生物化学课件第六章核酸化学代谢DNA合成

第七节DNA的生物合成（复制）

DNAReplicationP361

第七节DNA的生物合成（复制）

DNAReplica1

DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。DNARNA蛋白质复制复制转录反转录翻译遗传信息传递的中心法则病毒

DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继192DNA的生物合成：细胞内合成DNA的过程1、复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。

四种核苷酸（dATP\dTTP\dCTP\dGTP）

2、反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。3、修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。DNA的生物合成：细胞内合成DNA的过程31、DNA的半保留复制

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。一、DNA复制1、DNA的半保留复制

DNA在复制时，两条4DNA的半保留复制实验依据

1958年M.Meselson和F.W.Stahl用大肠杆菌为材料，在含15N和14N的NH4cl中培养证实，用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA在离心管中的沉降位置P361培养12代培养1代培养2代DNA的半保留复制实验依据1958年M.Mesels52、原核生物DNA聚合反应有关的酶类

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引发体primosome

：启动RNA引物链的合成。

(3）DNA连接酶（DNAligas（4）DNA解链酶：ATP供能解开DNA双链(5）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。

(6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。能改变DNA空间构型的酶，合成后再引向超螺旋。机制：切开环状一条链解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物2、原核生物DNA聚合反应有关的酶类

（1）DNA聚合酶(D6（1）DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链只能加到已有核苷酸的游离3’羟基上，不能自身聚合，需引物p363（1）DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´7大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的酶分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用聚合速率（nt/s）DNA聚合酶Ⅰ109000单链多肽400+++16-20120000单链多肽100++-40400，000（10种亚基）10-20++-250-1000比较项目DNA聚合酶III切除引物,校对，修复修复复制功能

1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）P364大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA分子量DNA109000单8DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点（I、II、III）3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点（I、II、III）9DNA聚合酶5´-3´外切酶活力（I）

5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´切除引物,修复DNA聚合酶5´-3´外切酶活力（I）

5´-3´核酸外10大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能（10个亚基）延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNA核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化组建核心酶P364大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能（10个亚基）11图11-8DNAPolIII的二聚体作用生物化学课件第六章核酸化学代谢DNA合成12（2）连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP（噬菌体和动物）或NADH（细菌）AMP+PPiATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链DNA复制、损伤修复、重组P367（2）连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP（噬菌体和动物）AM133、原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

semidiscontinuousreplication

P3683、原核细胞DNA的半不连续复制P36814（1）复制的起始点与方向

亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动。⊙复制起始点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点。原核：仅含一个，约245bp,特殊的重复序列。真核：多个起始点例：酵母17号染色体含400个。⊙复制方向：含三种机制一个起点2个叉，不同方向合成两条链，此为常见方式。2个起点，2个叉，各合一条链（腺病毒）。一个起点一个叉，同方向合成两条链（质粒ColEI）--单向复制（1）复制的起始点与方向15DNA的双向和单向复制----起始环状

DNA复制时所形成的O结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制DNA的双向和单向复制----起始环状DNA复制时所形成的16大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型DnaA识别起始点在复制起点特异部位解开双链DNAP368大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT17（2）原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向解旋酶解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´P369,393,274DNA聚合酶III切除引物、缺口填补、校对（2）原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向18聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）活化引物合成酶P370聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶II19复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物体引物体解旋酶解旋酶引物合成酶DnaG蛋白前导链和随后链被同一个DNA聚合酶III不对称二聚体合成复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物20（3）大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁体终止子位点连锁体在细胞分裂前必须解开，否则导致细胞分裂失败，细胞死亡。两个复制叉从起始反向移动至约180O的对面终止区相遇（3）大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止21（4）复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5X109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:

DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7

X10-6

）

DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’

外切酶切除）起始时以RNA作为引物P374（4）复制的忠实性DNA复制过程是一个高度精22DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´23

起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’-5’外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以5’-3’外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。（RNA聚合酶无校对功能，不需引物，可以从头合成）

起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为244、真核生物复制的特点（1）复制速度：是原核的1/10，但复制起始点多。（2）引物和冈琦片段小于原核，引物为10个，片段100~200；原核引物十几~几十，片段1000~2000。（3）复制需DNApol及多种因子参加，pol

pol在核内起主要作用。（4）pol为线粒体复制酶。（5）DNA复制位于细胞周期的S期。4、真核生物复制的特点25真核细胞DNA复制的特点多个起点复制起点起点起点起点起点起点真核生物DNA聚合酶端粒（telemere）的复制真核细胞DNA复制的特点多个起点复制起点起点起点起点起点26真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亚基数细胞内分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多个细胞核～80%无120，000二个细胞核和线粒体2～15%3-5外切酶400，000二个细胞核+10～25%3-5外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一个细胞核10～15%无核DNA合成线粒体DNA合成引物合成

