人教版高中生物选修3 专题1基因工程11 DNA重组技术的基本工具 教学课件

选修3现代生物技术专题专题1.基因工程1.1DNA重组技术的基本工具一、基因重组技术的概念二、DNA重组技术的基本工具选修3现代生物技术专题专题1.基因工程1.1DNA重组1一、基因工程的概念1．手段：通过体外____________和____________等技术，赋予生物以新的____________。2．目的：按照人们的愿望进行严格的设计，创造出更符合人们需要的新的_________和____________。3．设计和施工水平：____________水平，因此，基因工程又叫做DNA重组技术。DNA重组转基因遗传特性生物类型生物产品DNA分子一、基因工程的概念1．手段：通过体外____________2二、DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(又称限制酶)。(1)来源：主要是从____________中分离纯化出来的。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________断开，因此具有________性。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：__________和________。原核生物磷酸二酯键专一黏性末端平末端二、DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶——“分子手3前者是限制酶在它识别序列的______________将DNA的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识别序列的____________切开产生的。中心轴线两侧中心轴线处二、DNA重组技术的基本工具(3)种类EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别序列均为6个核苷酸，其中EcoRⅠ识别的序列为_________，从__和___直接切割，产生的末端为_________;SmaⅠ识别的序列为___________,从___和___直接切割，产生的末端为_________GAATTCGA黏性末端CCCGGGCG平末端前者是限制酶在它识别序列的______________将DN42．DNA连接酶——“分子缝合针”。(1)作用：将______________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______________，形成重组DNA分子。(2)种类。①E·coliDNA连接酶：只能缝合DNA片段的____________。双链DNA片段磷酸二酯键黏性末端二、DNA重组技术的基本工具2．DNA连接酶——“分子缝合针”。双链DNA片段磷酸二酯键5②T4DNA连接酶：既可缝合DNA片段的黏性末端，又可缝合DNA片段的________，但连接后者的效率________。3．运载体——“分子运输车”。(1)作用：携带__________进入受体细胞。(2)种类：质粒、__________的衍生物、动植物病毒等。平末端低外源基因λ噬菌体二、DNA重组技术的基本工具②T4DNA连接酶：既可缝合DNA片段的黏性末端，又可缝合D6①能够在受体细胞中进行__________，或整合到____________上，随染色体DNA进行同步复制。②有一个至多个__________切割位点，供外源基因插入。③具有特殊的________________，供重组DNA的鉴定和选择。自我复制染色体DNA限制酶遗传标记基因(3)特点:二、DNA重组技术的基本工具①能够在受体细胞中进行__________，或整合到____7一、目的基因的获取有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。1.2基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建三、目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种8一、目的基因的获取（一）目的基因主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子（调节基因）。对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因进行研究或应用称这种基因为目的基因。1.概念一、目的基因的获取（一）目的基因主要指的是编9凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都称为调节基因。把基因区分为结构基因和调节基因若着眼于这些基因所编码的蛋白质的作用：2.结构基因和调节基因凡是编码酶蛋白、血红蛋白、胶原蛋白或晶体蛋白等蛋白质的基因都称为结构基因。（一）目的基因一、目的基因的获取启动子终止子启动子终止子凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都10若转入目的基因都是为了合成所需的酶、抗体、蛋白质激素、结构蛋白质，则需转入结构基因。若转入目的基因是为了调控某个结构基因的活动，则可转入调节基因。2.结构基因和调节基因（一）目的基因从基因工程的目的看一、目的基因的获取若转入目的基因都是为了合成所需的酶、抗体、蛋白11（1）基因文库的概念（二）目的基因的获取途径1.从基因文库中获取一、目的基因的获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因组文库部分基因文库（cDNA文库）未知序列（2）基因文库的类型（1）基因文库的概念（二）目的基因的获取途径1.从基因文库中12（3）从基因组文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因组文库概念如果基因文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。（3）从基因组文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因组文13一、目的基因的获取基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存一、目的基因的获取基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA14cDNA文库的概念（4）从cDNA文库中获取目的基因（二）目的基因的获取途径如果基因文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。一、目的基因的获取cDNA文库的概念（4）从cDNA文库中获取目的基因（二）15cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA重组载体与载体连接双链cDNA片段DNA聚合酶cDNA文库导入受体菌中储存单链DNA反（逆）转录酶反（逆）转录法一、目的基因的获取cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mR16非编码区非编码区编码区上游编码区下游启动子终止子编码区RNA聚合酶转录mRNA前体剪接有关的酶剪接mRNA单链DNA逆转录酶逆转录DNA聚合酶复制cDNA不含非编码系列。