植物生物技术在生物制药中的作用课件

(块根/块茎）储藏器官特异启动子GoldenPotatoβ-胡萝卜素高含量马铃薯(块根/块茎）储藏器官特异启动子GoldenPotatoβ1功能基因（目的基因）：原始基因；改进版的基因，如单子叶植物密码子偏好基因；双子叶植物密码子偏好基因；含信号肽基因（定位蛋白在细胞中表达的位置）等终止子：基因转录终止信号基因表达盒可以自己构建，也可以公司合成功能基因（目的基因）：原始基因；改进版的基因，如单子叶植物密2第二步：转基因及转基因植株的培育农杆菌法基因枪法第二步：转基因及转基因植株的培育农杆菌法基因枪法3第三步：转基因植株的鉴定、评价与筛选——转基因植株鉴定：报告基因、PCR，SouthernBlot（DNA杂交）——转基因植株评价（栽培与分析）：不同转基因植株的表现不一样——将符合要求的转基因植株培育成新的品种第三步：转基因植株的鉴定、评价与筛选——转基因植株鉴定：报告4

对照番茄

转Bt番茄Bt烟草苏云金芽胞杆菌毒素蛋白基因（BT）对照烟草植物转基因技术在农作物大豆、油菜、玉米、棉花、番茄等植物上得到成功应用对照番茄转Bt番茄Bt烟草苏云金芽胞杆菌毒素蛋白5将苏云金杆菌杀虫蛋白（Bt）基因转入植物，培育出抗虫新品种转基因对照对照转基因抗虫烟草抗虫棉花将苏云金杆菌杀虫蛋白（Bt）基因转入植物，培育出抗虫新品种转6抗虫转基因棉花获大面积推广抗虫转基因棉花获大面积推广7转基因水稻抗性栽培试验转基因水稻抗性栽培试验8IngoPotrykus:GoldenRice金色稻米

β-胡萝卜素=维生素AScience（2000）IngoPotrykus:GoldenRice金色稻9Paineetal.Nat.Biotechnol.

23,482-487(2005)：优化了基因，β-胡萝卜素含量提高23倍Paineetal.Nat.Biotechnol.10转基因植物生产药物蛋白植物基因工程技术的发展为利用植物作为生物反应器生产有用蛋白成为可能，诞生了分子农业（分子农场）=MolecularFarming利用基因工程技术将特定的基因转入植物中，通过栽培转基因植物生产具有治疗、诊断、或者工业用途的蛋白或多肽。转基因植物生产药物蛋白11分子农业示意图分子农业示意图12药物蛋白（人、家禽家兽用）：疫苗、抗体、生长因子、生长激素等。——微生物体系：产量高、成本低，但有时无活性——动物细胞体系：有活性；细胞培养环境和产品分离纯化苛刻，成本高，纯化难（病原、过敏原）药物蛋白（人、家禽家兽用）：疫苗、抗体、生长因子、生长激素13——植物体系：可行：可以进行蛋白翻译后的加工、形成有活性的物质）；安全性好：人与植物没有共患疾病，人对常用作物不过敏；成本低：农作物种植投入少，可机械化大规模种植；可储藏：1-3年以上使用方便：疫苗可以直接使用（香蕉、番茄等）——植物体系：14学术结构和商业公司对分子农业兴趣浓厚，近20年发展迅速20多年来转基因植物生产药物蛋白的论文数量（近1000篇，100多项专利）学术结构和商业公司对分子农业兴趣浓厚，近20年发展迅速20多15药物蛋白的种类：疫苗、抗体、生长激素、细胞因子、膜蛋白、酶等药物蛋白的种类：疫苗、抗体、生长激素、细胞因子、膜蛋白、酶等16美国2002-2005年批准进行试验的植物来源的重组蛋白美国2002-2005年批准进行试验的植物来源的重组蛋白17浏览以下网站可了解更多转基因植物生产的药物蛋白和工业用蛋白的研发情况：/PMPs-and-PMIPs.html浏览以下网站可了解更多转基因植物生产的药物蛋白和工业用蛋白的18TransgenicResearch13:245–259,2004

RecombinantproteinexpressionplasmidsoptimizedforindustrialE.colifermentationandplantsystemsproducebiologicallyactivehumaninsulin-likegrowthfactor-1intransgenicriceandtobaccoplants

MitraPanahi1,ZamanAlli1,XiongyingCheng1,LoubabaBelbaraka2,JaafarBelgoudi2,RavinderSardana1,JennyPhipps2&IllimarAltosaar1,*