修复功能真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00027

真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期。染色体DNA是线性结构。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA单链母链如果不填补成双链，就会被核内Dnase酶解。某些低等生物染色体经多次复制会越来越短。

真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后28端粒端粒：真核生物线性染色体的两个末端具有特殊结构称为端粒。端粒由许多成串的短的重复序列组成。一条链上富含G，如人的端粒TTAGGG，原生动物四膜虫为TTGGGG,植物

TTTAGGG。端粒的功能：稳定染色体末端结构，防止末端染色体降解；防止染色体间末端连接。（原核生物染色体是环状的，5´末端冈奇片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA链向前延伸填补。）端粒29端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清。

端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它以自身携带的RNA为模板，催化互补链DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。

端粒酶含150个碱基RNA链。端粒酶结合到端粒的3´末端上，以RNA链5´末端识别DNA3´末端并合成互补链，端粒3´单链末端回折作为引物合成其互补链。端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物30

缺乏端粒酶活性时，细胞分裂将端粒不断缩短，引起细胞生长停止甚至死亡。肿瘤细胞端粒活性高，设想端粒酶作为抗癌治疗的靶位点。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。

缺乏端粒酶活性时，细胞分裂将端粒不断缩短，引起细胞生31

端粒和端粒酶的发现历程——记诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔奖主页上介绍她/他们获奖的原因是揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”（染色体是如何被端粒和端粒酶保护的）

端粒和端粒酶的发现历程——记诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔奖主32

p373

p37333

34真核和原核DNA细胞复制比较

拓扑酶DNA复制后DNA超螺旋装配成染色体真核和原核DNA细胞复制比较35小结：一、半不连续合成在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链是不连续合成。体内仅含催化5’3’合成的DNA酶。60年代冈琦片段的发现解决了这个问题：合成5’3’前导链（leadingstrand）是连续的，方向与复制叉一致。合成3’

5’随从链时，方向与叉相反，合成不连续，各片段连成一条链。小结：在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另36二、复制过程和参与酶及因子（一）复制的起始（分两步）1、螺旋的松弛与解链（1）拓扑异构酶---能改变DNA空间构型的酶作用：DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化体外拓扑异构化反应，分两型。二、复制过程和参与酶及因子37拓扑异构酶I

（topoisomerase--I）作用：松弛超螺旋，不需ATP,

机制：切开环状一条链打结与解结环状双链DNA的合成环连与解环连原核：对负超螺旋正真核：对正、负均有作用。拓扑异构酶II----旋转酶（gyrase）作用：松弛超螺旋松+ATP

超（-）切开环状两条链打结与解结环连与解环连拓扑异构酶I（topoisomerase--I）作38（2）解链酶（helicase）------复制蛋白rep作用：ATP供能时，解开DNA双链。原核：编码解链酶的基因是dnaB,DnaB表示蛋白产物。前导链结合rep蛋白，随从链结合解链酶IIⅢ。（3）单链结合蛋白-singlestrandbindingprotein-SSB作用：SSB与解开DNA单链结合，保护稳定DNA。与新复制DNA单链结合，以防降解。超螺旋DNA拓扑酶松弛解链酶解开双链

SSB复制开始生物化学课件第六章核酸化学代谢DNA合成392、引发（需引发酶及引发前体参与）（1）引物酶（primase）作用：以DNA为模板，自5’3’合成RNA小片段,3’末端为-OH，长短：十几到几十个核苷酸。原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶。（2）引发前体（preprimosome）由多种蛋白因子组成复合物。作用：合成RNA引物，沿随从链复制叉的行进方向移动，在不同部位，合成RNA引物。总结：合成RNA引物，在引物3’-OH末段进行DNA片段合成。（二）DNA链的延长反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，

dNTP，引物，Mg2+离子

2、引发（需引发酶及引发前体参与）40过程：引物3’-OHdNTPppi引物-dNMP反应式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi反应机理：磷亲核攻击。真核与原核中DNA聚合酶有几种类型，作用方式相同，但各具特性及功能。1、大肠杆菌DNA聚合酶（3种）（1）pol：催化5’3’的聚合作用，合成20个核苷酸即离开模板，填充空隙。有3’5’外切酶活性，去除错误碱基的校对作用。有5’3’外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。（2）pol：5’3’DNA合成及3’5’外切酶活性，体内功能不清楚。（3）polⅢ:DNA链延长起主要作用，细菌中1000个dNTP/秒加入。3’5’外切酶活性，校对作用，与pol配合错误率降至10-6。（4）DNA复制的保真性：过程：引物3’-OHdNTPppi引物-41Pol:与引发酶配合，参与随从链的合成。RFA(replicationfactorA):DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用。（三）终止