即不含非编码区和内含子cDNA文库的构建反（逆）转录法一、目的基因的获取非编码区非编码区编码区上游编码区下游启动子终止子编码区R17基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较一、目的基因的获取基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库18基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以区别一、目的基因的获取基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文19联系基因组文库与cDNA文库的比较一、目的基因的获取联系基因组文库与cDNA文库的比较一、目的基因的获取20（二）目的基因的获取途径2.鸟枪法这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。（1）概念未知序列又叫“散弹射击法”。将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。(直接分离法)一、目的基因的获取（二）目的基因的获取途径2.鸟枪法这种方法有212.鸟枪法未知序列（2）过程供体细胞中的DNA许多DNA片段限制酶受体细胞导入产生特定性状目的基因分离一、目的基因的获取表达运载体与载体连接DNA连接酶2.鸟枪法未知序列（2）过程供体细胞中的DNA许多DNA片段222.鸟枪法未知序列（2）过程一、目的基因的获取2.鸟枪法未知序列（2）过程一、目的基因的获取233.化学合成法（二）目的基因的获取途径一、目的基因的获取已知序列（1）根据已知的核苷酸序列合成DNA法结构基因的核苷酸序列目的基因化学合成DNA合成仪3.化学合成法（二）目的基因的获取途径一、目的基因的获取已知24（2）据已知的氨基酸序列合成DNA法3.化学合成法已知序列根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推测目的基因化学合成结构基因的核苷酸序列推测一、目的基因的获取（2）据已知的氨基酸序列合成DNA法3.化学合成法已知序列25（二）目的基因的获取途径4.利用PCR技术扩增目的基因（1）概念多聚酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能短时间内将微量的DNA大幅增加。这项技术是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的，为此，穆里斯在1993年获得诺贝尔化学奖。一、目的基因的获取（二）目的基因的获取途径4.利用PCR技术扩增目的基因（1）264.利用PCR技术扩增目的基因（2）原理DNA双链半保留复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。（3）前提条件一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一、目的基因的获取4.利用PCR技术扩增目的基因（2）原理DN27（4）条件四种脱氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：热稳定DNA聚合酶（Taq酶）模板DNA：原料：4.利用PCR技术扩增目的基因一小段单链DNADNA聚合酶（耐高温）：目的基因一、目的基因的获取（4）条件四种脱氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：热稳定284.利用PCR技术扩增目的基因（5）扩增方式（6）结果以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。一、目的基因的获取4.利用PCR技术扩增目的基因（5）扩增方式（6）结果以指数294.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）一、目的基因的获取变性加热至90～95℃双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链的DNA；冷却至55～60℃引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合，形成局部双链；退火4.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）304.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）一、目的基因的获取加热至70～75℃在Taq酶的作用下，以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。延伸4.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）31一、目的基因的获取反应的条件热变性退火（复性）延伸（7）过程4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取反应的条件热变性退火（复性）延伸（7）过程32一、目的基因的获取（7）过程4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（7）过程4.利用PCR技术扩增目的基因331234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（7）过程1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸334理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（8）扩增结果的曲线图理想拷贝数=2n4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的35具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。4.利用PCR技术扩增目的基因（9）优点一、目的基因的获取具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出36（10）PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（10）PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术37二、基因表达载体的构建小结从基因文库中获取鸟枪法获取化学合成法获取PCR技术获取从基因组文库中获取从cDNA文库中获取二、基因表达载体的构建小结从基因文库中获取鸟枪法获取化学合成38二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施39二、基因表达载体的构建1.过程（1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。（2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。二、基因表达载体的构建1.过程（1）用一定的限制酶切割质粒，40二、基因表达载体的构建1.