检验核医学(放射免疫分析和免疫放射分析)课件

检验核医学第五章体外放射分析概述

体外放射分析体外放射分析是在体外条件下，以放射性标记物为示踪剂，以结合反应为基础，以放射性测量为定量手段，在试管中进行的对体内微量活性物质进行定量分析的核技术的总称。放射性标记物：*Ag、*Ab、*L、*S

特异性结合剂：Ab、R、E

分析对象：血液(血清、血浆)、尿液、唾液、组织匀浆液、分离的组分特点

1.灵敏度高最小可测量为10-9-10-15g2.特异性强利用专一性强的结合反应

3.精确度好有效的质量控制方法

4.放射性不引入体内

5.所需待测样品少50-200l6.试剂药盒化，操作简便、快速

7.测量微机化，方便、快捷，客观、准确放射免疫分析(RIA)基本原理1RIA反应式分离剂*Ag+Ab*Ag-Ab*Ag-Ab+分离剂

AgAg-AbAg-Ab1)一定量*Ag、不定量Ag与限量Ab进行竞争抑制结合反应2)*Ag-Ab与Ag成负相关关系(反比)3)在实际工作中，用一系列已知浓度的Ag(标准品)进行实验制备剂量反应曲线(标准曲线，[*Ag-Ab]－[Ag]曲线)，未知样品在相同条件下实验，其浓度通过标准曲线查出2RIA数学函数式

k1Ag+AbAg-Abk2P+QPQP=[Ag]+[*Ag]P0=[Ag0]+[*Ag0]Q=[Ab]Q0=[Ab0]PQ=[Ag-Ab]+[*Ag-Ab]k1[PQ][PQ]K=——=————=———————(1)k2[P][Q][P]([Q0]-[PQ])[PQ]=———————(2)([P0]-[PQ])[Q]

将B=

[PQ]/[P0]、B/F=B/(1-B)=[PQ]/[P]代入(1)B1K=———×———————(3)展开重排

1–B[Q0]-B[P0]

[Q0]1[Q0]

B2–B(1+———+———)+———=0(4)[P0]K[P0][P0]

将B=1-F代入(3)

[Q0]11

F2–F(1-———-———)+———=0(5)[P0]K[P0]K[P0]

定义R=B/F，由B+F=1得B=R/(1+R)代入(3)

R2+R(1+K[P0]–K[Q0])–K[Q0]=0(6)基本试剂

1标准抗原(Ag)2标记抗原(*Ag)3抗血清(抗体，Ab)2抗血清(抗体，Ab)

含有抗体的血清质量指标(1)亲和力

(2)交叉反应率

(3)滴度(1)亲和力

Ab与Ag的结合能力，用亲和常数K表示

Scatchard作图法得：

B/F=K[Q0]–K[PQ]

为一直线

K=直线斜率

K>109L/mol(2)交叉反应率

Ab与Ag类似物的结合程度，表示Ab的特异性。分别用Ag和Ag类似物（Ag#）作剂量反应曲线

Ab与*Ag结合被抑制50%时[Ag]量交叉反应率=Ab与*Ag结合

被抑制50%时[Ag#]量(3)滴度又称效价，反映与一定量

Ag特异结合的Ab的浓度,用稀释度表示用一定量标记Ag与不同稀释度的Ab反应，作B%-Ab稀释度曲线，B%=50%时对应的Ab稀释度即为Ab滴度,

合适的滴度为1:104-1063标记Ag

常用125I和3H标记化合物要求：

(1)适当高的放射性比活度影响方法的灵敏度和精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量

(2)放射化学纯度>95%影响方法的灵敏度

(3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致

(4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月分离技术1非特异性

(1)吸附法分离剂：葡聚糖凝胶包被活性炭(DCC)F被吸附沉淀，重复性差

(2)沉淀法分离剂：聚乙二醇(PEG)B被沉淀，分离迅速，非特异结合率高

(3)抽滤法常用滤膜：玻璃纤维滤膜、微孔滤膜

B与F的分子量差别明显时分离效果好2特异性分离方法

(1)双抗体法分离剂：第二抗体(抗抗体，Ab2)

分离时间长，非特异结合率低

(2)双抗体+PEG法分离迅速，非特异结合率低

(3)固相分离法固相材料包被Ab1、Ab2

固相材料：纤维素(包被珠)

试管(包被管)

磁化颗粒2反应介质

Tris-HCl或PB缓冲液，pH7.4-7.8

离子强度0.05-0.1M3反应温度和时间

K大，37ْC，1-3h；K小，4ْC，过夜4血样的采集与保存

(1)大都采用原样品(血清、血浆)，少数需经提取

(2)不及时分析的样品需分离出血清或血浆，-20ْC存放

(3)采样或反应时常用抗凝剂：EDTA-Na2，防腐剂：

NaN3，稳定剂：0.5%BSA、0.1%明胶、抑肽酶等RIA反应管类型

组类型基本反应试剂分离别名称常用符号AgAb*Ag试剂

总放射性管T--√-

标准非特异结合管N--√√

曲线组最大结合管B0(S0)-√√√

标准管Si√√√√

样品组样品管U√√√√

质控组质控管QC√√√√

RIA的质量控制质量控制的目的对分析工作中产生的误差进行检查和质量判断，对出现的质量异常现象寻找原因并采取纠正措施，以保证分析误差被控制在允许的范围内。杜绝过失误差，校正系统误差，控制随机误差。质量控制的内容(任务)1实验室内部质量控制(1)批内质控精密度评价偏差分析