连接酶：作用--使相邻的DNA片段,以3’5’磷酸二酯键相连，需ATP。

前导链是连续合成的，随从链在连接酶作用下连成一条链。

拓扑酶DNA复制后DNA超螺旋装配成染色体2、真核生物DNApol特性与大肠杆菌相似，共五种：pol：催化前导链及随从连的合成，需增殖细胞核抗原蛋白PCNA（proliferatatingcellnucleusantigen-PCNA）的参与。Pol:与引发酶配合，参与随从链的合成。42二、

逆转录作用1、概念2、逆转录酶3、逆转录的生物学意义扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶三种功能依赖RNA的DNA聚合酶活力

以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。P276核糖核酸酶H活力：水解RNA-DNA分子中RNA；具有

3’--5’和5’--3’核酸外切酶作用依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力二、逆转录作用1、概念2、逆转录酶3、逆转录的生物43逆转录过程中cDNA的合成

依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力水解RNA依赖DNA的DNA聚合酶逆转录过程中cDNA的合成

依赖RNA的DNA聚合酶核糖核44

反转录酶病毒（retrovirus）

性质：一类RNA病毒，含反转录酶，因致癌又称RNA肿瘤病毒。

组成：核心RNA，蛋白外壳。

病毒生活周期：早、晚两期早期：进入细胞后放出病毒RNADNA整合进宿主染色体。晚期：转录和翻译。HIV-人类免疫缺陷病毒：感染人T4淋巴细胞,使病人丧失免疫能力,死于感染。不与外界接触的胸腺、骨髓、脾脏、扁桃腺及淋巴结等称内分泌淋巴系统。胸腺位于胸骨后，能生产淋巴细胞（T细胞），能诱导细胞免疫，调动吞噬细胞等包围、吞噬并将病原菌消灭。

反转录酶病毒（retrovirus）45逆逆转录病毒的生活周期生活周期RNA衣壳被膜逆转录酶转录转译整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞丢失被膜丢失衣壳逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶逆逆转录病毒的生活周期生活周期RNA衣壳被膜逆转录酶转录转译46三、

DNA的损伤与修复

某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤.DNA的修复主要有以下类型:暗修复1、光裂合酶修复2、切除修复3、重组修复三、DNA的损伤与修复某些物理化学因47DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体2、光复合酶48DNA的损伤和切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶插入酶碱基取代DNA的损伤和切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸49DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制DNA聚合酶DNA连接酶重组DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制D50

四、DNA的突变

DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。（一）突变的类型

碱基对的置换(substitution)

移码突变(framesshiftmutation)四、DNA的突变

DNA分子中的核苷酸序列51

DNA突变的类型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-转换野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT嘧啶间、嘌呤间嘧啶与嘌呤间DNA突变的类型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-52

（二）突变的意义1、进化、分化的分子基础。2、基因型改变。（表型不变）3、致死性的突变。（消灭病原体）4、某些疾病的发病基础。（三）诱变剂碱基类似物(baseanalog)

碱基修饰剂(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation)

（二）突变的意义（三）诱变剂53

54

55

第七节DNA的生物合成（复制）

DNAReplicationP361

第七节DNA的生物合成（复制）

DNAReplica56

DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。DNARNA蛋白质复制复制转录反转录翻译遗传信息传递的中心法则病毒

DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1957DNA的生物合成：细胞内合成DNA的过程1、复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。

四种核苷酸（dATP\dTTP\dCTP\dGTP）

2、反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。3、修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。DNA的生物合成：细胞内合成DNA的过程581、DNA的半保留复制

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。一、DNA复制1、DNA的半保留复制

DNA在复制时，两条59DNA的半保留复制实验依据

1958年M.Meselson和F.W.Stahl用大肠杆菌为材料，在含15N和14N的NH4cl中培养证实，用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA在离心管中的沉降位置P361培养12代培养1代培养2代DNA的半保留复制实验依据1958年M.Mesels602、原核生物DNA聚合反应有关的酶类

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引发体primosome

：启动RNA引物链的合成。

(3）DNA连接酶（DNAligas（4）DNA解链酶：ATP供能解开DNA双链(5）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。