过程质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）限制酶处理同一种二、基因表达载体的构建1.过程质粒DNA分子一个切口两个切口41二、基因表达载体的构建2.连接结果（1）运载体与目的基因的连接（2）目的基因与目的基因的连接（3）运载体与运载体的连接二、基因表达载体的构建2.连接结果（1）运载体与目的基因的连42二、基因表达载体的构建3.目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。（2）使目的基因能够表达和发挥作用。为什么要构建表达载体？思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）二、基因表达载体的构建3.目的（1）使目的基因在受体细胞中43科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因尾端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料分析:科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和44二、基因表达载体的构建4.表达载体的结构（2）启动子（3）终止子（4）标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞（1）目的基因二、基因表达载体的构建4.表达载体的结构（2）启动子（3）终45不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）5.几个问题二、基因表达载体的构建不可以。（1）作为基因工程表达载体，只需含46a.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；b.通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；c.目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；d.为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；e.有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。二、基因表达载体的构建必须构建上述元件的主要理由是：a.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子475.几个问题（2）表达载体为什么一定要有启动子？a.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；b.通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。二、基因表达载体的构建5.几个问题（2）表达载体为什么一定要有启动子？a.生物之间48是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。（4）标记基因有什么作用？5.几个问题终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。（3）终止子的作用是什么？二、基因表达载体的构建是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将49①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。二、基因表达载体的构建①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN50常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：（一）转化三、将目的基因导入受体细胞借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵51（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞（二）方法将目的基因导入将目的基因导入将目的基因导入农杆菌转521.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法三53（1）农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物、中性糖，从而使农杆菌移向这些细胞），并诱导产生冠瘿瘤或发状根。三、将目的基因导入受体细胞（1）农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中54根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。发根农杆菌发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。其Ri质粒上有一段T-DNA。（1）农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多55根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。原理

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、将目的基因导入受体细胞根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质56科研人员将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。原理三、将目的基因导入受体细胞科研人员将目的基因插入到经过改造的T-DN57Ti质粒表达新性状目的基因表达载体构建转入含有Vir致病基因农杆菌导入植物外植体细胞插入植物细胞染色DNA新的植物个体植物组培技术③转化过程:为什么？为什么？Ti质粒表达新性状目的基因表达载体构建转入含有Vir致病基因58③转化过程:DNA③转化过程:DNA59三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞60利用农杆菌对植物进行转化，首先将目的基因插入到Ti质粒衍生的转化载体上，形成重组DNA，然后将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌，再通过上述农杆菌侵染植物外植体。三、将目的基因导入受体细胞③转化过程:利用农杆菌对植物进行转化，首先将目的基因插入到Ti61植物伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物、中性糖，酚类化合物如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物质既是根瘤农杆菌的趋化物，又是农杆菌中毒性基因Vir表达的诱导物，在它们的作用下，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。研究表明，作为主要诱导物的乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮等酚类物质，主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，因此根瘤农杆菌不易直接侵染单子叶植物。