1DepartmentofBiochemistry,MicrobiologyandImmunology,FacultyofMedicine,UniversityofOttawa,Canada2SteacieInstituteforMolecularSciences,NationalResearchCouncilofCanada,Ottawa,Ontario,K1AOR6,Canada

TransgenicResearch13:245–2519humaninsulin-likegrowthfactor-1=hIGF-1，人胰岛素样生长因子-1asingle-chainpeptideof70aminoacidresiduessharing50%homologywithhumaninsulin.SynthesisofhIGF-1:

Mainlyintheliverandregulatedbyseveralfactorssuchashumangrowthhormonesandinsulin.MainfunctionsofhIGF-1:

1Beingessentialfornormalfetalgrowthanddevelopment;2Stimulatingproliferationandsurvivalofmanycelltypes;3Promotingdifferentiationofalimitedcelltypes.

humaninsulin-likegrowthfact20LarondwarfismhIGF1playsanimportantroleinchildhoodgrowth.InabilitytomakeorrespondtohIGF1producesadistinctivetypeofgrowthfailuretermedLarondwarfism.hIGF1continuestohaveanaboliceffectsinadults.

LarondwarfismhIGF1playsani21TheclinicalimportanceofhIGF-1hIGF-1canincreaseinsulinsensitivityandpossesseshypoglycemiceffectssimilartoinsulin,sohIGF-1maybecomeasubstitutetherapeuticagentforthepeoplewhoseinsulinreceptorshavefunctionaldefects,especiallyforthosewhohaveoneormoreofthefollowingproblems:1.

Growthhormone-sensitive(Laron-type)syndrome;2.TypeAinsulinresistancesyndrome;3.Diabetes;4.Osteoporosis;5.Acquiredimmunodeficiencysyndrome(AIDS).

ThedemandforhIGF-1islikelytoincreaseinthefuture.TheclinicalimportanceofhIG22ProductionofhIGF-1RecombinanthIGF-1(rthIGF-1)hasbeenexpressedinseveraldifferenthost–vectorsystems:

Inyeast:8to55mg/Lculture(Vaietal,2000);

InE.coli:

8.5g/Lculture,butalmostalltheIGF-1werenotsoluble(inaggregates)

(Jolyetal.,1998);

Intransgenicrabbits:ahomozygousoffspringproduced678mg/Lmilk(Zinovievaetal.,1998).ProductionofhIGF-1Re23LimitationsinthepresentsystemsexpressinghIGF-1:1.Notsolubleinbacteria;2.Formationofnon-nativeproteinshavingdifferentbiologicalactivitiesinyeast;3.Transgeneinducedinstabilityofcertaincelllinesinmammaliancellcultures;4.Contaminationofanimal-basedproductswithhumanpathogensinmammaliancellcultures;5.Highcostsofmammaliancellcultures.Limitationsinthepresentsys24Potentialadvantagesofexpressingrecombinantproteinsinplants:1.Minimalriskofcontaminationbypathogenicmicroorganisms;2.Theabilitytoeffectpost-translationalmodificationsresultinginauthenticproducts;3.HighyieldsofstableproductsbyaddingplantsignalsequencesandincreasingG+Ccontentofthecodingsequences;4.Lowscale-upcosts;5.Edibletissuescanbetargetedforprecisetissue-specificaccumulationofrecombinantproteins.Potentialadvantagesofexpres25Figure1-1.TherthIGF-1expressionconstructsusedfortransformationoftobaccoandriceplants.ThegeneconstructscontainingthehIGF-1sequences(210bp)wereplacedunderthecontrolofthemaizeubiquitin1promoter(PanelsA–C).表达载体适合大肠杆菌的基因普通基因适合植物的基因Figure1-1.TherthIGF-1expre26ProductionoftobaccoandriceviaAgrobacterium-mediation

ThetransgenicplantsandhIGF-1geneexpressionintheplantswereconfirmedbySouthernblots,RT-PCRandWesternBlots.Productionoftobaccoandrice27DidthetransgenicplantsproducehIGF-1?

