X线诱导肺腺癌SPC-A-1细胞发生Parthanatos

X线诱导肺腺癌SPC-A-1细胞发生Parthanatos孙恒文1，曾子君1，方良毅1，谭佩欣1，谢松喜1，张红丹1，潘燚1，高东升21广东省人民医院（广东省医学科学院）肿瘤中心放疗科，广东广州，5100802广东医学院附属彭湃纪念医院肿瘤科，广东海丰，516400[摘要]：目的Parthanatos（thanatos希腊神话中的死神）是一种新的细胞死亡形式。初步探讨X线诱导肺癌SPC-A-1细胞是否发生Parthanatos。方法以肺腺癌SPC-A-1细胞为研究对象，以1、2、4、6、8、10Gy梯度剂量辐射细胞，平板克隆法测定X线辐射对人肺癌细胞SPC-A-1的半数致死剂量（LD50），WST-1法进行验证，以此剂量辐射细胞进行后续实验。RT-PCR法检测细胞LD50辐射后4、8、12和24hAIF转录水平变化。Westernblot（WB）检测细胞辐射后相同时间点AIF蛋白水平表达变化。激光共聚焦观察细胞辐射后相同时间点AIF向细胞核内转移情况。亚细胞组分WB法检测细胞辐射后相同时间点AIF在线粒体蛋白组分和核蛋白组分中的分布变化。TUNEL法检测辐射后12h细胞核DNA的断裂。结果正常状态下，AIF分布于SPC-A-1胞质中。X线对SPC-A-1细胞的LD50大致为3Gy。以此剂量3Gy辐射细胞后不同时间AIF在转录、蛋白水平均无显著变化（P>0.05）。辐射后12hAIF由线粒体向细胞核转位，伴随细胞核的溶解、碎裂。亚细胞组分WB检测到12h后AIF在线粒体蛋白组分中显著下降，由对照组（Con）1.12±0.15下降至12h组0.21±0.07（P<0.05），而在核蛋白组分中显著上升，由Con组0.05±0.02上升至12h组0.45±0.07（P<0.05），辐射细胞后12h，同时在固缩的细胞核中检测到DNA的断裂。结论AIF核转位参与了X线诱导的细胞凋亡过程。辐射后12hAIF由线粒体向细胞核转位显著增多，导致细胞核固缩、碎裂、溶解，细胞发生了Parthanatos。[关键词]：AIF；X线辐射；核转位；肺癌细胞SPC-A-1；Parthanatos[中图法分类号]：R734.2[文献标志码]AParthanatosoccurinSPC-A-1celllineinducedbyX-rayirradiationSunHengwen1,ZengZijun1,FangLiangyi1,TanPeixin1,XieSongxi1,ZhangHongdan1,PanYi1,GaoDongsheng21Departmentofradiationoncology,CancercenterofGuangdonggeneralHospital(GuangdongAcademyofMedicalScience),Guangzhou510080,Guangdong，China2Departmentofoncology,GuangdongmedicalcollegeaffiliatedPengpaimemorialhospital,Haifeng516400,Guangdong,China[Abstract]:ObjectiveParthanatos(thanatosisgodofdeathinGreekmythology)isanewformofcelldeath,whichoftenoccursunderthemanykindsofstimulus.Here,wediscusswhetheritoccurinSPC-A-1celllineinducedbyX-rayirradiationpreliminarily.MethodFirstly,confirmedtheAIFlocatedinnormalcultureSPC-A-1cellsbyIHCandIF.ThenmeasuredLD50ofSPC-A-1IRtreatmentbyX-raysusingcolony-formingassayandWST-1assay.ThecellswereIRtreatedbyX-raysas1,2,4,6,8,10Gy.Secondly,detectedAIFmRNAexpressionlevelsbyRT-PCRassayafterthecellswereIRtreated4,8,12,24h.Then,detectedAIFproteinexpressionlevelsaftertheIRtreatmentatthesametimebyWBassay.Thirdly,observedAIFtranslocationfrommitochondrialtonuclearafterIRtreatmentbyconfocal.MeasuredAIFredistributioninmitochondrialandnuclearafterIRtreatmentbysubcellularproteincomponentsWB.Finally,detectedthenuclearDNAstrandbreaksafterIRtreatment3hbyTUNELassay.ResultsAIFlocatedatcytoplasm,whenSPC-A-1cellswereculturednormally.TheLD50ofX-rayIRSPC-A-1was3Gy.WhethermRNAorproteinexpressionlevelsofAIFwereunchangedatthedifferenttimegroupsafterIRtreatment(P>0.05).AIFtranslocatedfrommitochondrialtonuclearaccompaniedbynuclearDNAdissolutionandfragmentationafterIRtreatment12h.ThesameresultswereconfirmedbysubcellularWB(P<0.05).TheDNAstrandbreadsweredetectedinthenuclearafterIRtreatment12h.ConclusionAIFnucleartranslocationoccursinSPC-A-1afterX-rayirradiation.AIFtranslocationfrommitochondrialtonuclearweresignificantlyenhancedafter3GyIRtreatment12h,resultinnuclearchromatincondensation,

fragmentationanddissolution.ParthanatosoccursinSPC-A-1inducedbyX-rayIRtreatment.[Keywords]：Parthanatos;AIF;X-rayirradiation;Nucleartranslocation;LungcancercellSPC-A-1[基金项目]：国家自然科学基金（81302033）[通信作者]：孙恒文，男，河南南阳人，博士，主治医师，主要从事肿瘤放疗方面研究，E-mail：sunrise761114@。电话arthanatos被Harrza[1]定义为多聚ADP糖聚合酶-1（PARP-1）/AIF/核酸内切酶G（EndoG）线粒体凋亡途径，一种新的细胞死亡形式。其机制为凋亡因素刺激下PARP-1由细胞核转位至线粒体，继而线粒体膜孔开放，导致AIF和EndoG由线粒体转位至细胞核，引起细胞核DNA大片段断裂（50kb）[2]。而且，这种凋亡途径是Caspase非依赖性的，更加直接、迅速[3]。Wang在综述中认为AIF是Parthanatos中的关键分子，AIF的核转位是这种死亡途径的重要特征[4]。AIF定位于线粒体内膜，参与氧化呼吸链的构成，在刺激因素作用下，转位至细胞核，结合与DNA螺旋深沟处，募集EndoG等，使DNA断裂，导致细胞死亡[5]。目前，研究发现，多种刺激因素可导致AIF核转位，导致细胞凋亡，详见讨论部分。医用X线是否也能诱导肺癌细胞AIF核转位，引起核DNA断裂，从而导致细胞凋亡，尚未见报道。本研究首先用IHC法和免疫荧光IF法证实AIF在SPC-A-1细胞中的定位。然后用平板克隆形成法和WST-1法测定X线对细胞的半数致死剂量（LD50）。LD50辐射SPC-A-1细胞，激光共聚焦技术观察两种细胞AIF由胞浆向胞核转移的形态学变化及核凋亡形态变化。RT-PCR、WB技术分析辐射后不同时间AIF基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。最后运用亚细胞组分WB技术定量分析AIF由线粒体向细胞核的转位。TUNEL证实辐射后细胞DNA断裂的早期凋亡现象。研究目的是证实Parthanatos是否在X线辐射后的肺腺癌SPC-A-1中发生，为肺癌辐射敏感性调研究控奠定基础。1.材料与方法1.1材料人肺腺癌细胞系SPC-A-1购自中国医学科学院上海生物细胞研究所。超净工作台（苏州净化设备厂），倒置荧光显微镜及照相系统（Leica公司），Mill-QBiocel超纯水器（Millipore公司），POWER/PAC200电泳仪（美国Bio-Rad公司），MP-3型小型垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司），激光共聚焦显微镜（美国THORLABS公司），CO2细胞培养箱（HARRIS公司），ReverTraAce逆转录试剂盒、KODPlusPCR试剂盒（日本TOYOBO公司），WST-1细胞毒性及细胞增殖检测试剂盒（杭州Beyotime公司），DU800紫外/可见光分光光度计（美国BECKMAN公司），MP-3型小型转膜仪（美国Bio-Rad公司），多孔培养板（Omega），PCR仪（Techgene公司），标准PH计（Sartorius公司）。