三、将目的基因导入受体细胞为什么农杆菌只侵染双子叶植物和裸子植物而不能侵染单子叶植物呢？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你认为应该怎样做？植物伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物、中性糖62要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物。要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导性）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你认为应该怎样做？三、将目的基因导入受体细胞要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌63④优点农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点：A.该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好；B.农杆菌Ti质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；三、将目的基因导入受体细胞④优点农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体64C.农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料；D.农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。④优点农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点：三、将目的基因导入受体细胞C.农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单65（2）基因枪法适用于单子叶植物该法又称粒子轰击，高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术，是由美康奈尔大学生物化学系John.C.Sanford等于1983年研究成功。是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。三、将目的基因导入受体细胞定义（2）基因枪法适用于单子叶植物该法又称粒子66将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低。另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。基因枪法过程三、将目的基因导入受体细胞将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡67（3）花粉管通道法适用于被子植物三、将目的基因导入受体细胞（3）花粉管通道法适用于被子植物三、将目的基因导入受体细胞68

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞(被整合到受体细胞的基因组中)，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。过程（3）花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞实例：抗虫棉的培育植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通692.将目的基因导入动物细胞（1）方法三、将目的基因导入受体细胞思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？显微注射法将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中2.将目的基因导入动物细胞（1）方法三、将目的基因导入受体细70显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。三、将目的基因导入受体细胞显微注射法（microinjection）71（2）操作程序三、将目的基因导入受体细胞基因表达载体受精卵移植到子宫受精卵发育新性状动物含目的基因的受精卵显微注射导入培养后（2）操作程序三、将目的基因导入受体细胞基因表达载体受精卵移72这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器，注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。（3）技术要求三、将目的基因导入受体细胞这种显微注射术的程序，需有相当精密的显微操733.将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理法常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理法常用菌74受态细胞（competentcell）：主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。三、将目的基因导入受体细胞受态细胞（competentcell）：主要75④过程Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性。三、将目的基因导入受体细胞④过程Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合76④CaCl2法的过程A.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞。膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。三、将目的基因导入受体细胞④CaCl2法的过程A.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（077B.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。C.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。三、将目的基因导入受体细胞④CaCl2法的过程B.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细78受体生物

植物

动物