Yes.hIGF-1detectionbyELISAshowedthatallthetransgenictobaccoorriceplantsproducedhIGF-1intheirleaves,buttheyieldsvarieddramaticallyamongthem.Didthetransgenicplantsprod28Figure1-2.AmountsofrthIGF-1(ngofrthIGF-1/mgoftotalprotein)ineachplantextract.TobaccoRiceProductionofhIGF-1intransgenicplantsFigure1-2.AmountsofrthIGF-29PlantsGroupsPromoterSignalsequencesCodingsequenceRangeofhIGF1levelsMeansofhIGF1levelsTobaccopUIGF-1

ubiquitin1

NoSSE.coli-codonoptimized4–129ng/mg26±7ngTobaccopULamB-IGF-1

ubiquitin1BacterialLamBSSE.coli-codonoptimized5–73ng/mg22±4ngTobaccopUSYN-IGF-1

ubiquitin1RiceprolaminSSplant-codonoptimized8–241ng/mg70±13ngRice

pUIGF-1

ubiquitin1

NoSSE.coli-codonoptimized15–371ng/mg113±24ngPlantsGroupsPromoterSignalseq30(块根/块茎）储藏器官特异启动子GoldenPotatoβ-胡萝卜素高含量马铃薯(块根/块茎）储藏器官特异启动子GoldenPotatoβ31功能基因（目的基因）：原始基因；改进版的基因，如单子叶植物密码子偏好基因；双子叶植物密码子偏好基因；含信号肽基因（定位蛋白在细胞中表达的位置）等终止子：基因转录终止信号基因表达盒可以自己构建，也可以公司合成功能基因（目的基因）：原始基因；改进版的基因，如单子叶植物密32第二步：转基因及转基因植株的培育农杆菌法基因枪法第二步：转基因及转基因植株的培育农杆菌法基因枪法33第三步：转基因植株的鉴定、评价与筛选——转基因植株鉴定：报告基因、PCR，SouthernBlot（DNA杂交）——转基因植株评价（栽培与分析）：不同转基因植株的表现不一样——将符合要求的转基因植株培育成新的品种第三步：转基因植株的鉴定、评价与筛选——转基因植株鉴定：报告34

对照番茄

转Bt番茄Bt烟草苏云金芽胞杆菌毒素蛋白基因（BT）对照烟草植物转基因技术在农作物大豆、油菜、玉米、棉花、番茄等植物上得到成功应用对照番茄转Bt番茄Bt烟草苏云金芽胞杆菌毒素蛋白35将苏云金杆菌杀虫蛋白（Bt）基因转入植物，培育出抗虫新品种转基因对照对照转基因抗虫烟草抗虫棉花将苏云金杆菌杀虫蛋白（Bt）基因转入植物，培育出抗虫新品种转36抗虫转基因棉花获大面积推广抗虫转基因棉花获大面积推广37转基因水稻抗性栽培试验转基因水稻抗性栽培试验38IngoPotrykus:GoldenRice金色稻米

β-胡萝卜素=维生素AScience（2000）IngoPotrykus:GoldenRice金色稻39Paineetal.Nat.Biotechnol.

23,482-487(2005)：优化了基因，β-胡萝卜素含量提高23倍Paineetal.Nat.Biotechnol.40转基因植物生产药物蛋白植物基因工程技术的发展为利用植物作为生物反应器生产有用蛋白成为可能，诞生了分子农业（分子农场）=MolecularFarming利用基因工程技术将特定的基因转入植物中，通过栽培转基因植物生产具有治疗、诊断、或者工业用途的蛋白或多肽。转基因植物生产药物蛋白41分子农业示意图分子农业示意图42药物蛋白（人、家禽家兽用）：疫苗、抗体、生长因子、生长激素等。——微生物体系：产量高、成本低，但有时无活性——动物细胞体系：有活性；细胞培养环境和产品分离纯化苛刻，成本高，纯化难（病原、过敏原）药物蛋白（人、家禽家兽用）：疫苗、抗体、生长因子、生长激素43——植物体系：可行：可以进行蛋白翻译后的加工、形成有活性的物质）；安全性好：人与植物没有共患疾病，人对常用作物不过敏；成本低：农作物种植投入少，可机械化大规模种植；可储藏：1-3年以上使用方便：疫苗可以直接使用（香蕉、番茄等）——植物体系：44学术结构和商业公司对分子农业兴趣浓厚，近20年发展迅速20多年来转基因植物生产药物蛋白的论文数量（近1000篇，100多项专利）学术结构和商业公司对分子农业兴趣浓厚，近20年发展迅速20多45药物蛋白的种类：疫苗、抗体、生长激素、细胞因子、膜蛋白、酶等药物蛋白的种类：疫苗、抗体、生长激素、细胞因子、膜蛋白、酶等46美国2002-2005年批准进行试验的植物来源的重组蛋白美国2002-2005年批准进行试验的植物来源的重组蛋白47浏览以下网站可了解更多转基因植物生产的药物蛋白和工业用蛋白的研发情况：/PMPs-and-PMIPs.html浏览以下网站可了解更多转基因植物生产的药物蛋白和工业用蛋白的48TransgenicResearch13:245–259,2004