(2)批间质控精密度评价偏差分析2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂或试剂盒进行综合评价

(2)对不同实验室的分析工作质量进行比较质量控制指标1灵敏度能检测出与B0管具统计差别的最小可测量

(1)B0%-2SD的相应剂量(2)B0%-10%的相应剂量

(3)由精密度图得出2特异性抗体识别其抗原的能力，用交叉反应率表示3精密度在相同条件下，对某一样品多次检测所得结果的符合程度，评价随机误差∑(Xi–X)2

|X1–X2|SD=———————n=2时，SD=—————n–1√24偏差测定值偏离真值的程度，评价系统误差准确度测定值与真值的符合程度，评价系统误差和随机误差测定值-真值偏差b=———————X100%

真值准确度=√偏差2+精密度2=√b2+SD25稳定性批间的重复性

B0%、NSB%、ED25、ED50、ED75、QC样品测定值6临床有效性一项分析方法完成临床目的的程度正常值及其范围、正常值与异常值交叉范围、诊断符合率(阳性率、阴性率、假阳性率、假阴性率)实验室内部质量控制方法1对实验数据进行审核剔除“坏点”2剂量反应曲线拟合及质量审核3精密度评价(1)反应误差关系RER

从多批实验资料求出直线方程式

SDR=a+bRa反映分离误差b反映加样误差(2)精密度图(P-P图)

(用剂量反应曲线)

通过RER将SDR转换SDD(CVD%)

作SDD(CVD%)-lgD曲线CVD%≤10%4偏差与准确度评价

(1)回收实验反映偏差测定值-空白值回收率%=—————X100%

已知值回收率%=100%±10%(2)健全性试验用标准品和样品分别作剂量反应曲线和样品稀释曲线，两条曲线应平行

(3)二样本-Youden图反映准确度，用QC样品

QC首-QC尾曲线，误差≤±2SD5稳定性评价批间质控，用QC样品

(1)Cusum图每批QC测定值与靶值的差累计后按批次连续作图，折线两端落差≤±5SD(2)质控图

QC测定值-批次曲线，误差≤±3SD评价

1三种浓度<2SD，双向（±

）或两种浓度<2SD，一种<3SD，双向正常

2三种浓度>2SD，但<3SD，双向或一种>3SD，双向随机误差大

3三种浓度中一种>3SD，两种>2SD，三种>1SD，单向（＋或－）系统误差大免疫放射分析(IRMA)基本原理1IRMA反应式

(1)单位点Ag+*Ab↔Ag-*Ab+*Ab

SP-AgAg-*Ab+SP-Ag-*Ab

(2)双位点SP-Ab1+Ag↔SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2SP：表示固相2IRMA数学函数式

k1Ag+*AbAg-*Abk2P+QPQP=[Ag]P0=[Ag0]Q=[*Ab]Q0=[*Ab0]PQ=[Ag-*Ab]=Bk1[PQ][PQ]K=—=———=——————————k2[P][Q]([P0]-[PQ])([Q0]-[PQ])B=————————展开重排

([P0]-B)([Q0]-B)

B2–B([P0]+[Q0]+1/K)+[P0][Q0]=03剂量反应曲线方法分类1双抗体夹心法（1）SP-Ab1+Ag↔SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（2）Ag+*Ab2

↔Ag-*Ab2+*Ab2

SP-Ab1SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（3）SP-Ab1+Ag+*Ab2

↔SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab22标记第三抗体

SP-Ab1+Ag+Ab2

SP-Ab1-Ag-Ab2

*Ab3

SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3*Ab3：第三抗体（抗抗体），为兔（豚鼠）抗小鼠IgG抗血清优点：通用性标记抗体3双标记抗体法*Ab2*Ab2SP-Ab1+AgSP-Ab1-AgSP-Ab1-Ag*Ab3*Ab3

优点：放射性比活度提高，就提高了方法的灵敏度和精密度影响免疫放射分析的主要因素1被测抗原的性质双位点IRMA要求被测抗原有两个以上的结合位点，方法局限于多肽和蛋白质抗原的分析2结合在固相抗体上的抗原稳定性被结合的抗原数量较多时，抗原从固相抗体上分离的倾向更明显高浓度的准确度较低浓度差3反应时间和温度室温或4˚C，24h；37˚C，1.5-3h4标记抗体的浓度标记抗体↑，测定范围↑，NSB↑5固相物的洗涤洗涤↓，CPM↑，洗涤↑，CPM↓6血清等的非特异性效应温度↑，血清效应↑IRMA反应管类型组类型基本反应试剂分离别名称常用符号Ag*Ab试剂

总放射性管T-√-

标准非特异结合管N(S0)-√√

曲线组最大结合管Bmax(Smax)√√√

标准管Si√√√

样品组样品管U√√√

质控组质控管QC√√