化学发光分析法现代表征方法与技术朱昌青课件

化学发光分析法现代表征方法与技术------Chemiluminescenceanalysis1化学发光分析法现代表征方法与技术------Chemilum一、基本原理principle

二、化学发光分析的特点characteristics三装置与技术instrumentandtechnology化学发光分析法2一、基本原理化学发光分析法2一、基本原理principle1.化学发光反应

在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。3一、基本原理principle1.化学发光反应32.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt分析物参加反应的速率；42.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(3.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：53.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，4.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；64.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应6

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与NO的发光反应：7O3→O2+O（100c.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；8c.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反（2）火焰中的化学发光反应

在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h发射光谱范围：660～770nm；

最大发射波长：690nm；

在富氢火焰中：

NO2+2H→NO+H2O该反应十分迅速；9（2）火焰中的化学发光反应在富氢火焰中，也存在着b.硫化物

挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：

SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h发射光谱范围：350～460nm；

最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；

发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。10b.硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、C（3）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。11（3）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中5.化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶125.化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些

草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。13草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠生物发光分析应用1在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：

AMP·LH2·E+O2[氧化荧光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化荧光素]*氧化荧光素+h最大发射波长562nm；14生物发光分析应用1在pH7～8；荧光素生物发光分析应用2烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：NADH+FMA+H+

NAD++FMNH2NADH脱氢酶FMNH2+RCHO+O2

FMN+RCOOH+H2O+h黄素酶最大发射波长495nm；15生物发光分析应用2烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(二、特点characteristics1.灵敏度极高

例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.仪器设备简单不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。16二、特点characteristics1.灵敏度极高1617171818三、装置与技术

instrumentandtechnology装置流程：发光反应室光检测器信号放大器显示与记录

发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：

静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；

流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；19三、装置与技术instrumentandtechnol化学发光分析法现代表征方法与技术------Chemiluminescenceanalysis20化学发光分析法现代表征方法与技术------Chemilum一、基本原理principle

二、化学发光分析的特点characteristics三装置与技术instrumentandtechnology化学发光分析法21一、基本原理化学发光分析法2一、基本原理principle1.化学发光反应

在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。22一、基本原理principle1.化学发光反应32.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt分析物参加反应的速率；232.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(3.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：243.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，4.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；254.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应6

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与NO的发光反应：26O3→O2+O（100c.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；27c.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反（2）火焰中的化学发光反应

在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h发射光谱范围：660～770nm；

最大发射波长：690nm；

在富氢火焰中：

NO2+2H→NO+H2O该反应十分迅速；28（2）火焰中的化学发光反应在富氢火焰中，也存在着b.硫化物

挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：

SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h发射光谱范围：350～460nm；

最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；

发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。29b.硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、C（3）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。30（3）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中5.化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶315.化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些

草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。32草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠生物发光分析应用1在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：

AMP·LH2·E+O2[氧化荧光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化荧光素]*