微生物受体细胞导入方法受精卵、体细胞受精卵细胞、个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞4.导入三种不同生物受体细胞的方法的比较受体生物植物动物微生物受体细胞受精卵、体细胞79小结导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞三、将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法CaCl2法不能百分之百成功的导入受体细胞中小结导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞三、将目的基因导入80（一）分子水平上检测四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达。2.检测转基因生物染色体的DNA上是否出入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。3.检测目的基因是否转录出来mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，采用DNA和RNA分子杂交技术。4.检测目的基因是否翻译成蛋白质（一）分子水平上检测四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞81导入受体细胞导入重组质粒导入普通质粒未导入质粒如何确定细胞中含有重组质粒？质粒上的标记基因人工在质粒上插入标记基因导入受体细胞导入重组质粒导入普通质粒未导入质粒如质粒上的人82四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达。（1）常见的标记基因四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因抗生素抗性基因使细菌对氨苄青霉素、氯霉素等抗生素产生抗性的基因。使细菌对四环素产生抗性的基因。产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色。四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达83是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素:四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达。（2）几种抗菌物质的作用是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等84从放线菌金色链丛菌的培养液等分离出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，对结核菌、变形菌等则无效。四环素：四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达。（2）几种抗菌物质的作用从放线菌金色链丛菌的培养液等分离出来的抗菌物85四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达。（2）几种抗菌物质的作用杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。环丝氨酸：主要用于对青霉素敏感的革兰氏阳性菌、阴性菌的感染，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等。氨苄青霉素：四、目的基因的检测与鉴定1.检测受体细胞中的标记基因是否表达86四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（3）质粒上的标记基因四、目的基因的检测与鉴定四环素氨苄青霉（3）质粒上的标记基因四、目的基因的检测与鉴定87（4）利用四环素抗性基因插入失活进行检测四、目的基因的检测与鉴定如果在四环素抗性基因上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。四环素抗性基因失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；四环素抗性基因不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（4）利用四环素抗性基因插入失活进行检测四、目的基因的检测与88导入重组质粒导入普通质粒未导入质粒含四环素+环丝氨酸培养基不抗四环素，生长被抑制并保留抗四环素，细菌生长，被环丝氨酸杀死含氨苄青霉素培养基无环丝氨酸使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色不抗四环素，生长被抑制不能使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色四、目的基因的检测与鉴定导入重导入普未导入含四环素+环丝氨酸培养基不抗四环素，生长被89（5）利用氨苄青霉素抗性基因插入失活进行检测如果氨苄青霉素抗性基因上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。四、目的基因的检测与鉴定外源DNA插入氨苄青霉素抗性基因（5）利用氨苄青霉素抗性基因插入失活进行检测如果氨苄青霉素抗90（1）方法DNA分子杂交技术（DNA与DNA分子杂交）2.检测转基因生物染色体的DNA上是否出入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。四、目的基因的检测与鉴定（1）方法DNA分子杂交技术（DNA与DNA分子杂交）2.检91（2）基因探针又称“寡核苷酸探针”，简称“探针”，就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是目的基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。DNA探针将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。四、目的基因的检测与鉴定（2）基因探针又称“寡核苷酸探针”，简称“探92①首先取出转基因生物的基因组DNA；②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（3）过程转基因生物的DNADNA探针14N14N变性变性15N15N稳定性同位素四、目的基因的检测与鉴定①首先取出转基因生物的基因组DNA；②将含目的基因的DN93四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定943.检测目的基因是否转录出来mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，采用DNA和RNA分子杂交技术。（1）方法分子杂交技术（DNA与mRNA分子杂交）变性DNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N（2）过程四、目的基因的检测与鉴定3.检测目的基因是否转录出来mRNA，这是检测目的基因是否发95苏云金杆菌将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体