(6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。能改变DNA空间构型的酶，合成后再引向超螺旋。机制：切开环状一条链解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物2、原核生物DNA聚合反应有关的酶类

（1）DNA聚合酶(D61（1）DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链只能加到已有核苷酸的游离3’羟基上，不能自身聚合，需引物p363（1）DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´62大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的酶分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用聚合速率（nt/s）DNA聚合酶Ⅰ109000单链多肽400+++16-20120000单链多肽100++-40400，000（10种亚基）10-20++-250-1000比较项目DNA聚合酶III切除引物,校对，修复修复复制功能

1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）P364大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA分子量DNA109000单63DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点（I、II、III）3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点（I、II、III）64DNA聚合酶5´-3´外切酶活力（I）

5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´切除引物,修复DNA聚合酶5´-3´外切酶活力（I）

5´-3´核酸外65大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能（10个亚基）延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNA核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化组建核心酶P364大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能（10个亚基）66图11-8DNAPolIII的二聚体作用生物化学课件第六章核酸化学代谢DNA合成67（2）连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP（噬菌体和动物）或NADH（细菌）AMP+PPiATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链DNA复制、损伤修复、重组P367（2）连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP（噬菌体和动物）AM683、原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

semidiscontinuousreplication

P3683、原核细胞DNA的半不连续复制P36869（1）复制的起始点与方向

亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动。⊙复制起始点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点。原核：仅含一个，约245bp,特殊的重复序列。真核：多个起始点例：酵母17号染色体含400个。⊙复制方向：含三种机制一个起点2个叉，不同方向合成两条链，此为常见方式。2个起点，2个叉，各合一条链（腺病毒）。一个起点一个叉，同方向合成两条链（质粒ColEI）--单向复制（1）复制的起始点与方向70DNA的双向和单向复制----起始环状

DNA复制时所形成的O结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制DNA的双向和单向复制----起始环状DNA复制时所形成的71大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型DnaA识别起始点在复制起点特异部位解开双链DNAP368大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT72（2）原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向解旋酶解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´P369,393,274DNA聚合酶III切除引物、缺口填补、校对（2）原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向73聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）活化引物合成酶P370聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶II74复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物体引物体解旋酶解旋酶引物合成酶DnaG蛋白前导链和随后链被同一个DNA聚合酶III不对称二聚体合成复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物75（3）大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁体终止子位点连锁体在细胞分裂前必须解开，否则导致细胞分裂失败，细胞死亡。两个复制叉从起始反向移动至约180O的对面终止区相遇（3）大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止76（4）复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5X109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:

DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7

X10-6

）

DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’

外切酶切除）起始时以RNA作为引物P374（4）复制的忠实性DNA复制过程是一个高度精77DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´78

起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’-5’外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以5’-3’外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。（RNA聚合酶无校对功能，不需引物，可以从头合成）

起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为794、真核生物复制的特点（1）复制速度：是原核的1/10，但复制起始点多。（2）引物和冈琦片段小于原核，引物为10个，片段100~200；原核引物十几~几十，片段1000~2000。（3）复制需DNApol及多种因子参加，pol

pol在核内起主要作用。（4）pol为线粒体复制酶。（5）DNA复制位于细胞周期的S期。4、真核生物复制的特点80真核细胞DNA复制的特点多个起点复制起点起点起点起点起点起点真核生物DNA聚合酶端粒（telemere）的复制真核细胞DNA复制的特点多个起点复制起点起点起点起点起点81真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亚基数细胞内分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23，000多个细胞核～80%无120，000二个细胞核和线粒体2～15%3-5外切酶400，000二个细胞核+10～25%3-5外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45，000一个细胞核10～15%无核DNA合成线粒体DNA合成引物合成

修复功能真核生物的DNA聚合酶DNA分子量DNA110-23，00082

真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期。染色体DNA是线性结构。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA单链母链如果不填补成双链，就会被核内Dnase酶解。某些低等生物染色体经多次复制会越来越短。

真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后83端粒端粒：真核生物线性染色体的两个末端具有特殊结构称为端粒。端粒由许多成串的短的重复序列组成。一条链上富含G，如人的端粒TTAGGG，原生动物四膜虫为TTGGGG,植物

TTTAGGG。端粒的功能：稳定染色体末端结构，防止末端染色体降解；防止染色体间末端连接。（原核生物染色体是环状的，5´末端冈奇片段的RNA引物被除去后可借助另半圈DNA链向前延伸填补。）端粒84端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清。

端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它以自身携带的RNA为模板，催化互补链DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。

