原料药中杂质的控制与案例

原料药中杂质的控制与案例分析中国药品生物制品检定所胡昌勤杂质质控理念的变迁ImpurityProfile（杂质谱）:Adescriptionoftheidentifiedandunidentifiedimpuritiespresentinadrugsubstance.对存在于药品中所有已知杂质和未知杂质的总的描述。纯度控制杂质控制杂质谱控制第一次飞跃第二次飞跃头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A，4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+△3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B杂质谱控制与杂质控制的区别？杂质谱控制的整体解决方案原料药杂质控制的相关法规Q3A：新原料药中的杂质Q3B：新药制剂中的杂质Q3C：残留溶剂化学药品杂质研究的技术指导原则对新原料药中的杂质如何进行阐述？化学方面分类与鉴定报告杂质的控制（检查项目、限度）分析方法安全性方面对安全性研究及临床研究中存在的潜在杂质（在当时的实验样品中不存在或含量极低的杂质）的安全性评估杂质的分类有机杂质反应起始物、副产物、中间体、降解产物、试剂、配位体、催化剂等无机杂质试剂、配位体、催化剂、重金属、无机盐及过滤介质、活性炭等残留溶剂常用的有69种基本术语Qualification(界定)：是获得和评价与研发新药相关的杂质的数据的过程，这些数据用于建立新药的安全阈值（水平），单个的或一些已确定的杂质的含量在这个阈值下可以确保药品的生物安全性。Reportingthreshold或Reportinglevel(报告阈值或报告水平）：新药注册时杂质应被报告的限度。Identifiedthreshold(鉴别阈值）：新药注册时杂质应被鉴别的限度。Qualificatedthreshold(界定阈值）：新药注册时杂质应被界定的限度。新药原料药的杂质限度

最大日剂量报告阈值鉴定阈值界定阈值≤2g0.05%0.10%或1.0mg(取最小值)0.15%或1.0mg(取最小值)>2g0.03%0.05%0.05%（以原料药的响应因子计）如何合理的对原料药中的杂质进行报告和控制？研究报报告中中对有有机杂杂质的的基本本要求求对新原原料药药在合合成、、精制制和储储存过过程中中最可可能产产生的的那些些实际存存在的的杂质质和潜潜在的的杂质质进行综综述。。根据合合成工工艺中中化学学反应应的原原理，，结合合反应应条件件等，，阐述述合成成工艺艺中可可能产产生的的副产产物；；根据起起始原原料的的结构构及来来源，，阐述述可能能由起起始原原料引引入的的有关关物质质；根据起起始原原料、、中间间体、、产物物的结结构特特点，，产生生合成成中可可能产产生的的降解解产物物；根据产产物及及杂质质的结结构特特点，，结合合纯化化精制制工艺艺，阐阐述去去除杂杂质的的关键键工艺艺。头孢噻噻肟钠钠（CefotaximeSodium）杂杂质的的控制制以头孢孢菌素素C为为起始始物，，先经经化学学或酶酶催化化反应应生成成7-氨基基头孢孢烯酸酸（7-ACA），，然后后进行行酰化化反应应生成成头孢孢噻肟肟酸（（CTAX），，最后后生成成头孢孢噻肟肟钠（（CTAX-Na））。