考试复习药物筛选

化学生物学命过程中化学基础的科学生物化学 生物化化学出现19世纪末、2020世纪90年代中主要研究内蛋白质结构及活物质指分现象化学生物学发展进程系统的化学生物学诞生于90年代中代表性的技术进步包括机器，高通量及高灵敏度的生物筛选，信息生物学，工具，组合化学和技术例如DNA。化学生物学更普遍的被chemicalgenetics，而且它正在扩展到化 组学和经典遗传学相比较表达，而是被用于抑制或活化翻译过程药物化学生物学药物研究的基本1药物的发现：最基本的方式是偶然发7作用的生物分子。良好的靶标是发现性质优良药物的基8MembraneHormonesandIonNuclear9组反义核条件敲靶标-小分子三维结组 蛋白质组（proteome） 细白质组指通过纯化细胞器或蛋白质复合蛋白质组人们将蛋白质组定义为一个组、一蛋白质组学是蛋白质组概念的延伸,是在整体学科。所以,与传统的蛋白质化学研究相比,蛋白质,而是着眼于全面性和整体性来命体系内所有蛋白质的性质与 结 组学（structural是蛋白质组学研究最的问题。结 4、药物或异体物质对蛋白质表达和修饰的 第一向为等电聚焦(Isoelectricfacusing，IEF)电泳，polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS)，它 分子量分量第二向电泳SDS-聚焦电 蓝可以检测到30～100ng蛋白 的金属银，使蛋白质条带呈现深棕至黑色来 进行，这样凝胶主要的蛋可以通过考马斯 不到的蛋由银染检测。银染的灵敏度比蓝染色高100倍，可以检测低于1ng的 用P32或P33检测磷酸化蛋白。于非样本。 1整合的生物信息学软件，可到单个模块蛋白 （protein蛋白质是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。蛋白质(proteinchip),也称蛋白质微阵列(proteinmicroarray)性或定量的分析。蛋白质上的探针蛋白可根

,又称蛋白质阵列 分，经荧光扫描等检测方式测上各点的荧光强度，来分蛋白之间或蛋白与其它分子之的相互作用关系蛋白 的作研究蛋白与蛋白的相互作用及相关信号研究蛋白 的意 表达的最终产物,接近生命活动探针蛋白特异性高、亲和力强可简化样品前、细胞及组织等)进行检测适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物蛋白 的分根据制作方法和用蛋白质检蛋白质功蛋白质检蛋白质检 ,又称为蛋白质分 或蛋白质 它是将具有高度亲和特异性的探针分子(如单克隆抗体)固定在基片上,用以识别复杂生物样品溶液(如细胞提取物)中的目标多肽,当放射性同位素或荧光标记 上的探针分子结合后,通过激光共聚焦扫描或电荷耦合检测装置(CCD)对信号的强度进行检测,从而判断样品中靶分子的数量。蛋白质功蛋白质功能 研蛋质、白修、-蛋白质间、-蛋白质间、蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等相互作的 。它是将所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片上制成,用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。要了系中有哪些蛋白质能与蛋白质结合则将制成的蛋白质功能与荧光标记的蛋白质温育,经荧光显微镜扫描检测可知,上的亮点即为蛋白质的蛋白质功能主要用来检测蛋白质的生物学功能蛋白 分根据密度不同对蛋白质微阵列的分类比较简单,即低密度蛋白质和高密度蛋白质。密度的差异主要来备方法的不同。 白质。因此,蛋白质 、条件化培养基蛋白 蛋白 。蛋白 固相载体及其处载体（滴定板、滤膜、胶、载玻片蛋白质的预处选择具有较高纯度和完好物活性的蛋白进行溶点制微阵可使用点 微阵列商品化点样仪或喷墨法

膜为载体 放入湿盒37°C玻片为载体：化学修饰产生基固定蛋微阵列的封主要封闭试剂：BSA或用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水态行使功能的固相材料统称为载体制作蛋白 的载体材料必须符合下列要求①载体表面必须有可以进行化学反应的活性基团以便于蛋白质分子;②使单位载体上结合的蛋白质分子达到最佳容量③载体应当是惰性的,,包括物的、化学的和机械的稳④载体具有良好的生物兼容性 研究药物作用靶双向电泳：蛋白质更接数据分析蛋白 可筛选与靶蛋白相互作用的小分子化合可直接观察蛋白-描 表达模式的两个重要概转录组指一个细胞内的一套mRNA转录胞或组织所表达的种类和水平。蛋白质组指一个细胞内的蛋白质，即研究某一特定状态的细胞蛋白质表达谱飞行质谱、蛋白质技术等。泛指一个有生命体、或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，组是指一套染色组学 HGP包括以下研究内（一）物理制图(physical（二）遗传制图(genetic又称“连锁图”(linkage（三 组DNA序列测（四）创建计算机分析管理系通过HGP获得的广泛组信息组成了结构组学的基本内容，是开展功能组学的研究的基础；同时为详尽研究每一个单遗传病提供“平台”，并将成为复杂的多遗功 组 组学（functionalgenomics） genomeproject,PHGP)是在完成一个生 功 比 功 结组 组 组因功