Hoechst33342（美国Sigma公司），标准胎牛血清（天津TBD公司），RPMI1640培养基，胰蛋白酶（美国Hyclone公司），溴化乙锭（美国Sigma公司），PageRulerprestainedProteinLadder（Fermentas公司），辣根酶标记兔抗山羊IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记兔抗山羊IgG（北京中杉金桥公司），RIPA裂解液、PMSF（Beyotime公司），山羊抗人AIF抗体、小鼠抗人Actinβ抗体（SantaCruz公司），DNAmaker（200-2000bp）（杭州博日），ECL化学发光试剂盒（Pierce公司），Trizol（上海生工），浓缩DAB试剂盒（中杉金桥），Mitotrackerred线粒体荧光染色剂（美国Invitrogen公司），结晶紫、NC膜（美国Sigma公司），水溶性封片剂（武汉博士得公司），亚细胞蛋白组分提取试剂盒、TUNEL法凋亡检测试剂盒（杭州碧云天公司）。1.2细胞培养常规培养SPC-A-1细胞用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清），置入37℃、5%CO2孵箱，2-3天换液1次，细胞长满80%后用0.25%胰酶消化、传代。取1.3免疫组化及免疫荧光对数生长期的SPC-A-1细胞接种于6孔板内20mm×20mm盖玻片上，每孔约1×105个细胞，继续培养12-18h使细胞贴壁。免疫组化利用SantaCruz公司山羊抗人AIF多克隆抗体，和北京中杉金桥辣根酶标记兔抗山羊IgG标记二抗和DAB显色试剂盒说明进行。PBS冲洗后用4℃4％多聚甲醛固定20min，3%H2O2封闭10min，37℃5%BSA封闭30min，在载玻片上滴加20μl山羊抗人AIF抗体（1：200），将盖玻片爬有细胞面与抗体接触，4℃孵育过夜，大于18h，辣根酶标记兔抗山羊IgG稀释度（1：200）37℃孵育30min，DAB显色液显微镜下显色8分钟，苏木素复染10s，用70%、80%、95%和无水乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡玻片IF使用FITC标记兔抗山羊IgG作为二抗，4℃4%多聚甲醛固定20min，1%Triton-100渗透25min，AIF一抗孵育同免疫组化，FITC标记兔抗山羊IgG稀释度（1：150），37℃孵育30min，双蒸水冲洗玻片，Hochest33342对核复染，水溶性封片剂封片，Leica显微镜下观察和扫描。FITC为吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。Hochest33342最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm，1.4细胞辐射本实验使用数字化直线加速器23EX（美国VARIAN公司），射线能量6MV，剂量率400cGy/min。细胞放疗时表面以2cm厚补偿膜辅助剂量建成。1.5平板克隆实验对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化；用含10%FBS的RPMI1640配成单细胞悬液，稀释并接种于六孔板中，不同剂量组对应接种细胞的数目如下，Con（200）、1（200）、2（200）、4（200）、6（400）、8（600）、10Gy（600），各组细胞的每个剂量点每组设3个重复孔。接种后将细胞放入孵箱，培养24小时使细胞贴壁，辐射细胞后放入孵箱继续培养10-14天，每3天换液1次，直至出现可见克隆时，终止培养，甲醇固定15min，适量1％结晶紫染色30min。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，按公式计算接种效率（PE）。PE=（con组克隆数/con组接种细胞数）×100%。统计存活分数（SF）：SF=（实验组克隆数/细胞接种数×PE）×100%；以照射剂量为横坐标，细胞存活百分数为纵坐标，绘制细胞存活曲线，大致推算半数致死剂量LD50。1.6WST-1法测定辐射杀伤作用WST-1是MTT的一种升级替代产品，被线粒体脱氢酶还原生成的formazan是水溶性的，省去了后面的溶解步骤，较MTT更简便且更加稳定，灵敏性更高，目前已经被广泛采用。