头孢菌菌素的的各种种可能能的降降解反反应类类型-内酰酰胺环环的降降解氢化噻噻嗪环环的双双键异异构（（Δ-异构构）3.6、、7位位氢的的反向向异构构4.7位碳碳相连连的侧侧链反反应分子结结构中中7位位碳侧侧链上上有αα-氨氨基的的头孢孢菌素素，如如头孢孢氨苄苄、头头孢羟羟氨苄苄、头头孢拉拉定、、头孢孢来星星、头头孢克克罗等等药物物，还还可发发生分分子内内亲核核反应应，生生成哌哌嗪二二酮衍衍生物物的降降解物物具有苯苯苷氨氨酸侧侧链的的-内酰酰胺抗抗生素素可以以降解解为2-羟羟基-3-苯基基吡嗪嗪衍生生物，，这种种化合合物具具有荧荧光特特性，，头孢孢克洛洛、氯碳碳头孢孢均会会产生生这种种降解解产物物。5.发发生生在R3取取代基基的反反应当3位位碳上上的取取代基基为乙乙酰氧氧甲基基时，，易脱脱去乙乙酰基基，形形成脱脱乙酰酰基降降解物物。在在加热热、酸酸性等等条件件下，，可进进一步步进行行分子子内部部环和和，此此时生生成的的主要要降解解产物物为内内酯。。6.双键顺顺反式式异构构（E-异异构））7.酯酯的的水解解8.聚聚合合反应应9.其其它它反应应头孢曲曲松、、头孢孢噻肟肟、头头孢它它啶、、头孢孢地尼尼等有有甲氧氧亚氨氨键的的头孢孢菌素素均会会产生生E-异构构体，，多数数在光光照的的情况况易发发生此此类反反应。。基于降降解反反应的的杂质质分析析发生在在头孢孢菌素素R3取代代基的的降解解反应应当3位位碳碳上上的的取取代代基基为为乙乙酰酰氧氧甲甲基基时时，，易易脱脱去去乙乙酰酰基基，，形形成成脱脱乙乙酰酰基基降降解解物物。。在在加加热热、、酸酸性性等等条条件件下下，，可可进进一一步步进进行行分分子子内内部部环环和和，，此此时时生生成成的的主主要要降降解解产产物物为为内内酯酯。。杂质质B、、杂杂质质E可可以以源源于于头头孢孢噻噻肟肟的的降降解解杂质质谱谱分分析析头孢孢噻噻肟肟有有关关物物质质分分子子结结构构头孢孢噻噻肟肟钠钠的的合合成成工工艺艺由于于起起始始物物头头孢孢菌菌素素C含含有有DAO-CC、、DA-CC和和CC-LT等等杂杂质质，，在在半半合合成成步步骤骤中中发发生生相相同同的的反反应应，，分分别别生生成成DAO-ACA、、DA-ACA和和ACA-LT，，进进而而生生成成DAO-CTAX、、DA-CTAX和和CTAX-LT等等杂杂质质。。杂质质E可可以以源源于于起起始始原原料料杂质质E可可以以源源于于合合成成中中的的任任一一中中间间过过程程杂质谱分析析头孢噻肟有有关物质典典型色谱图图（235nm）杂质谱分析析头孢噻肟有有关物质杂质B含量最大大，杂质C含量最低低合成副产物物：杂质A、杂质E和杂质G降解杂质：：杂质F生产工艺中中产生的杂杂质阐述清楚产品中可能能存在那些些杂质杂质的来源源生产工艺中中通过何种种手段去除除或控制这这些杂质的的产生实际产品中中这些的杂杂质水平及及变化加替沙星及及其十种杂杂质对照品品的色谱图图加替沙星注注射液杂质质谱分析色谱条件：：以三乙胺胺磷酸溶液液[三乙乙胺溶液（（1→100），用用磷酸调节节pH值至至4.3±±0.05]-乙腈腈（87：：13）为为流动相，，检测波长长为325nm，柱柱温为30℃，流速速为每分钟钟1ml。。色谱柱:SHISEIDOCAPCELLPAKC18加替沙星及及10个已已知杂质的的结构式主要杂质是是杂质3和和杂质8生产工艺杂杂质原料的杂质质谱分析光照稳定性性评价比较光照前前后各杂质质含量的变变化按随机取19批样品品UV灯下照照射10天天杂质2、杂质4是与光照稳稳定性密切切相关的杂杂质大多数喹喏喏酮类抗生生素对光不不稳定，什什么是光降降解杂质？？如何合理的的对原料药药中的杂质质进行报告告和控制？？依据合成/降解反应应机理，鉴鉴别可能杂杂质！