出现杂交带组织培养Bt毒素蛋白蛋白质提取4.检测目的基因是否翻译成蛋白质（1）方法抗原-抗体杂交（2）过程四、目的基因的检测与鉴定苏云金杆菌将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗96四、目的基因的检测与鉴定（二）个体水平上检测抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。四、目的基因的检测与鉴定（二）个体水平上检测抗虫、抗病接种实97思考与探究3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。思考与探究3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关98提示：基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死亡；如果培养基上长出大肠杆菌的群落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成部分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？思考与探究提示：基本操作如下：4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成部99寻根问底提示：结构基因文科是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获取，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行么？寻根问底提示：结构基因文科是获取目的基因的方法之一，并不是唯100提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总的DNA提取出来，用过注射或花粉管通道法导入手提植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定是什么基因导入了手提植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎么样？寻根问底提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总101结构基因：是决定合成某一种蛋白质或RNA分子结构相应的一段DNA。结构基因的功能是把携带的遗传信息转录给mRNA（信使核糖核酸）,再以mRNA为模板合成具有特定氨基酸序列的蛋白质或RNA。调节基因：是调节蛋白质合成的基因。它能使结构基因在需要某种酶时就合成某种酶,不需要时,则停止合成，它对不同染色体上的结构基因有调节作用。操纵基因:位于结构基因的一端，是操纵结构基因的基因。当操纵基因“开动”时,处于同一染色体上的，由它所控制的结构基因就开始转录、翻译和合成蛋白质。当“关闭”时，结构基因就停止转录与、翻译。操纵基因与一系列受它操纵的结构基因合起来就形成一个操纵子。结构基因：是决定合成某一种蛋白质或RNA分子结构相应的一段D102镰刀型红细胞贫血症红细胞圆饼状血红蛋白正常氨基酸谷氨酸

GAA

┷┷┷mRNADNA┯┯┯

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┷┷┷突变缬氨酸镰刀状异常5.实例基因探针β—珠蛋白四、基因治疗曙光初照抗原——抗体杂交DNA分子杂交镰刀型红细胞贫血症红细胞圆饼状血红蛋白正常氨基酸103（二）基因治疗把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。四、基因治疗曙光初照1.概念2.类型（1）体外基因治疗（2）体内基因治疗（二）基因治疗把正常基因导入病人体内，使该基因的104（二）基因治疗四、基因治疗曙光初照（1）体外基因治疗概念病例是指在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。复合型免疫缺陷症（二）基因治疗四、基因治疗曙光初照（1）体外基因治疗概念病例105病例复合型免疫缺陷症①病因：腺苷酸脱氨酶基因缺失缺乏腺苷酸脱氨酶免疫功能下降（二）基因治疗四、基因治疗曙光初照（1）体外基因治疗病例复合型免疫缺陷症①病因：腺苷酸脱氨酶基因缺失缺乏腺苷酸脱106②治疗方法：提取患者的淋巴细胞筛选出能够产生腺苷酸脱氨酶的淋巴细胞患者体内含有转基因淋巴细胞导入正常的腺苷酸脱氨酶基因将该淋巴细胞扩增后转入患者体内半年后，血液检测被改造的淋巴细胞、腺苷酸脱氨酶患者产生抗体的功能显著改善四、基因治疗曙光初照1990年9月②治疗方法：提取患者的淋巴细胞筛选出能够产生腺苷酸脱氨酶的淋107四、基因治疗曙光初照（2）体内基因治疗概念直接向人体组织中转移基因的治病方法。病例囊性纤维化病是一种遗传性外分泌腺疾病，主要影响胃肠道和呼吸系统，通常具有慢性梗阻性肺部病变、胰腺外分泌功能不良和汗液电解质异常升高的特征。四、基因治疗曙光初照（2）体内基因治疗概念直接向人体组织中转108（2）体内基因治疗病例囊性纤维化病由位于第7对染色体CF基因突变引起的常染色体隐性遗传病。北美白种人种常见的一种遗传病，患者汗液中氯离子的浓度升高，支气管被异常的黏液堵塞，常于幼年时死于肺部感染。病因四、基因治疗曙光初照（2）体内基因治疗病例囊性纤维化病由位于第7对染色体CF基因109四、基因治疗曙光初照无论哪一种基因治疗，目前都是出于初期的临床试验阶段。可以说，在没有完全解释人类基因组的运转机制，充分了解基因调控机制和疾病的分子机理之前，进行基因治疗是十分困难的。另外，还存在着技术方面、伦理道德方面，以及安全性方面的诸多困难。四、基因治疗曙光初照无论哪一种基因治疗，目前都110（三）用于基因治疗的基因种类1.从健康人体上分离得到的功能正常的基因。2.反义基因3.自杀基因用以取代病变基因，或依靠其表达产物，来弥补病变基因带来的生理缺陷，如对血友病和地中海贫血病的治疗。即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，来阻断非正常蛋白质合成。是编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因。四、基因治疗曙光初照（三）用于基因治疗的基因种类1.从健康人体上分离得到的功能正111选修3现代生物技术专题专题1.基因工程1.1DNA重组技术的基本工具一、基因重组技术的概念二、DNA重组技术的基本工具选修3现代生物技术专题专题1.基因工程1.1DNA重组112一、基因工程的概念1．手段：通过体外____________和____________等技术，赋予生物以新的____________。2．目的：按照人们的愿望进行严格的设计，创造出更符合人们需要的新的_________和____________。3．设计和施工水平：____________水平，因此，基因工程又叫做DNA重组技术。DNA重组转基因遗传特性生物类型生物产品DNA分子一、基因工程的概念1．手段：通过体外____________113二、DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(又称限制酶)。(1)来源：主要是从____________中分离纯化出来的。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________断开，因此具有________性。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：__________和________。原核生物磷酸二酯键专一黏性末端平末端二、DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶——“分子手114前者是限制酶在它识别序列的______________将DNA的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识别序列的____________切开产生的。