酶联免疫技术

酶联免疫技术（ELISA)

常用的检测方法

------微生物法

1、仅适于抗生素总残留的检测，目前在牛奶的抗生素检测中占据一定市场．2、优点：为成本较低、检测速度较快;3、缺点：不能区分具体的抗生素药物，灵敏度和特异性相对较低．常用的检测方法

----物理化学法1、如液相色谱(HPLC)、气相色谱(GLC)、质谱

(MS)、薄层色谱法(TLC)等，可用于鉴定和定量。2、优点：分离度好、专属性强，常常可以同时测定几种药物。3、缺点：需要专门仪器和熟练技术的分析人员，而且需要复杂的样品前处理和高纯度的化学试剂。由于样本前处理设备多、测定操作烦琐和费用高，在基层实验室推广和使用受到限制。因而检测大批样本较为困难。

常用的检测方法

-----生物芯片法1、生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量抗原等有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器，比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量.2、主要特点是高通量、微型化和自动化，因涉及技术和仪器问题，目前还不能普及应用．常用的检测方法

-----酶联免疫测定法1、将抗原与抗体反应和酶化学反应结合到一起的测定技术，近年来已研发出多种ELISA检测试剂盒用于检测动物组织中的药物残留。2、具有灵敏度高、快速、特异性强的特点，所需仪器化程度低和样本前处理相对简单，特别适于现场监控和大量样本筛查。3、现用于兽药残留检测的试剂盒，如国外德国

R-Biopharm，国内深圳绿诗源、北京望尔等。1.

ELISA的原理2.

ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断

ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。---利用抗原抗体的特异性反应作为识别手段，用酶催化底物等方法作为显示系统，用微孔板等材料作为载体和分离系统的一种生物学检测方法。---结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量待测物的含量。1.

ELISA的原理酶免疫测定类型

这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定1.1抗原抗体反应

可逆性

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab

抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。特异性

抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。

测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

最适比例

敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。1.4免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。ELISA的类型一、双抗体夹心法：测抗原（成正比）双抗原夹心法：测抗体（成正比）二、间接法：检测抗体常用的方法。（成正比）三、竞争法：测抗体（成反比）竞争法：测抗原（成反比）小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

固相载体抗体酶抗原酶标记抗原方法一:直接竞争法(包抗体)1.将抗体包被在固相载体上。2.加入样品和酶标记抗原,两者竞争板上的抗体.3.酶催化底物并显色。样本/标品(抗原)方法:反应步骤少,操作简单;特异性不如间接竞争法.酶抗抗体酶标记抗抗体抗体偶联抗原样本/标品固相载体方法二:间接竞争法(包被抗原)1.将抗原包被在固相载体上。2.加入样本和抗体后，若样本中含有抗原，则将和板上抗原竞争结合加入的抗体。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色方法二:二步反应,操作比较简单,有放大灵敏度和增强准确度的作用酶抗原酶标记抗体样本/标品(抗原)抗抗体固相载体抗体方法三:间接竞争法(包二抗)1.将抗抗体（二抗）包在固相载体上。2.加入抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入样本和标准品及酶标记抗原，两者竞争结合抗体。4.酶催化底物并显色。方法三:二步反应,操作比较简单,在加样本时容易出现时间差而影响检测结果的准确度.酶抗抗体酶标记抗抗体抗体样本/标品（抗原）固相载体方法四(一步法反应)1.将抗原（或二抗）包被在固相载体上。2.加入样本和酶标记二抗或酶标抗原后，最后加入抗体，三种一起混合反应。形成抗原（二抗）--抗体-酶标记抗抗体（抗原）复合物。4.酶催化底物并显色

“一步法反应”方法四:操作简单,方便,快速.反应灵敏.抗抗体ELISA主要的仪器设备1、酶标测定仪、通风柜2、洗板机或洗涤瓶、恒温培养箱、冰箱3、低温离心机、离心管4、氮气吹干仪、真空泵5、均质器、振荡器6、刻度移液管、天平（感量0.01g）7、微量移液器：单道0.5-10ul,20-200ul,100-1000ul，多道50ul-300ulELISA常用有机试剂乙酸乙酯、乙腈、正己烷、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、Na2HPO4·12H2O、浓HCL、NaH2PO4·2H2O、NaOH、蒸馏水

样本前处理操作对结果的影响因素

样品的取样和提取

——

取样1、均质：新鲜样品在均质时，一定要去除与检测无关的其它组份（脂肪、皮、鳞等）。（合理的抽样方法抽取样本均质,否则会造成在同一个样本中检测出不同的实验结果）2、取样：取均质后，未被水浸泡过的匀浆样本。（取被水浸泡后的样本可能会造成假阳性）样品的取样和提取