全全过程跟踪踪杂质在合合成工艺中中的变化！！杂质控制方方法直接测定色谱法HPLCTLCHPCEGC间接测定溶液的颜色色检查杂质分析方方法的选择择方法互补原原则了解不同方方法间的相相关性所有的分析析方法必须须进行验证证（validation)药品质控RP-HPLC方法法上市后（仿仿制）药品品分析方法的的有效性分析析方方法法的的最最优优化化分析方方法的的耐用用性新药研研发如何确确定分分离对对象所有的的杂质质在所所选择择的RP-HPLC系统统中被被有效效的检检出了了吗？？是否有有杂质质吸附附到色色谱柱柱上未未被洗洗脱？？是否有有杂质质在色色谱柱柱上未未被保保留？？是否所所检测测到的的色谱谱峰存存在共共出峰峰？新方法法分析方方法的的有效效性（（氨苄苄西林林钠/舒巴巴坦钠钠）原方法法中国抗抗生素素杂志志，2009，，34：734在对各各国药药典方方法比比较的的基础础上确确定分分析方方法所有的的杂质质在所所选择择的RP-HPLC系统统中被被有效效的检检出了了吗？？是否有有杂质质吸附附到色色谱柱柱上未未被洗洗脱？？是否有有杂质质在色色谱柱柱上未未被保保留？？是否所检测测到的色谱谱峰存在共共出峰？如何验证？采用HPCE/HPTLC方方法验证RP-HPLC方法的有有效性HPCE分分析-内酰胺胺抗生素杂杂质谱最最佳分离模模式的选择择JCPS，2010，19（（4）：285–292头孢菌素有有关物质测测定中MEKC是HPLC分分析的最有有效验证方方法MEKC与与HPLC测定头孢孢菌素有关关物质的互互补性分析析MEKC具具有较强的的杂质分离离能力，但但其检测限限（LOD）较高。。借助于加速速实验，将将MEKC分离出的的杂质峰数数目与HPLC分离离出的含量量大于MEKCLOD的杂杂质峰数目目进行比较较，当两者者基本相对对时，可以以认为HPLC方法法具有较满满意的分离离能力。药物分析杂杂志，待发发表HPLC与与HPTLC分析庆庆大霉素的的比较HPTLC中的9号号和10号号斑点在HPLC中中被检出了了吗？庆大霉素供供试品HPTLC色色谱图及对应的UV扫描图图谱1.UK12.UK23.UK34.UK45.C1a6.UK57.C2a+C28.C1药品质控RP-HPLC方法法上市后（仿仿制）药品品分析方法的的有效性分析方法的的最优化分析方法的的耐用性新药研发如何确定分分离对象基于实验设计理理念的HPLC方法优化化理论JPBA，，2009,49(5):1192–1202洛伐他定和和辛伐他定定有关物质质HPLC分析方法法的优化新优化出的的方法比USP的分分离度更好好，比EP分离出的的杂质峰更更多，比ChP所用用的分离时时间更短，，并达到了了更好的分分离效果药品质控RP-HPLC方法法上市后（仿仿制）药品品分析方法的的有效性分析方法的的最优化分析方法的的耐用性新药研发如何确定分分离对象基于QbD理念的杂杂质控制策策略JPBA，，2008,46(3):431-441药物杂质质的可能能来源阿奇霉素素的合成成途经1.原料料：红霉素A、红红霉素B、红红霉素C、红红霉素D、红霉霉素E、红霉霉素F、阿奇霉素素B、阿阿奇霉素素C、阿阿奇霉素素E、阿阿奇霉素素F2.中间间体：红霉素A肟（Z）、6，9-亚胺醚醚、氮红红霉素A、红霉霉素A肟肟（E））、红霉霉素C肟（E）、9，11-亚胺胺醚、红红霉素C6，，9-亚亚胺醚、、红霉素素A内酰酰胺3.