中心轴线两侧中心轴线处二、DNA重组技术的基本工具(3)种类EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶识别序列均为6个核苷酸，其中EcoRⅠ识别的序列为_________，从__和___直接切割，产生的末端为_________;SmaⅠ识别的序列为___________,从___和___直接切割，产生的末端为_________GAATTCGA黏性末端CCCGGGCG平末端前者是限制酶在它识别序列的______________将DN1152．DNA连接酶——“分子缝合针”。(1)作用：将______________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______________，形成重组DNA分子。(2)种类。①E·coliDNA连接酶：只能缝合DNA片段的____________。双链DNA片段磷酸二酯键黏性末端二、DNA重组技术的基本工具2．DNA连接酶——“分子缝合针”。双链DNA片段磷酸二酯键116②T4DNA连接酶：既可缝合DNA片段的黏性末端，又可缝合DNA片段的________，但连接后者的效率________。3．运载体——“分子运输车”。(1)作用：携带__________进入受体细胞。(2)种类：质粒、__________的衍生物、动植物病毒等。平末端低外源基因λ噬菌体二、DNA重组技术的基本工具②T4DNA连接酶：既可缝合DNA片段的黏性末端，又可缝合D117①能够在受体细胞中进行__________，或整合到____________上，随染色体DNA进行同步复制。②有一个至多个__________切割位点，供外源基因插入。③具有特殊的________________，供重组DNA的鉴定和选择。自我复制染色体DNA限制酶遗传标记基因(3)特点:二、DNA重组技术的基本工具①能够在受体细胞中进行__________，或整合到____118一、目的基因的获取有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。1.2基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建三、目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种119一、目的基因的获取（一）目的基因主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子（调节基因）。对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因进行研究或应用称这种基因为目的基因。1.概念一、目的基因的获取（一）目的基因主要指的是编120凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都称为调节基因。把基因区分为结构基因和调节基因若着眼于这些基因所编码的蛋白质的作用：2.结构基因和调节基因凡是编码酶蛋白、血红蛋白、胶原蛋白或晶体蛋白等蛋白质的基因都称为结构基因。（一）目的基因一、目的基因的获取启动子终止子启动子终止子凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都121若转入目的基因都是为了合成所需的酶、抗体、蛋白质激素、结构蛋白质，则需转入结构基因。若转入目的基因是为了调控某个结构基因的活动，则可转入调节基因。2.结构基因和调节基因（一）目的基因从基因工程的目的看一、目的基因的获取若转入目的基因都是为了合成所需的酶、抗体、蛋白122（1）基因文库的概念（二）目的基因的获取途径1.从基因文库中获取一、目的基因的获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因组文库部分基因文库（cDNA文库）未知序列（2）基因文库的类型（1）基因文库的概念（二）目的基因的获取途径1.从基因文库中123（3）从基因组文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因组文库概念如果基因文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。（3）从基因组文库中获取目的基因一、目的基因的获取基因组文124一、目的基因的获取基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存一、目的基因的获取基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA125cDNA文库的概念（4）从cDNA文库中获取目的基因（二）目的基因的获取途径如果基因文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。一、目的基因的获取cDNA文库的概念（4）从cDNA文库中获取目的基因（二）126cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA重组载体与载体连接双链cDNA片段DNA聚合酶cDNA文库导入受体菌中储存单链DNA反（逆）转录酶反（逆）转录法一、目的基因的获取cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mR127非编码区非编码区编码区上游编码区下游启动子终止子编码区RNA聚合酶转录mRNA前体剪接有关的酶剪接mRNA单链DNA逆转录酶逆转录DNA聚合酶复制cDNA不含非编码系列。即不含非编码区和内含子cDNA文库的构建反（逆）转录法一、目的基因的获取非编码区非编码区编码区上游编码区下游启动子终止子编码区R128基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较一、目的基因的获取基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库129基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以区别一、目的基因的获取基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文130联系基因组文库与cDNA文库的比较一、目的基因的获取联系基因组文库与cDNA文库的比较一、目的基因的获取131（二）目的基因的获取途径2.鸟枪法这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。（1）概念未知序列又叫“散弹射击法”。将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。(直接分离法)一、目的基因的获取（二）目的基因的获取途径2.鸟枪法这种方法有1322.鸟枪法未知序列（2）过程供体细胞中的DNA许多DNA片段限制酶受体细胞导入产生特定性状目的基因分离一、目的基因的获取表达运载体与载体连接DNA连接酶2.鸟枪法未知序列（2）过程供体细胞中的DNA许多DNA片段1332.鸟枪法未知序列（2）过程一、目的基因的获取2.鸟枪法未知序列（2）过程一、目的基因的获取1343.化学合成法（二）目的基因的获取途径一、目的基因的获取已知序列（1）根据已知的核苷酸序列合成DNA法结构基因的核苷酸序列目的基因化学合成DNA合成仪3.