对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，以每孔2000个细胞接种于96孔培养板，各组细胞的每个剂量点设3个重复孔，每孔体积200μl。继续培养24h，以1、2、4、6、8、10Gy辐射细胞，未经辐射细胞作为con组。放入孵箱继续培养72h，每孔加入WST-120μl，37℃继续培养4h，置于摇床上晃动1min；放入酶标仪，以450nm测定吸光度，以620nm波长作为参考波长进行双波长测定，按公式计算细胞存活率：细胞存活分数（SF）=各剂量组OD值/对照组OD值。绘制存活曲线，推算LD50。1.7RT-PCR法检测AIF转录对数生长期细胞以LD50辐射，辐射后4、8、12和24h提取总RNA。收集辐射后细胞，离心后加入1mlTrizol充分裂解，1ml针筒抽吸匀浆两次以剪切基因组DNA，样品转移至无菌1.5ml离心管中，200μl氯仿/异戊醇（24：1），剧烈振荡30s，台式离心机上12000rpm，室温离心5min；上清液小心转移到Rnase-free1.5ml离心管里，取上清加入等体积的异丙醇，室温下放置5min；离心后弃上清液，即为总RNA，70%乙醇洗涤后自然干燥，50μlDEPC-H2O溶解，分光光度器测量，1OD＝40μgRNA计算产率，并测定纯度。OD260/280在1.8-2.0认为抽提的RNA纯度很高。RNA逆转录。RNA变性：总RNA4μl，RandomPrimer(25pmol)1μl，RNAFreeH2O7μl，总体积12μl，离心后金属浴中65℃5min后置于冰上。逆转录体系：变性的RNA12μl，5×RTBuffer4μl，dNTPMixture2μl，RNAaseInhibitor1μl，ReverTraAce1μl，总体积20μl。逆转录：30℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃5min，-20℃保存备用，用于下一步PCR反应的模板。PCR反应：按试剂盒说明书进行RNA变性及逆转录。AIF引物采用文献已报道序列[6]，上游引物5’-ATGTTAGGGCTGACACCAGAACAG-3’，下游引物5’-GTGGGGCCTCAGTCTTCATG-3，目的基因长度1536bp；GAPDH上游引物5’-GGCTCTCCAGAACATCAT-3’，下游引物5’-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3’，目的基因长度400bp。PCR反应体系：灭菌蒸馏水33μl，10×PCRBuffer5μl，10mMdNTPMixture5μl，25mMMgSO43μl，上游引物1μl，下游引物1μl，KOD-plus1μl，样品CDNA1μl，总体系50μl。PCR反应条件：AIF94℃2min，98℃10s，62℃30s，68℃90s，30个循环，68℃2min，4℃保存；GAPDH94℃2min，98℃10s，62℃30s，68℃30s，30个循环，1.8WB法检测蛋白表达对数生长期SPC-A-1细胞，LD50辐射后4、8、12、24h抽提蛋白。收集细胞加入500μlRIPA，及3-5μlPMSF，冰上裂解30min，离心取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，加入1/4体积5×SDS还原型蛋白上样缓冲液，沸水煮5min后冻存。30%丙烯酰胺溶液，10%过硫酸胺，用丙烯酰胺和过硫酸胺按不同比例配置分离胶和积层胶。Con、4、8、12、24h组每组上样20μg，预染Marker上样2.5μl。积层胶电压60V，分离胶电压改为120V，垂直电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部。将滤纸、NC膜切成凝胶尺寸大小，电转移缓冲液浸泡NC膜、滤纸6张及凝胶15min。将滤纸、NC膜、凝胶在电转液中浸泡。Bio-Rad公司POWER/PAC200电转仪恒流电转1h。室温下用5％脱脂奶粉常温封闭2h，4℃一抗孵育大于18h，AIF及β-actin一抗稀度为1：1000；用TBST漂洗3次×10min；辣根酶标记兔抗山羊二抗、辣根酶标记山羊抗小鼠二抗工作液浸泡滤膜（二抗稀释度为1：10000），37℃摇床孵育1h；TBST漂洗3次×10min；ECLAdvance化学发光试剂A液与B液等体积混合后，将膜完全浸透于混合液中10s-1min；用Bio-Rad公司Quantityone凝胶成像仪中成像并拍照保存结果。同样方法测定IOD并计算AIF蛋白相对含量。1.9激光共聚焦AIF荧光标记部分同免疫荧光，观察辐射后AIF在细胞中的位置变化。细胞核标记使用Hochest33342蓝色荧光，观察辐射后细胞核形态变化。