副产产物：红霉素-N-氧氧化物、、N-去去甲基红红霉素A、N-去甲基基阿奇霉霉素A、、氨基阿奇奇霉素A、N-甲酰基基-N去去甲基阿阿奇霉素素A、N-去甲甲基-N-苯磺磺酰基阿阿奇霉素、阿阿奇霉素素N-氧氧化物、、3’-去（二二甲氨基基）-3’,4’-去氢阿阿奇霉素素、O-甲苯苯磺酰基红红霉素肟肟、红霉霉素Z肟肟重排物物、氮红红霉素11，12-硼硼酸酯、、N，，N-去去二甲甲基基N-甲甲酰酰基基阿阿奇奇霉霉素素A、、丙丙基基阿阿奇奇霉霉素素、、3’’-N，，N-去去二二甲甲基基氨氨基基-酮酮基阿阿奇奇霉霉素素A、、阿阿奇奇霉霉素素11，，12-硼硼酸酸酯酯4.降降解产产物：：去克拉拉克定定糖阿阿奇霉霉素A、去去克拉拉克定定糖氮氮红霉霉素、、红霉霉素8，9-脱脱水-6，，9-半缩缩酮、、红霉霉素6，9：9，12-螺缩缩酮阿奇霉霉素中中可能能存在在的杂杂质：：37种模拟色谱图图实际色色谱图图杂质名称logP(8.3)logkkTR=T0（1+k）去克拉克定糖阿奇霉素A1.280.928.2613.89红霉素A内酰胺1.350.958.9414.90阿奇霉素C2.21.3723.2030.303’-N，N-去二甲基氨基-酮基阿奇霉素A2.241.3924.2737.90红霉素C肟（E）2.381.4528.4044.093’-去（二甲氨基）-3’,4’-去氢阿奇霉素2.791.6544.9968.98红霉素A肟（Z）2.81.6645.5069.75红霉素A肟（E）2.81.6645.5069.75丙基阿奇霉素3.161.8368.15103.73阿奇霉素E3.542.0270.40107.10N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇霉素4.982.7275.40114.60采用有有效的的方法法证明明杂质质不存存在，，而而不是是陈述述杂质质不存存在！！-内内酰胺胺抗生生素聚合物物的控控制SephadexG-10凝凝胶色色谱系系统典型分分离图图样品对照Kav=0高效凝凝胶色色谱系系统TSK高效效凝胶胶色谱谱系统统Superdexpipted高高效凝凝胶色色谱系系统高效疏疏水凝凝胶色色谱系系统高效疏疏水凝凝胶色色谱系系统TSKGelG2500HXL凝胶胶柱（（填充充剂为为苯乙乙烯－－二乙乙烯基基苯共共聚物物）300×7.8mmi.d;流动相相:含含0.26％溴溴化锂锂的N,N-二二甲基基甲酰酰胺溶溶液；；流速0.4ml/min;检测波波长为为280nm。。-内内酰胺胺抗生生素聚合物物杂质质分析析头孢地地嗪钠钠头孢呋呋辛酯酯TSKgelG2000HHR头孢丙丙烯TSKgelG2500PWXL法罗培培南TSKgelG2000HHRTSKgelG2000SWXLTSKgelG2000SWXLSephadexG10与与TSK柱比比较62G10柱结果果与TSK柱结果果的相相关性性SephadexG10TSK聚合物物其他聚聚合物物二聚物物头孢噻噻肟钠钠聚合合物分分析HPLC反反相色色谱系系统控控制高高分子子杂质质通过对对指针针性杂杂质的的测定定，表表征药药品中中高分分子杂杂质总总量。。