RecombinantproteinexpressionplasmidsoptimizedforindustrialE.colifermentationandplantsystemsproducebiologicallyactivehumaninsulin-likegrowthfactor-1intransgenicriceandtobaccoplants

MitraPanahi1,ZamanAlli1,XiongyingCheng1,LoubabaBelbaraka2,JaafarBelgoudi2,RavinderSardana1,JennyPhipps2&IllimarAltosaar1,*

1DepartmentofBiochemistry,MicrobiologyandImmunology,FacultyofMedicine,UniversityofOttawa,Canada2SteacieInstituteforMolecularSciences,NationalResearchCouncilofCanada,Ottawa,Ontario,K1AOR6,Canada

TransgenicResearch13:245–2549humaninsulin-likegrowthfactor-1=hIGF-1，人胰岛素样生长因子-1asingle-chainpeptideof70aminoacidresiduessharing50%homologywithhumaninsulin.SynthesisofhIGF-1:

Mainlyintheliverandregulatedbyseveralfactorssuchashumangrowthhormonesandinsulin.MainfunctionsofhIGF-1:

1Beingessentialfornormalfetalgrowthanddevelopment;2Stimulatingproliferationandsurvivalofmanycelltypes;3Promotingdifferentiationofalimitedcelltypes.

humaninsulin-likegrowthfact50LarondwarfismhIGF1playsanimportantroleinchildhoodgrowth.InabilitytomakeorrespondtohIGF1producesadistinctivetypeofgrowthfailuretermedLarondwarfism.hIGF1continuestohaveanaboliceffectsinadults.

LarondwarfismhIGF1playsani51TheclinicalimportanceofhIGF-1hIGF-1canincreaseinsulinsensitivityandpossesseshypoglycemiceffectssimilartoinsulin,sohIGF-1maybecomeasubstitutetherapeuticagentforthepeoplewhoseinsulinreceptorshavefunctionaldefects,especiallyforthosewhohaveoneormoreofthefollowingproblems:1.

Growthhormone-sensitive(Laron-type)syndrome;2.TypeAinsulinresistancesyndrome;3.Diabetes;4.Osteoporosis;5.Acquiredimmunodeficiencysyndrome(AIDS).

ThedemandforhIGF-1islikelytoincreaseinthefuture.TheclinicalimportanceofhIG52ProductionofhIGF-1RecombinanthIGF-1(rthIGF-1)hasbeenexpressedinseveraldifferenthost–vectorsystems:

Inyeast:8to55mg/Lculture(Vaietal,2000);

InE.coli:

8.5g/Lculture,butalmostalltheIGF-1werenotsoluble(inaggregates)

(Jolyetal.,1998);

Intransgenicrabbits:ahomozygousoffspringproduced678mg/Lmilk(Zinovievaetal.,1998).ProductionofhIGF-1Re53LimitationsinthepresentsystemsexpressinghIGF-1:1.Notsolubleinbacteria;2.Formationofnon-nativeproteinshavingdifferentbiologicalactivitiesinyeast;3.Transgeneinducedinstabilityofcertaincelllinesinmammaliancellcultures;4.Contaminationofanimal-basedproductswithhumanpathogensinmammaliancellcultures;5.Highcostsofmammaliancellcultures.Limitationsinthepresentsys54Potentialadvantagesofexpressingrecombinantproteinsinplants:1.Minimalriskofcontaminationbypathogenicmicroorganisms;2.Theabilitytoeffectpost-translationalmodificationsresultinginauthenticproducts;3.HighyieldsofstableproductsbyaddingplantsignalsequencesandincreasingG+Ccontentofthecodingsequences;4.Lowscale-upcosts;5.Edibletissuescanbetargetedforprecisetissue-specificaccumulationofrecombinantproteins.Potentialadvantagesofexpres55Figure1-1.TherthIGF-1expressionconstructsusedfortransformationoftobaccoandriceplants.ThegeneconstructscontainingthehIG