端粒酶含150个碱基RNA链。端粒酶结合到端粒的3´末端上，以RNA链5´末端识别DNA3´末端并合成互补链，端粒3´单链末端回折作为引物合成其互补链。端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物85

缺乏端粒酶活性时，细胞分裂将端粒不断缩短，引起细胞生长停止甚至死亡。肿瘤细胞端粒活性高，设想端粒酶作为抗癌治疗的靶位点。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。

缺乏端粒酶活性时，细胞分裂将端粒不断缩短，引起细胞生86

端粒和端粒酶的发现历程——记诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔奖主页上介绍她/他们获奖的原因是揭示了“howchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomerase”（染色体是如何被端粒和端粒酶保护的）

端粒和端粒酶的发现历程——记诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔奖主87

p373

p37388

89真核和原核DNA细胞复制比较

拓扑酶DNA复制后DNA超螺旋装配成染色体真核和原核DNA细胞复制比较90小结：一、半不连续合成在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链是不连续合成。体内仅含催化5’3’合成的DNA酶。60年代冈琦片段的发现解决了这个问题：合成5’3’前导链（leadingstrand）是连续的，方向与复制叉一致。合成3’

5’随从链时，方向与叉相反，合成不连续，各片段连成一条链。小结：在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另91二、复制过程和参与酶及因子（一）复制的起始（分两步）1、螺旋的松弛与解链（1）拓扑异构酶---能改变DNA空间构型的酶作用：DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化体外拓扑异构化反应，分两型。二、复制过程和参与酶及因子92拓扑异构酶I

（topoisomerase--I）作用：松弛超螺旋，不需ATP,

机制：切开环状一条链打结与解结环状双链DNA的合成环连与解环连原核：对负超螺旋正真核：对正、负均有作用。拓扑异构酶II----旋转酶（gyrase）作用：松弛超螺旋松+ATP

超（-）切开环状两条链打结与解结环连与解环连拓扑异构酶I（topoisomerase--I）作93（2）解链酶（helicase）------复制蛋白rep作用：ATP供能时，解开DNA双链。原核：编码解链酶的基因是dnaB,DnaB表示蛋白产物。前导链结合rep蛋白，随从链结合解链酶IIⅢ。（3）单链结合蛋白-singlestrandbindingprotein-SSB作用：SSB与解开DNA单链结合，保护稳定DNA。与新复制DNA单链结合，以防降解。超螺旋DNA拓扑酶松弛解链酶解开双链

SSB复制开始生物化学课件第六章核酸化学代谢DNA合成942、引发（需引发酶及引发前体参与）（1）引物酶（primase）作用：以DNA为模板，自5’3’合成RNA小片段,3’末端为-OH，长短：十几到几十个核苷酸。原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶。（2）引发前体（preprimosome）由多种蛋白因子组成复合物。作用：合成RNA引物，沿随从链复制叉的行进方向移动，在不同部位，合成RNA引物。总结：合成RNA引物，在引物3’-OH末段进行DNA片段合成。（二）DNA链的延长反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，

dNTP，引物，Mg2+离子

2、引发（需引发酶及引发前体参与）95过程：引物3’-OHdNTPppi引物-dNMP反应式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi反应机理：磷亲核攻击。真核与原核中DNA聚合酶有几种类型，作用方式相同，但各具特性及功能。1、大肠杆菌DNA聚合酶（3种）（1）pol：催化5’3’的聚合作用，合成20个核苷酸即离开模板，填充空隙。有3’5’外切酶活性，去除错误碱基的校对作用。有5’3’外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。（2）pol：5’3’DNA合成及3’5’外切酶活性，体内功能不清楚。（3）polⅢ:DNA链延长起主要作用，细菌中1000个dNTP/秒加入。3’5’外切酶活性，校对作用，与pol配合错误率降至10-6。（4）DNA复制的保真性：过程：引物3’-OHdNTPppi引物-96Pol:与引发酶配合，参与随从链的合成。RFA(replicationfactorA):DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用。（三）终止

连接酶：作用--使相邻的DNA片段,以3’5’磷酸二酯键相连，需ATP。

前导链是连续合成的，随从链在连接酶作用下连成一条链。

拓扑酶DNA复制后DNA超螺旋装配成染色体2、真核生物DNApol特性与大肠杆菌相似，共五种：pol：催化前导链及随从连的合成，需增殖细胞核抗原蛋白PCNA（proliferatatingcellnucleusantigen-PCNA）的参与。Pol:与引发酶配合，参与随从链的合成。97二、

逆转录作用1、概念2、逆转录酶3、逆转