头孢泊泊肟酯酯有关关物质质分析析的HPLC色色谱图图1=头头孢泊泊肟，，2=去甲甲氧基基头孢孢泊肟肟酯异异构体体A，，3=头孢孢泊肟肟酯异异构体体A，，4=去去甲氧氧基头头孢泊泊肟酯酯异构构体B+△△3异异构体体，5=头头孢泊泊肟酯酯异构构体B+反反式头头孢泊泊肟酯酯A，，6=反式式头孢孢泊肟肟酯B，7=N-甲甲酰基基头孢孢泊肟肟酯异异构体体A，，8=NAC-CPOD-PRX异构构体A，9=N-甲甲酰基基头孢孢泊肟肟酯异异构体体B，，10=N-乙乙酰基基头孢孢泊肟肟酯异异构体体B，，11=头头孢孢泊泊肟肟酯酯开开环环二二聚聚体体A，，12=头头孢孢泊泊肟肟酯酯开开环环二二聚聚体体B（A））阿阿莫莫西西林林钠钠在在SuperdexPeptide高高效效凝凝胶胶色色谱谱系系统统中中的的色色谱谱图图（B））各各色色谱谱峰峰切切换换到到BP有有关关物物质质HPLC分分析析系系统统后后的的色色谱谱图图中国国新新药药杂杂志志,2008,17(24):23在溶溶液液中中（（阿阿莫莫西西林林钠钠易易形形成成聚聚合合物物）），，阿阿莫莫西西林林闭闭环环二二聚聚体体和和二二酮酮哌哌嗪嗪阿阿莫莫西西林林（（2－－S））的的含含量量与与各各类类阿阿莫莫西西林林聚聚合合物物含含量量之之和和（（主主峰峰后后杂杂质质总总量量））呈呈一一定定的的相相关关性性中国国药药学学杂杂志志,2009，，44（（23））：：1821柱切切换换技技术术反冲冲模模式式(Backflushingmode)柱前前富富集集模模式式(on-columnfocusing)盐酸酸头头孢孢替替安安聚聚合合物物分分析析方方法法的的比比较较SephadexG-10系系统统TSK-GelG2000swxl系统统柱切换技技术0.8ml/minTSK系系统0.5ml/minC18系系统对-内内酰胺抗抗生素中中的聚合物重重点在于于研究，，证明所所采用的的工艺是是否可能能导致样样品聚合合物变化化！应采用适适宜的方方法对-内酰酰胺抗生生素中的的聚合物进进行控制制，而不不要仅局局限于SephadexG10系系统！样品中杂杂质含量量的报告告批次及批批量生产日期期生产地点点生产工艺艺产品中单单个杂质质含量及及杂质总总量批次用途途使用的分分析方法法报告研制制过程中中所有批批次样品品的检验验结果；；检验结果果应用详详细记录录，而不不是简单单描述为为“符合合规定””；分别记录录单个杂杂质（已已知杂质质、未知知杂质））、总杂杂质的含含量；所有的杂杂质应编编号，如如根据保保留时间间等小于1.0%的的杂质，，表示为为两位小小数，如如0.13%,0.06%大于1.0%的的杂质，，表示为为一位少少数，如如1.3％在新药研研发过程程中，采采用统一一的编号号系统，，表征杂杂质的变变化！如果新药研研发过程中中杂质分析析方法改变变，应分别别给出其验验证资料并并对不同方方法的相关关性进行评评价。色谱图的相相关性比较较是必须的的。利用色谱相相关光谱法法追踪色谱谱峰不同色色谱系统中中的位置杂质数据的的积累是制制定药品质质量标准的的重要依据据国内新药研研发中对有有关物质控控制的误区区重指标，轻轻方法方法的有效效性与样品品的现状对杂质结构构的鉴别重重视不够如何确定微微量杂质的的结构？根据杂质来来源，产生生条件，结结合母核的质谱谱裂解规律律推断杂质的的可能结构构头孢菌素类类抗生素质质谱裂解的的一般规律律青霉素类抗抗生素质谱谱裂解的一一般规律鉴定未知同同系物结构构的策略－－1对于具有相相同母核的的化合物：：紫外光谱图图可以得到到有关母核核结构的信信息；一级质谱得得到分子量量信息；二级质谱得得到碎片峰峰信息,可以推测出出有关各取取代基的情情况；利用色谱保保留行为来来验证推测测结果是否否正确。ACA，535：：89-99,2005分析化学，，34（1）：95-99，，2006药学学报，，41（5）：475-480，2006鉴定未知降降解杂质结结构的策略略－2对于反应机机理已知的的降解杂质质：根据反应原原理设计加加速实验；；一级质谱得得到分子量量信息；二级质谱得得到碎片峰峰信息,进一步推测测降解物的的结构；利用UV特特征和色谱谱保留行为为来验证推推测结果是是否正确。