——

提取1、震荡：充分混匀、震荡；在规定时间内充分提取。（提取不完全会造成假阴性，检测不出阳性值）2、离心：离心分离时，按要求转数离心，若达不到离心转数则要求增加相应的离心时间，最终达到分离的目的（离心不彻底，上清浑浊会造成假阳性）3、取液：在有两相以上分离时，取目的相一定注意不能带入其它相（枪头靠壁吸取）。随机带入的其它相越多，假阳性/假阴性也将越高。（注意：用加样器取有机溶剂时，应注意避免交叉污染）宝安康ELISA试剂盒基本原理

——

间接竞争法

原理：

----竞争法原理是固相抗原、待检抗原与特异性抗体竞争结合，加入酶标二抗放大信号后，加入底物液显色，标本中抗原越多，与特异性抗体结合得越多，颜色越浅，反之越深，因此根据颜色深浅可以进行定量测定也可目测进行定性测定。ELISA基本的实验过程1、包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化2、抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定3、酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色ELISA基本的实验过程

----示意图深圳宝安康检测试剂盒操作

——ELISA测定前注意事项11、实验前检查酶标仪和打印机工作是否正常。2、试剂盒反应温度为说明书上规定温度，要提前开恒温箱，并调整好温度。3、使用之前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。使用之后立即将所有试剂放回2-8℃冰箱。4、实验中所用水为去离子水，若没有制备去离子水的仪器，也可使用纯净水。5、所有试剂在使用前都应充分混合，保证试剂的均一性。6、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。深圳宝安康检测试剂盒操作

——ELISA测定前注意事项27、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。8、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。9、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化，不要交换使用不同批号的盒中试剂。10、储存条件保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。11、试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（OD450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。12、该产品有效期为1年。（生产日期详见试剂盒封口处）深圳宝安康检测试剂盒操作

——ELISA测定注意事项1---加样

用微量加样器加样，加样时应加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加酶结合物、抗体、底物及终止液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

深圳宝安康检测试剂盒操作

——ELISA测定注意事项2----保温

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体、酶标记物、显色反应是一个逐步平衡的过程，因此需要一定时间的温育。温度过高或过低都会对实验结果造成一定的影响。

37℃

（在培养箱中进行孵育，控制好箱内的实际温度）

25℃

（在培养箱中进行孵育，控制好箱内的实际温度，也可在室温条件下进行，但是温度要接近所规定温度）

温度高或低都会影响实验的OD值，导致实验结果的不准确，尽量在规定的温度、时间条件下进行实验，保证实验结果的准确性。

深圳宝安康检测试剂盒操作

——ELISA测定注意事项3----洗涤

洗涤是ELISA操作中一个重要步骤，决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。注意：在加入试剂前各板孔应全部干透。ELISA板的洗涤ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①甩干孔内反应液；②将洗涤液在板孔上方0.5cm处注入板孔；不得相互间渗溢；③放置15s，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为4～5次。深圳宝安康检测试剂盒操作

——ELISA测定注意事项4----显色

辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）常用于酶免疫技术的标记物，它是从辣根菜中提取的酶类，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在。常用的有四甲基联苯胺（TMB），测读波长为单波长450nm或双波长450nm/630nm。

显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间是影响显色的主要因素。为保证实验结果的稳定性，宜在暗处、规定的适当时间内检测结果。DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。深圳宝安康检测试剂盒

——ELISA测定结果计算1、可根据样品的吸光值和标准品的吸光度值比较即可定性判定，得出样品含药物的浓度范围。2、利用试剂盒专业分析软件进行定量测定计算，更便于大量样本的准确、快速分析。3、标准曲线的绘制：横坐标（X轴）：标准品浓度的对数值纵坐标（Y轴）：标准品最大吸光度值呈线性（直线回归方程Y=AX+B，其中X=Lgx）4、样品浓度值的计算：

x=10X即x=10(Y-B)/A5、实际样品浓度值：不同样品乘以相应的稀释倍数标准曲线图示深圳宝安康克伦特罗试剂盒1、原理---本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测猪尿和猪组织等样本中的克伦特罗，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的克伦特罗和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的克伦特罗含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出克伦特罗含量。2、试剂盒技术指标：灵敏度：

0.025ppb/A0.1ppb/B0.1ppb样本检测下限：尿样:0.025ppb

组织:0.025ppb

饲料:2.5ppb回收率：尿样--90%±10%

组织--80%±10%

饲料--80%±15%交叉反应率：克伦特罗—100%,特普他林—﹤7%,

马布特罗——95%,溴布特罗—115%,

沙丁胺醇—﹤1%,莱克多巴胺—<1%样本前处理方法

（a）尿样本的处理方法取20µl清亮尿样或血清直接测定（如果尿样或血清浑浊一定要过滤或离心10min。15℃，4000r/min，直至得到清亮尿样或血清），暂不使用于样本应冷冻保存。（b）组织样本的处理方法

1、称取2±0.05g的组织，加入6ml乙腈-0.1MHCl，振荡

5min,室温4000r/min以上离心