线粒体标记用Mtotrackerred为红色荧光。激光共聚焦显微镜下分别获取单色荧光照片，并进行融合。1.10亚细胞组分WB按照杭州碧云天公司亚细胞组分提取试剂盒步骤进行。对数生长期细胞以LD50辐射细胞，辐射后4、8、12、24h提取线粒体蛋白和核蛋白。以未辐射细胞作为Con组。每20μl细胞压积中加入200μl预冷BufferA，使用前每mlBuffer中加入1μlDTT，5μlPMSF，5μl蛋白酶抑制剂，最大转速剧烈振荡细胞15s，冰上放置15min，尽量溶解细胞；加入11μl冷BufferB，充分剧烈振荡5s，4℃离心，16000g×5min；尽快将上清转入预冷清洁EP管中，置于冰上，此上清即为线粒体蛋白；在离心沉淀物中（细胞核）加入100μl预冷的BufferC，使用前每1mlBufferC中加入1μlDTT，5μlPMSF，5μl蛋白酶抑制剂，最大速度振荡15s，冰上40min，每隔10min漩涡振荡15s，4℃离心，16000g×10min，上清即为核蛋白。蛋白电泳、转膜、杂交、发光部分同1.6部分。核蛋白组分用Histone做内参照，线粒体蛋白组分用COX4做内参照，计算AIF在不同蛋白组分1.11TUNEL法检测细胞凋亡对数生长期细胞接种于铺有盖玻片的6孔板中，待细胞贴壁后铺片，以LD50辐射细胞，继续培养12h，取出细胞爬片进行清洗、固定。按照一步法TUNEL凋亡检测试剂盒步骤，用0.1%TritonX-100冰浴孵育，取试剂盒中TdT酶2μl，荧光标记液48μl，配置成50μlTUNEL检测液。37℃孵育60min，荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。激发波长450-500nm，发射波长范围为515-565nm，DNA断端呈现1.12统计分析本研究使用SPSS13.0统计软件。本实验测定数据均为三次重复实验结果，以形式在表中显示，采用One-WayANOVA方法统计分析。2.结果2.1AIF在常规培养细胞中定位SPC-A-1细胞在RPMI1640培养基中生长状态稳定，增殖能力旺盛。IHC结果显示细胞浆中呈棕色染色，胞核为苏木素复染呈淡蓝色，提示AIF定位于胞浆中（图1A）。IF结果显示AIF为FITC二抗标记，呈绿色荧光分布于胞浆中，细胞核以Hochest33342标记，呈蓝色荧光（图1B）。图1A：AIF免疫组化染色（200×）；B：AIF免疫荧光染色（100×Fig.1A:IHCstainingofAIF;B:2.2平板克隆法及WST-1法测定LD50未辐射细胞作为对照组，将各剂量组细胞接种于6孔板中，培养14天后肉眼可见克隆形成，随辐射剂量增高，克隆数逐渐减少（图2C）。有些克隆的细胞数不足50（图2C<50cells），计数大于50个细胞的克隆（图2C>50cells），并计算细胞存活分数。以辐射剂量为横坐标，细胞存活分数为纵坐标绘制细胞存活曲线（图2A）。WST-1法测定各剂量组细胞存活分数，以辐射剂量为横坐标，细胞存活分数为纵坐标绘制细胞存活曲线（图2B）。经两种方法测定推算，X线对SPC-A-1的LD50大致为3Gy。图2A：平板克隆法绘制细胞生存曲线；B：WST-1法绘制细胞生存曲线；C：平板克隆实验结晶紫染色图，大于50个细胞克隆和小于50个细胞克隆（50×Fig.2A:Survivalcurvebytabletcloningassay;B:SurvivalcurvebyWST-1assay;C:Infigureoftabletcloningassay,theclonemore2.3RT-PCR及Westen-blot检测辐射后AIF表达变化3Gy辐射细胞后4、8、12、24hRT-PCR产物电泳图（图3A），con-组为以双蒸水为模板PCR，证实无假阳性，经统计分析AIF转录水平无变化（图3B）（P>0.05）。辐射后不同时间组AIFWB电泳图（图3C），经统计分析蛋白表达无变化（图3D）（P>0.05）。图3A：辐射后各时间组RT-PCR电泳图；B：各时间组AIFmRNA表达相对含量柱状图；C：各时间组AIFWB电泳图；D：各时间组AIF蛋白表达相对含量Fig.3A:Electrophoretogramoftimegroupsafter3GyIRtreatment;B:HistogramofAIFmRNAexpression;C:WBresultoftimegroupsafter3GyIRtreatment;D:HistogramofAIFproteinexpression2.4激光共聚焦观察AIF转位3Gy辐射后AIF逐渐由线粒体向细胞核转位，12h后观察到线粒体释放AIF至胞浆，而后定位于细胞核，伴随着细胞核的溶解、碎裂。AIF为免疫荧光染色，以FITC为二抗标记，呈绿色荧光。细胞核以Hochest33342染色，呈蓝色荧光。