描表达模

组序列测蛋白质分

转录分

遗传制鉴（注释

物理制转录组概转录组（rascroe）广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使、核糖体RN、转运及非编码A；狭义上指所有的集合。转录 技术是把mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA等用通 技术把它们的序列测出来全面快速地获取某一物种特 或组织在某一状态下的几乎所转录本。反映出它们的表达水平 表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称 表达谱转录本转录本是有一条通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成mRNA。一条通过内含子的不同剪接可构成不同的观遗传、RNA编辑等。通常一条对应DNA分离原DNA分子在碱性环境中带负电荷A分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的A，分子量大小及构型不泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系可依据DNA分子的大小使其分确定一 片断上的碱基顺序Sanger法在PCR时加入荧光标记 终止剂，比ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基ddX的两个作用可以当作正常碱基参一旦链入DNA电此方法获1974年的NobelIllumina公司的Solexa和 差异表达分高等生物的表达不仅具有组织特异性和发单个细胞中表达的仅占总数的15%，不同随时间、空间有选择地表达，这种基和分化、对逆境的反应、细胞、老化等。因此，研究不同类型细胞中表达的差异对于深入研究表达的调控，了解生命过程的反义核酸技 表达干正义链和反义链与mRNA互补的也就是翻译出mRNA的反义寡核苷酸的作用机抑制mRNA抑 或转抑制蛋白质的加工、修饰及功能表反义核酸靶核

碱基互补二聚

降空间阻抑 表反义寡核苷酸的给药途直接作用于培养（直接进入细胞结合L-多聚赖氨酸或 进入细（通过载体进入细胞反义RNA的作用机抑制 ：与引物RNA结合，抑目的mRNA的成熟及向胞浆内转与mRNA互补结合影响加帽、剪接和加抑制mRNA翻与5′端SD序列、起 AUG结合，影响翻使mRNA更易被核酸酶识别而mRNA形成双链反义核酸技术的应分可作为探针进行原位杂交，分 表用 病、肿瘤及遗传性疾病的治反义核酸作用机1）抑制翻 与mRNA结合后激活内源性RNase或ribozyme，降解2）抑制转反义DNA DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA聚体与DNA编码区结合，终止正在转录的mRNA链延长3）反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰，如5'端加、3'端加尾（polya）、中间剪接和 三、小干扰把这条小分子的RNA称为小干扰RNAi的作用起始阶效应阶倍增阶siRNA 或电穿携细 RNAi的应功能的剔治细胞信号转导途径分药物开RNAi的过RISC：RISC：RNA-inducedsilencing生RNaseIII/解旋酶,

