发酵工程原生质体育种

第第四交育狮狮虎狮狮虎面包面包酵母酵（能进杂发酵，利用麦芽糖能力强杂交育种是杂交育种是指将两型不经吻合(或接合)使遗传物质重新组合离和筛选出具有新性状菌株的举通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换、重组，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体，获得新品种； 缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传理论的发展。选择原始亲选择原始亲诱变筛选直接亲杂筛选重组重组体分析鉴亲本标记亲本选 亲和力测

原始亲 直接亲 原始亲本：具有不同遗传背景的优质，主要根据杂交的目的来选择直接亲本：在杂交育种中具有遗传标记和亲和能力而直接用于杂交配对的菌株。培养基有限培养基（LM）：供异核体生长的培养基。补充培养基（M）：鉴别重组体的培养基（鉴别培养基、选择性培养基）营养缺陷型颜常规杂交常规杂交育原育转染原原再种原育种的优原 无细胞壁，诱变剂能更迅速的内渗与DNA作用原生 是单个分散的细胞，与诱变剂接触面大，易受诱变作用；原生 再生本质上是细胞壁重建和 能力恢复的过程，再生的细胞壁可能在组成与结构上都发生变化，甚至于产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异；原生 的出发材料一般为对数生长期细胞，对环境和诱变剂较为敏感；1、原 原生再种是微生物原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变株。例 福提霉素产生菌小单孢菌（micromonosporasp.SIPI4812）原 泰乐菌素产生菌经二轮原生再生诱诱变作种内原自然融影响孢子形筛选作菌种活化和预培遗菌种活化和预培遗传稳定性鉴原再种的 原复原原复原再高产菌株分离（初筛2、原 诱变育原生诱变育种是以微生物原为育种材料，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株的过程。 诱变剂原生诱孢子正变负变正变负变-60Co---He-Ne激2-5-0原原项原孢细胞结无细胞致密细胞细胞状对诱变剂敏强弱诱变剂作用快慢诱变效原原菌种特性及发酵特性研菌种特性及发酵特性研遗传稳定性遗传稳定性鉴原 复 原 再 高产菌株分离（初筛PEGPEG原的菌龄，菌丝的生长条件和质粒的浓原 再生条件，再生培养基组成等3通过转化，通过转化，将质粒DNA片段DNA转入原的技术影响转化的原原菌种特性及发酵特性研菌种特性及发酵特性研遗传稳定性遗传稳定性鉴原

复以一定例混合，在PEG介导下成转化过原 再 高产菌株分离（初筛第五第五育融原原原原融合育种是型不的菌株融合使遗传物质重新组合从中分离和筛选出具有新性状菌株的过程 原原选定纯化亲本原融原生原融

选定纯化亲本原生B检出融合融合子的分离和融合重组体的1、灭活标灭活原

是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化而失去再生的能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。 原生A（野生型55℃钝化原生

原生再生（营养缺陷型、再生（-

筛原养型重组2、荧光标是一种工遗传标记。在双亲原除去多余后，将带有不同荧光色素的亲本原生融合，然后挑选同时具有双的的（（一）原的过接离收集菌酶斜面孢接离收集菌酶斜面孢液体培养高渗溶原1、培养甘氨酸：替代D-壁肽聚糖的交联，使细胞壁结构疏松，利于原 形成EDTA：能与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对青霉素：松动细胞壁中的蛋白质结构，增加细胞壁对脱壁酶的敏感性，更有利于原生 的形成。2、菌

3、酶的种4、酶浓

酵母牛真选择利于原 形成和再生的酶浓度55、酶解温度和控制适合的酶解温度和pH6、酶解时控制适合6、酶解时控制适合的酶解时间

8、渗透压稳定 霉菌：KCl和NaCl等稳定剂的使用浓度一般为0.3～0.8mol／L在渗透压稳定剂中，Ca2+、Mg2+是必不可PEG介PEG介导融电融激光诱导融脂（Liposome）融合等融原原的融合的11、PEG（聚乙二醇）原A原 B（10原A（A∶B=1∶130%~40%PEG，CaCl 适温处理1~10min以再生培养基稀释4~5低速离心除去重悬，涂布选择性PEG：脱水②能降PEG：脱水②能降低原 的膜电能促进磷脂分子紊乱和重新组织原生（A∶B=1∶1 原生粘合、收缩、高度变形、小区域融细小原生逐渐增原 完全融PEG介导融合关键因PEGPEG分子量4000～6000PEG作用终浓度30%～40%Ca2+作用浓度为0.052、电 F的作用，根据双向电泳现象，原生向电极的方向泳动。与此同时，细胞内产生偶极化，促使原生相互粘连，并使细胞沿电力线方向排列成串，融合细胞之间形成紧密接触。原生在电场作用下沿电力线方向排电场作用下原生质膜被击穿的过然后在外加瞬间高频直流强电压作用，以50µs时程脉冲冲击原生粘连点，扰乱原生膜的分子排列，使之穿孔，然后发生原电场作用下原生质膜被击穿的过原生膜相互粘质膜分子排列扰分子排列严重受质膜穿孔形成通 在再生培养基上实是含高渗稳定剂的完是含高渗稳定剂的完全培养基Ca2+、Mg2+必不可少R2YE培养基（用于链霉菌原生再生 10.3，K2SO4 MgCl2·6H2O1.012，Glucose 0.2，Casaminoacid0.1， 0.4，Yeastextract0.4，Traceelement KH2PO4 CaCl2·2H2O Tris-HCl(0.25mol/L,pH7.2)NaOH 原原大分子合成与原 生 合成细胞壁物质，组装、恢复成完整细胞；能力恢复开 繁殖成为正常的细胞形态和菌落 原生再生过程中细胞壁合成和重建阶菌体的生理状年青菌 的原 再生能力 稳定

酶的作用浓度及作用时选择利于原生形成和再生的酶浓降低原生的再生率。再再生培养基的组Ca2+、Mg2+浓磷酸盐再生培养基的水再生培养基表面的水分要挥原生再生率的计算能再生细胞壁的原生再生率 ————————————— x原生总原生再生菌落数-非原生再生菌落=—————————————————— x原生总数（血球计数结果高渗溶液涂皿再生菌数-水涂皿再生菌=—————————————————— x原生总数（血球计数结果融合子融合子的检出主要依靠两个亲本的选择性标亲本A（a+b-