刘秀梵 我国新城疫的防控实践和基因VII型新城疫疫苗的研发12.16-2课件

我国新城疫的防控实践和

基因VII型新城疫疫苗的研发

刘秀梵扬州大学兽医学院新城疫是《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》优先防治的5种一类动物疫病之一，在我国也是使用疫苗频率最高的动物疫病。一、ND流行病学研究和我国的防控实践次数持续时间流行毒株的基因型第一次1920年代-1960年前基因II、III、IV型（早期基因型）第二次1960年代-1970年代初基因V和VI（晚期基因型）第三次1970年代后期-1980年代前期基因VIb亚型（晚期基因型）第四次1980年代后期至今基因VII型（晚期基因型）新城疫的四次大流行分子流行病学研究近20年来新城疫在我国家禽中流行的特点主要表现为免疫鸡群中常发生非典型新城疫和对家养水禽的毒力增强——在鹅引起严重临床疾病。这两个流行特点都与新出现的基因VII型病毒有关。①1997年前后在中国出现鹅大批发病的新传染病-鹅副粘病毒病。*确定鹅副粘病毒病是由基因VII型病毒引起的，是鹅的ND；*确定近年来我国鹅群和鸡群流行的NDV强毒95%以上是基因VIId亚型；*确定从鹅分离到的和从鸡分离到的基因VIId亚型病毒没有宿主特异性和致病差异，可以交叉感染发病，互相传播；*常规ND疫苗对鹅的ND保护性差，而用分离的野毒（基因VIId亚型）制成的自家疫苗效果较好，但存在散毒风险。LiuXFetal.ArchVirol,2003;WanHetal.AvianPathol,2004;HuangYetal.ArchVirol,2004;WangYetal.VirolJ,2012免疫鸡群中的非典型ND，自1980-1990年代以来就普遍发生，而分离到的NDV也都是基因VIId亚型。问题1：新城疫病毒只有一个血清型常规的疫苗还能不能对流行强毒提供有效保护？Cross-protectionefficacyinchickensimmunizedwiththeLaSotavaccineafterchallengewithvirulentstrainsofdifferentgenotypes(FromQinetal.JclinMicrobiol,2008)

为了保护不发生死亡也不出现包括产蛋下降在内的临床症状，自1980年代以来，我国的规模化的鸡场就采用的对ND的高频率密集型免疫程序。种鸡和蛋鸡一生接种ND疫苗在10次甚至20次以上，但即使这样，免疫鸡群仍频繁发生非典型ND。因此，常规疫苗对流行的基因VII型已不能提供有效保护。1、基因型差异：常规疫苗为基因I、II、III型，属早期基因型，而当前优势流行株为基因VII型，属晚期基因型，遗传差异大；2、抗原差异性：交叉血凝抑制和病毒中和试验证明，疫苗毒和基因VII型流行毒之间抗原性有显著差异（R＜0.2）；

基因型IIIVIVIIcVIIdReference数量13164LiuHetal.JVirolMethods，2007277LiuHetal.ResVetSci,200813RuiZPetal.VetMicrobiol,20093Wetal.VirusGene,20102457WuXetal.ArchVirol,201148ZhuJetal.2013总计571262275(其中VII型毒株263)2006年来我国NDV强毒分离株的基因型分布进一步分析显示，2006年至2013年间共报道分离新城疫强毒216株，其中VII型毒株206株，占到了分离株的96%左右，表明基因VII型毒株的分离率正呈上升趋势。NDV流行株与常规疫苗株的遗传关系

基因VIId亚型NDV分离株与II型疫苗株的遗传关系较远。基因FHN同源性84.1%～84.4%78.7%～83.0%

aNottestedbRvalue=头

当R值<0.5时，证明毒株间存在明显的抗原差异CrossantigenicreactionbetweenKBNP-4152(VIId)andLaSotabyHIandserumneutralization(SN)tests(FromChoetal.VirusGenes,2007)

流行株与疫苗株之间的抗原性差异研究发现流行株KBNP-4152（基因VII型）与LaSota抗原相关性值R为0.18，此外中和试验结果显示LaSota抗血清对KBNP-4152的中和效价仅为KBNP-4152抗血清的0.008（1/128），差异极显著。SerumVirusstrainsLaSotaJS-09-12-ChJS-03-12-ChJS-04-12-ChJS-10-12-ChJS-11-12-ChJS-13-12-ChJS-05-12-ChAnti-LaSota96776666Anti-NDV/VII79889989HItestofanti-LaSotaserumwithpartialstrainsisolatedin2012（log2）

HI试验表明，近年来分离的部分流行毒株与LaSota株之间存在较明显的抗原差异，LaSota株血清与自身反应的效价是其与流行毒株的4-8倍。国内外实验室研究业已证明：使用与流行株同基因型的疫苗，可有效降低免疫鸡群中NDV强毒的携带量及感染率.基因VII型NDV强毒的致病性特点①与早期病毒F48株（基因IX型）和Hert33株（基因IV型）相比，引起严重的免疫系统损伤，脾脏显著坏死；