剪核糖 白，包有A和蛋白成分。其中就，其蛋白成分包O等

倍产生的21～23nt片siRNA而继续参与RNAi过程RNaseIII/siRNA:siRNA:小分子干扰RNA诱导，具有解旋酶、内切及外切酶活小干扰RNA小干扰RNA19nt2nt32nt3’2-nt3’5’-3’-OH:3’被阻碍后便失具有双链的不对称RNAi作用原细胞内核酸内切酶Dicer将外源性dsRNA构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNARNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源 表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端被切割后的断裂mRNA随即降解，诱发宿主细胞针对这些mRNA的解反应iRNA不仅能引导C切割同源单链N，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶作用下合成 新的A，新合成的A再由cer切割产生大量的次级iRNA，从而使RNA的作用进一步放大，最终将靶A完全降解。RNAi具有的①RNAi是转录后水平 沉默机制②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内 的③RNAi抑 表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程，而且相对很少量的A分子（数量远远少于内源A的数量）就能完全抑制相应 的表达，是以催化放大的方式进行的；④RNA抑制 表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至 至整个有机体以及遗传等特点；bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不 ⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低 显示RNA干是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能。干扰 敲除 敲除是干扰的一个，主要指将目标沉默的现象，但是干干扰包过表KnockKnock敲除概 敲除（geneknockout）是自80年代末以来通过一定的途径使机体特定 失活或缺失敲除除可中止某 的表达包括引入 引入定点突通常意义上的敲除主要是应用DNA同因片段，从而达到敲除的目的。 突变和iRNA，它们 同源重同源重组 bination)是将外 定位到人受体 上的方法通过单一或双交换，将与目 同源的序列 片可替换有缺陷 片段，达到一定的生物学目的位点特异性重组是发生在两条DNA重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；)位点特异性的蛋白因子即重重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重性和高度保守性同homologous和遗能相似，来源一般都相同的，在减数中联会配对的两条。同 与异 （homologouschromosomes）有丝，或减 时看到的两两配对的染体。同 一个来自父本，一个来自母；它们的形态、大小和结构相 同源和等位的联系和区别有同源不一定有等位，等位必在同源上。同源相同部位可能相同可能不同，如果相同则这一对不能被称为等位。等位概念位于一对同源的相同位置上控制某一性状的不同形态的，叫做等位，如A和a。敲除的技术路线过（1）构建重 载体（2）DNA转入受体细胞核内（3）用选择培养基筛选 的细胞 转化/转染与转导的区 内从细菌里面纯化的DNA分子直接导入遗传性状相异的细菌。从这个概念的内涵来说，只要DNA进入细菌，就完成了转化过程，不涉及转化的DNA是否 成功多半只能通过DNA是否改变细菌的遗传性状来实现。 而发生 转移；其次，转移的必须是宿主的 DNA都可能整合到受体 以外的宿主DNA，这个过程就不能叫做转导。最后，这个DNA必须整合到新宿主细胞 ，一 与宿主DNA发生重组，形成新 组，包 的办法把目的DNA 电击显微注射磷酸钙 利用同源重组构 敲除动物模型的基本步第一步 载体的构把目 和与细胞内特异片段同源的DNA分子都组到带有标 的载体上成为重组载体利用同源重组构 敲除动物模型的基本步第二步：ES细胞（胚胎干细）的获得现在敲除一般采用是鼠等的胚胎干细胞也有使用利用同源重组构 敲除动物模型的基本步第三步：同源重将重组载体通过一定的方式(源的胚胎干细胞(EScell)中， 一般地，显微注射较孔比显微注射低，但利用同源重组构 敲除动物模型的基本步 为10-2～10-5，植物的概率为10-～10-5。因此如何从众多细胞目前常用的方法是正负筛选 用最多的是PNS法。利用同源重组构 敲除动物模型的基本步第五步：表型研 利用同源重组构 敲除动物模型的基本步第六步：得到纯合对上中一条中,纯合体敲除模型，需要同源重组进 敲除主要包括1）条件 敲2）诱导 敲条件 敲除条件性敲除法可定义为将某个的修饰特定阶段的一种特殊的敲除方法。 靶标确证的主要方1、免疫共沉淀(Co-3、荧光偏振检测(FP，FluorescencePolarized4、5、表面等离子 技术(Surfaceplasmon6、等温量热滴定7、蛋 外结合PullDown实8、微量热泳动(microscalethermophoresis9、荧 12靶标确证的主要方2、紫外吸收光谱法（UV4、荧 7、8、酶联免疫吸附检测9、表面等离子 技术(Surfaceplasmon10、等温量热滴定 外结合PullDown实12、免疫共沉淀(Co-14、微量热泳动(microscalethermophoresis15、CaliperEZReader1617、离子通道检测(包括离子浓度、膜电位、pH值等、18HomogeneousOne-potassayswithnotransferorwashAllthereagentsareaddedinonesteporinThesignalisreadinaplate多步筛选：multipletransfers/filtrations/readingsoftheLaborintensive,complicatedstep,hardtoSPA检测方法及原它通过化学处理分子使抗体、受体蛋白质和酶偶联到含闪烁的微球体（荧光微球体或SA）的表面上，若标记有3H或2I的分子被直接结合 球体表面，或通过先前的偶联分子相互作用结合在微球表面，在微球和产生光信号之间的放射辐射能与引起闪烁的能量非常接近，可使用闪烁计数器方便地测定荧光光谱检荧 能量转时间分辨荧荧光偏荧光检测方法的优点无放射实验重复性可实现特殊分子的荧光高灵敏荧光检测方法的缺点反应体系中背景荧光的反应体系中荧光淬灭剂反应体系中自发荧光的EX/EM之间的距FRET/TR-FRET需要双荧光标FRET产生原两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一回到基态前，通过偶极子相互作用，实现能量向邻近的受体分子转移（即发生能量转移）发态能量转移到受体激发态，使供体荧光强度降低，而受体发射本身的特征荧光的过程。FRET是一种非辐射能量FRET的关键受、供体均为荧光分受、供体的激发光要足够分得供体的发光光谱与受体的激发光谱供、受体分子的空间距离一般为10nm以FRET的生物学应检测激酶活检测膜受体生物学效检测蛋白-蛋白间的相互作标 电

亲和层

胰蛋白酶

得到分子得到分子量与数据库对照得到靶蛋白信息λ供体发射=λ受体激

持久 发射光谱最大值

子结合的用来分离或确证某种