确定未知杂杂质的策略略－3推测杂质的的可能结构构反合成推测测的可能杂杂质LC/MS通过质谱谱裂解规律律和色谱保保留时间确确定所推测测杂质结构构的准确性性微量组分的的毒性评价价毒性快速评评价平台斑马鱼毒性快速评评价平台，，对杂质的的胚胎毒性性、神经毒毒性，心脏脏毒性等进进行评价。。优点：杂质用量少少无需知道杂杂质结构实验周期短短（3－4天天一个周期期）Figure4.EffectsofMMTDandTDAonthezebrafishembryonicdevelopment(3-dpf).A-D:TheembryostreatedwithMMTDat10g/ml(A),100g/ml(B),300g/ml(C)andat500g/ml(D).E-H:theembryostreatedwithTDAat100g/ml(E,F),300g/ml(G)andat500g/ml(H);I,J:normalembryosascontrolsatalateralview(I)andadorsalview(J).Hemorrhageofbrainareasisindicatedbywhitearrow,opaqueyolkandYEbyredarrow,deficienteyesarebyslight-bluearrows,colorlessandcord-likeheartsandenlargedpericardialsacsbyyellowarrows,ripple-likenotochordsbyorangearrows.雌二二醇醇对对斑斑马马鱼鱼胚胚胎胎的的心心脏脏毒毒性性斑马马鱼鱼作作为为药药物物耳耳毒毒性性检检测测模模型型斑马马鱼鱼侧侧线线神神经经丘丘毛毛细细胞胞:(A)5－－dpf幼幼体体头头部部侧侧面面，，示示眼眼窝窝上上(SO1andSO2),耳耳囊囊(O1)和和枕枕部部的的(OC1)的的神神经经丘丘；；(B)O1神神经经丘丘毛毛细细胞胞双双染染色色－－FM1-43(红红)和和Yo-Pro-1(绿绿).(C)FM1-43染染色色；；(D).Yo-Pro-1染染色色。。Scalebar=50um(A);10um(B––D).HearingResearch213(2006)25–33药物耳毒性性检测利用一种特特殊染料对对斑马鱼幼幼体头部耳耳蜗区神经经丘毛细胞胞的染色，，检测毛细细胞的存活活状态，来来判断检测测物的耳毒毒性。下图中红色色圈示耳蜗蜗区域；给给药组中红红色箭头示示给药后毛毛细胞减少少，黄色圈圈示给药后后1神经丘丘消失。给药后系统对照组组（正常幼幼体）杂质安全性性的界定（（评估）申报者应对对所制定的的质量标准准中的杂质质限度提供供安全性方方面的理由由。对于一个通通过充分的的安全性研研究和临床床研究的新新原料药，，其中任何何一个杂质质的水平被被认为是已已经经过评评价的；对于与动物物和/或人人体内的重重要代谢物物结构相同同的杂质，，被认为是是经过评价价的；杂质的实际际含量如果果低于杂质质的界定阈阈值，也被被认为是合合理的。对结构已知知但含量大大于界定限限的杂质；；结构未知且且含量大于于鉴别限的的杂质，如对杂质的的安全性不不确定，均均需要对杂杂质进行界界定。头孢西酮钠钠杂质限度度的评估头孢西酮钠钠杂质限度度定为“MMTD不不得过1.0%，其其它最大杂杂质不得过过2.0%，杂质总总量不得过过4.0％％”。如何对杂质质限度进行行评估？头孢西酮的的主要降解解杂