化学合成法（二）目的基因的获取途径一、目的基因的获取已知135（2）据已知的氨基酸序列合成DNA法3.化学合成法已知序列根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列推测目的基因化学合成结构基因的核苷酸序列推测一、目的基因的获取（2）据已知的氨基酸序列合成DNA法3.化学合成法已知序列136（二）目的基因的获取途径4.利用PCR技术扩增目的基因（1）概念多聚酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能短时间内将微量的DNA大幅增加。这项技术是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的，为此，穆里斯在1993年获得诺贝尔化学奖。一、目的基因的获取（二）目的基因的获取途径4.利用PCR技术扩增目的基因（1）1374.利用PCR技术扩增目的基因（2）原理DNA双链半保留复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。（3）前提条件一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一、目的基因的获取4.利用PCR技术扩增目的基因（2）原理DN138（4）条件四种脱氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：热稳定DNA聚合酶（Taq酶）模板DNA：原料：4.利用PCR技术扩增目的基因一小段单链DNADNA聚合酶（耐高温）：目的基因一、目的基因的获取（4）条件四种脱氧核苷酸DNA引物（左引物和右引物）：热稳定1394.利用PCR技术扩增目的基因（5）扩增方式（6）结果以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。一、目的基因的获取4.利用PCR技术扩增目的基因（5）扩增方式（6）结果以指数1404.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）一、目的基因的获取变性加热至90～95℃双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链的DNA；冷却至55～60℃引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合，形成局部双链；退火4.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）1414.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）一、目的基因的获取加热至70～75℃在Taq酶的作用下，以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。延伸4.利用PCR技术扩增目的基因（7）过程（变性、退火、延伸）142一、目的基因的获取反应的条件热变性退火（复性）延伸（7）过程4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取反应的条件热变性退火（复性）延伸（7）过程143一、目的基因的获取（7）过程4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（7）过程4.利用PCR技术扩增目的基因1441234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（7）过程1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3145理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（8）扩增结果的曲线图理想拷贝数=2n4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的146具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。4.利用PCR技术扩增目的基因（9）优点一、目的基因的获取具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出147（10）PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等4.利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（10）PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术148二、基因表达载体的构建小结从基因文库中获取鸟枪法获取化学合成法获取PCR技术获取从基因组文库中获取从cDNA文库中获取二、基因表达载体的构建小结从基因文库中获取鸟枪法获取化学合成149二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施150二、基因表达载体的构建1.过程（1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。（2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。二、基因表达载体的构建1.过程（1）用一定的限制酶切割质粒，151二、基因表达载体的构建1.过程质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）限制酶处理同一种二、基因表达载体的构建1.过程质粒DNA分子一个切口两个切口152二、基因表达载体的构建2.连接结果（1）运载体与目的基因的连接（2）目的基因与目的基因的连接（3）运载体与运载体的连接二、基因表达载体的构建2.连接结果（1）运载体与目的基因的连153二、基因表达载体的构建3.目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。（2）使目的基因能够表达和发挥作用。为什么要构建表达载体？思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）二、基因表达载体的构建3.目的（1）使目的基因在受体细胞中154科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因尾端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料分析:科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和155二、基因表达载体的构建4.表达载体的结构（2）启动子（3）终止子（4）标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞（1）目的基因二、基因表达载体的构建4.表达载体的结构（2）启动子（3）终156不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）5.几个问题二、基因表达载体的构建不可以。（1）作为基因工程表达载体，只需含157a.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身