切后得到200by和6０0ｂy两种长度的DNA分子.该ＤNA分子的酶切图谱正确的是（）A.ﻩB.C．D.１９．下列何种技术能有效地打破物种的界限，定向地改造生物的遗传性状，培育农作物的新的优良品种A.基因工程技术ﻩB。诱变育种技术ﻩC。杂交育种技术ﻩD.组织培养技术20。科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶蛋白．以下有关该基因工程的叙述错误的是（）A。采用逆转录的方法得到的目的基因B．DNA分子杂交技术可以用来检测人奶基因是否表达Ｃ。马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞D．用同种限制酶处理质粒和含有目的基因的DNＡ,可产生黏性末端而形成重组DNA分子21。下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是(）①一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列；②限制性核酸内切酶的活性受温度影响；③限制性核酸内切酶能识别和切割ＲNA；④限制性核酸内切酶可从原核生物中提取；⑤限制性核酸内切酶的操作对象是原核细胞。A．②③ﻩB．③④ﻩＣ．③⑤ D．①⑤２2.关于基因工程和蛋白质工程的说法正确的是()A.都是分子水平上的操作B．基因工程就是改造基因的分子结构C．蛋白质工程就是改造蛋白质的分子结构D．基因工程和蛋白质工程都能创造出自然界根本不存在的蛋白质２3。下列关于各种与基因工程有关酶的叙述，不正确的是（)Ａ。DＮA连接酶能将２个具有末端互补的DＮA片段连接在一起B．PCＲ反应体系中的引物可作为ＤNA聚合酶作用的起点C．限制酶的活性受温度影响D。逆转录酶是以核糖核苷酸为原料，以RＮA为模板合成互补DNA24．根据基因工程的有关知识,回答下列问题：（1）基因工程的基本操作程序的第四步。目前获取目的基因常用的方法有、和。（2）限制性内切酶切割DＮA分子后产生的片段，其末端类型有。（３）质粒载体用ＥcoRⅠ切割后产生的片段如下：为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EｃoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是.（４)按其来源不同,基因工程中所使用的ＤNＡ连接酶有两类,即DNＡ连接酶和Ｅ·coｌｉDNA连接酶。(5)反转录作用的模板是，产物是。若要在体外获得大量反转录产物,常采用技术，此技术中需要的酶是。（6)基因工程中除质粒外,和也可作为运载体。（7）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是。(8)被称为第二代基因工程，它的基本途径有四步，其中第二步是。2５.如图是利用基因工程技术产生人胰岛素的操作过程示意图，请据图回答:(1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？原因是．（２）过程②必须的酶是，过程③必须的酶是．(3）若A中共有a个碱基对,其中鸟嘌呤有ｂ个,则③④⑤连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶个.（４）图中B应该符合的条件为、、．（5)为使过程⑧更易进行可用药剂处理D.26。某质粒上有SａlＩ、Ｈindｍ、ＢaｍHI三种限制酶切割位点,同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示，请回答下列问题。（１）将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状,这种新性状(变异性状）的来源属于__＿___。

（2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞,一般情况下，烟草不会具有抗盐特性,原因是抗盐基因在烟草细胞中不能______，也不能______。ﻫ（3)在构建重组质粒时，应选用____＿_和＿_＿___两种隳对__＿＿__和_____＿进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性.ﻫ（４)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤.为筛选出导入了重组质粒的农杆菌,下图表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有_＿＿___、__＿___。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是__＿___菌落中的细菌.为了确定抗盐烟草是否培育成功,既要用放射性同位素标记的___＿＿_作探针进行分子杂交检测，又要用_＿＿_＿＿方法从个体水平鉴定烟草植株的耐盐性。ﻫ（5)将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用_＿_＿___技术，愈伤组织经__＿___进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加.２7。某一质粒载体如图所示,外源DＮA插入到Aｍpr或Tｅtr中会导致相应的基因失活（Ａmpr表示氨苄青霉素抗性基因,Ｔetr表示四环素抗性基因).有人将此质粒载体用ＢamHI酶切后