②与早期病毒F48株（基因IX型）和Hert33株（基因IV型）相比，在体内的复制能力强，呼吸道和肠道的载毒量高，排毒时间长。基因VIId亚型NDV导致脾脏严重的细胞坏死、纤维组织增生和淋巴细胞减少。LaSota免疫鸡群感染VIId亚型NDV与F48E8后的排毒测定（阳性数/样品数）组别HI效价（Log2)攻毒株3日5日7日喉头泄殖腔喉头泄殖腔喉头泄殖腔免疫组6F48E85/10＊0/101/10＊2/10＊0/100/106JS5/0510/103/108/108/100/103/10

因此，当前VIId亚型在我国流行强毒株中已占有绝对优势，而目前在我国禽群中普遍使用的弱毒疫苗株LaSota属于基因II型，其分离于上世纪40年代，距今已有近70年的历史。

常用疫苗株与流行株之间的遗传距离较远，抗原性已发生较大变异，以临床症状和排毒率为评价指标已不能提供充分保护，这是免疫鸡群发生非典型ND的根本原因。因此有必要研制与流行株完全匹配的基因VII型新城疫新型疫苗。为了解决困扰我国的免疫鸡群发生非典型新城疫问题和缺乏鹅用新城疫疫苗的问题，我们经过10多年的努力，研制成基因VII型新城疫疫苗，并于2014年11月17日获得国家一类新兽药注册证书。*必须是低致病性，最好比LaSota低；*必须在鸡胚和细胞上繁殖性能好，产生毒

价高（与LaSota比）；*必须免疫原性好，与流行毒株的匹配性好，产生的免疫应答优于LaSota。

这样的种毒必须通过反向遗传技术对基因VII型NDV强毒进行遗传改造。1、基因VII型ND疫苗的种毒有哪些要求？2、NDV强毒反向遗传技术平台的建立①第一个基因VII型NDV强毒ZJ1株的全基因组序列测定，为反向遗传平台建立打下基础。重大发现：晚期基因型（V、VI、VII、VIII）和过渡基因型(IX)NDV，基因组全长为15192nt，比早期基因型（I、II、III、IV）在NP基因的非编码区多6nt的插入。HuangYetal.ArchVirol,2004②NDV强毒反向遗传技术平台建立:

*ZJI-GFP拯救成功LiuYLetal.ArchVirol,2004基因VIId亚型NDVA-VII株的拯救LiuYL,etal.ArchVirol,2007HuSL,etal.Vaccine,2009GenerationofA-VIIviaattenuationTrailer5'LeaderNP

PFHNL3'M12215911887

30803296

43904550621164188153838715001HuSL,etal.Vaccine,2009VirusesPathogenicityAllantoicfluidstiterMDTICPIEID50/0.1mlHAE1>120h0.3108.810log2E5>120h0.16109.1711log2E10>120h0.22109.311log2E15>120h0.17108.810log2重组病毒A-VII生物学特性的鉴定

根据ICPI和MDT指标，A-VII株的毒力比LaSota低，用作疫苗毒株安全性好。以鸡胚繁殖病毒，尿囊液中A-VII株的HA≥10log2。免疫后不同时间抗体HI效价上升曲线﹡均以自身免疫毒株作为4单位病毒

效检试验结果显示，致弱株A-VII免疫原性强，其灭活苗以较低剂量（20ul）免疫SPF鸡时即可产生高滴度的HI抗体，且其诱导抗体产生的速度较LaSota快。ImmuneefficacyofNDV/A-VIIinchickensFrequencyofisolationofchallengevirusincommercialchickensaC:challengedwith105ELD50JS2/06.bO:Oropharyngealswabs.cC:Cloacalswabs.dNS:nosurvivors.(A)Meanvirustitersoforopharyngealswabsofimmunizedgroupsonallsamplingdays.(B)Comparisonoforopharyngealvirustitersat2daypost-challenge.

(A)Meanvirustitersofcloacalswabsofimmunizedgroupsonallsamplingdays.(B)Comparisonofcloacalvirustitersat4daypost-challenge.*A-VII株的MDT＞120h，ICPI＜0.3，毒力比LaSota低；*A-VII株在鸡胚上毒价高达109.3EID50/0.1mL，HA≥10log2；*A-VII株与流行株完全匹配，免疫原性很强，产生的HI抗体比LaSota高2-3log2，抗体上升提前1星期，减少排毒滴度比LaSota低10-100倍；*A-VII株的论文2009年在国际《疫苗（Vaccine）》杂志发表。OIE出版的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》

连续5年引用。A-VII株种毒的优良特性中间试制、临床试验和新制品的注册申报阶段2009年~2011年完成重组新城疫病毒（A-VII株）灭

活疫苗中间试制、质量研究，申请临床试验；2010年9月8日《基因VII型新城疫病毒致弱株A-新城

疫病毒-VII及其构建方法》获国家发明专利授权；2011年~2012年获得农业部临床试验批件，进入临床

试验执行期；2013年~2014年完成新兽药注册初审；2014年完成新

兽药注册质量