线粒体以Mtotracker标记，呈红色荧光。将这三种染色图像融合，既成为融合图。（图4）图4：3Gy辐射后各时间组AIF、细胞核、线粒体荧光图及融合图Fig.4:AIF,nuclear,mitochondrialstatingandmergeoftimegroupsafter3GyIRtreatment2.5亚细胞组分WB辐射12h在细胞核蛋白组分中检测到AIF，24h逐渐增多（图5A），统计分析提示12hAIF在核蛋白组分中含量显著上升（P<0.05）（图5B）。辐射后12h后，AIF在线粒体组分含量逐渐减少（图5C），经统计分析12h后显著下降（P<0.05）（图5D）。图5：A：细胞核蛋白组分AIFWB电泳图；B：细胞核蛋白组分AIF相对含量柱状图；C：线粒体蛋白组分AIF蛋白WB电泳图；D：线粒体蛋白组分AIF相对含量柱状图Fig.4:A:NuclearAIFWBresultoftimegroups;B:HistogramofnuclearAIFproteinexpressionoftimegroups;C:MitochondrialAIFWBresultoftimegroups;D:HistogramofmitochondrialAIFproteinexpressionoftimegroups2.6TUNEL检测细胞凋亡细胞核染色发现，3Gy剂量辐射细胞12h后，部分细胞核出现固缩、浓集。TUNEL染色发现辐射12h后，部分细胞核出现绿色荧光染色，证实了随着细胞核的浓集，细胞核DNA断裂这种凋亡早期事件的发生（图6）。图63Gy辐射12h后细胞核Hochest33342染色及TUNEL染色（100×）Fig.6NuclearHochest33342stainingandTUNELstainingafter3GyIRtreatment12h3.讨论Parthanatos一种新的细胞死亡形式，这种死亡形式不同于坏死、凋亡、程序性坏死和自噬，特征是核DNA断裂成50Kb的片段，而非凋亡产生180-200bp或其整数倍的DNA片段形成的DNALadder。且这种程序性死亡方式更为直接迅速。AIF由线粒体向细胞核的转位是这种死亡机制中的特征，不需要Caspase的参与。1999年，AIF被Susin[7]等人首次鉴定和克隆。在正常情况下，AIF定位于线粒体膜间腔，参与能量代谢，在某些刺激因素作用下，AIF从线粒体中释放至胞浆，进入细胞核，通过EndG对DNA切割，导致细胞核溶解、浓缩、碎裂。并且这个过程不能被Caspase抑制剂阻断，因此是Caspase途径外新的凋亡途径，Hazza首次将其命名为Parthanatos。随着研究深入，发现AIF在普遍参与到多种刺激因素下细胞的凋亡过程。噪声[8]，低剂量X射线[9]，中子和γ射线[10]，顺铂[11]，伊马替尼[12]，黄连素[13]，塞来昔布[14]等，均可导致不同的细胞凋亡，并且发现AIF由线粒体向细胞核转位[15]。因此，Parthanatos是普遍存在的细胞死亡形式，AIF是Parthanatos中的关键分子，而AIF的核转位是Parthanatos的重要特征。医用高能X线能否诱导肺腺癌SPC-A-1细胞中的AIF发生核转位，是否激活了Parthanatos，尚未见报道。因此，本研究重点关注Parthanatos中的关键蛋白AIF的核转位现象。在正常培养的SPC-A-1细胞中，AIF定位于细胞质中。并测得3Gy为LD50，以此剂量辐射细胞，发现辐射后不同时间AIF无论在mRNA水平还是蛋白水平均无显著变化。形态学上，发现细胞受到辐射12h后，AIF由线粒体转位至细胞核，伴随着细胞核的溶解、碎裂。亚细胞组分定量分析同样发现AIF在辐射12h后AIF在核DNA蛋白组分中显著增多，而在线粒体组分中显著减少。AIF转位至细胞核后，TUNEL法检测到DNA的断裂，证实了Parthanatos的发生。通过对AIF及其介导的Parthanatos研究，其重要性逐渐受到重视。Delavallée将Parthanatos总结为Necroptosis（坏死性凋亡），并总结了可以将AIF和AIF介导的坏死性凋亡通路作为治疗靶点的策略[16]。一方面抑制AIF介导的细胞程序性死亡来治疗缺血损伤和退行性变[17]，另一方面加强AIF介导的程序性死亡来进行抗肿瘤治疗，已研发新药BZL101对转移性乳腺癌完成了ΙB期临床研究[18]。因此，AIF及其介导的Parthanatos在肺癌辐射敏感性调控或正常肺组织放射性防护方面也颇具研究意义。参考文献[1]HarrazMM,DawsonTM,DawsonVL.Advancesinneuronalcelldeath2007[J].Stroke,

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