关于生物制药技术

第二章关于生物制药技术第一节生物技术在制药工业中的应用

第二节生物制药技术概论第三节基因工程技术

第四节原生质体融合技术第一节生物技术在制药工业中的应用一：酶蛋白抑制剂

二：基因工程药物

三：动物细胞基因在植物中的表达

四：基因重组疫苗

五：基因治疗药物

现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程四大类。基因工程药物又涉及到酶蛋白抑制剂、基因重组疫苗、单克隆抗体、基因治疗药物。一：酶蛋白抑制剂不同的酶抑制剂可用于治疗许多不同的疾病。

（1）蛋白酶抑制剂可治疗肿瘤、气肿病。

（2）角鲨烯合成酶抑制剂可降低胆固醇。

（3）3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A胆固醇乙酰转移（4）酶抑制剂治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化。

（5）血管紧张素转化酶抑制剂可治疗高血压。

（6）糖苷水解酶抑制剂可治疗糖尿病、高脂蛋白血症、肥胖症。

（7）磷酯酶抑制剂可治疗胰腺炎。二：基因工程药物基因工程药物着眼于整个基因组，其方法是让目的基因在一个体外系统的细胞中表达，再经过分离纯化，来生产药物。

基因工程有以下分类：1：细菌基因工程2：哺乳动物细胞工程3：哺乳动物体内生物反应器工程4：哺乳动物乳腺反应器工程1：细菌基因工程把目的基因导入到细菌中，通过目的基因所表达的蛋白质，来生产药物。细菌基因工程的缺点：

（1）由于细菌是低等生物，有时不能转录和翻译所导入的基因，或者所表达的蛋白质缺乏生物活性。

（2）细菌工程药物的生产需要一个很大的发酵车间，其生产成本较高。2：哺乳动物细胞工程通过培养动物细胞，将目的基因导入到动物细胞内，用来生产动物或人所需要的蛋白质药物。例如：人凝血因子1X就是通过动物细胞工程生产的。优点：药物对于人体来说具有较大的组织相容性。缺点：（1）动物细胞培养条件十分苛刻。（2）生产成本较高转基因动物

1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了AV40DNA转基因小鼠。

Palmiter等人于1982年将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中。3：哺乳动物体内生物反应器工程这种方法实际上就是转基因动物生产技术的应用，将目的基因导入到动物的受精卵中，与染色体DNA整合，从而形成稳定的遗传性。目前，转基因动物生产的药用蛋白有：

（1）抗凝血酶III、 （2）a1-抗胰蛋白酶、

（3）血红蛋白、 （4）乳铁蛋白、

（5）磷脂蛋白、 （6）长效tpA、

（7）生长激素。

如美国Genzyme公司培育出的tpA转基因山羊，每知羊奶中tpA的含量最高可达100克。优点-------能够持续不断地获得转基因药物。哺乳动物的基因动物克隆技术4：哺乳动物乳腺反应器工程最理想的是将基因导入到哺乳动物的乳腺细胞，形成哺乳动物乳腺反应器，最后从动物的乳腺中获得基因药物。

目前，从转基因牛分泌的乳汁中可以获得含有

（1）人白蛋白、

（2）乳铁蛋白、

（3）纤维蛋白源、

（4）抗凝血酶等等基因药物。

英国罗斯林研究所的转基因羊，其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶，可用来治疗囊性纤维化肺病、肺气肿。哺乳动物乳乳腺反应器器工程优点点（1）通过过乳汁获得得药物，能能够获得较较高的产量量，同时也也容易提纯纯。（2）乳腺腺是一个外外分泌器官官，乳汁不不会参与体体内循环，，也不会影影响转基因因动物自身身的生理代代谢过程。。（3）乳汁汁所表达的的蛋白质经经过修饰加加工之后，，具有稳定定的生物活活性。（4）对于于牛、羊这这些大量分分泌乳汁的的动物来说说，动物本本身就相当当于一座大大型的药物物工厂。三：动物细细胞基因在在植物中的的表达动物细胞基基因在植物物中的表达达就是植物物生物反应应器。随着基因工工程研究技技术的不断断深入，国国外已经有有十几种动动物性的蛋蛋白质、多多肽可以在在植物中表表达。1、植物生生物反应器器实例2、动物细细胞基因在在植物中的的表达中的的优缺点1、植物生生物反应器器实例（1）乙肝病毒表表面抗原（（HBsAg）在植植物中转基基因大肠杆菌热热不稳定性性肠素菜B亚基（LT-B））在植物中中转基因诺沃克病毒毒外壳蛋白白（Norwalkvirus）在在植物中转转基因盖氏13单单克隆抗体体（Guys`13mAb）在植植物中转基基因----预防龋龋齿谷氨酸脱羧羧酶（GAD）在植植物中转基基因----预防糖糖尿病粒细胞巨噬噬细胞集落落刺激因子子（GM-CSF））在植物中中转基因----预预防感染Leu-脑脑啡肽（Leu-Enkephalin）在植植物中转基基因----镇痛。。1、植物生生物反应器器实例（2）水蛭素（Hirudin）在在植物中转转基因----凝血血酶抑制因因子表皮生长因因子（EGF）在植植物中转基基因----刺激上上皮细胞分分裂促红细胞生生成素（EPO）在在植物中转转基因----调节节红细胞水水平红鳟生长激激素（Growthhormone）在植物物中转基因因----刺激生长长人血清白蛋蛋白（Humanserumalbumin）在植植物中转基基因人干扰素（（HIFN-a-D）在花椰椰菜花叶病病毒中转基基因----抗病毒毒a-天花粉粉蛋白（a-trichosantin）在烟烟草花叶病病毒中转基基因-----抑制制艾滋病病病毒。1、植物生生物反应器器实例（3）血管紧张肽肽转化酶抑抑制剂（ACEI））在烟草花花叶病毒中中转基因----抗抗过敏反应应流感病毒血血凝素和艾艾滋病毒抗抗原（HIV-1gp120）在烟草草花叶病毒毒中转基因因疟疾抗原在在烟草花叶叶病毒中转转基因口蹄疫病毒毒抗原和象象鼻病毒抗抗原（HRV-14）在豇豆豆花叶病毒毒中转基因因水貂肠炎病病毒抗原（（MEV-VP2））在豇豆花花叶病毒中中转基因犬细小病毒毒抗原（CPV-CP-VP2）在李李痘病毒中中转基因。。2：动物基基因在植物物中的表达达中的优缺缺点优点：（1）可以以减少纯化化过程而大大降低了成成本，（2）通过过植物生物物反应器方方式，人们们只须通过过吃水果、、蔬菜等方方式来替代代打针、吃吃药。（3）将植植物生物反反应器与植植物的组织织培养结合合起来，就就可以在组组织培养车车间生产有有价值的转转基因药物物。缺点：外源蛋白质质在植物中中的表达水水平还不高高。四：基因重重组疫苗1、基因疫疫苗的生产产方法2、基因疫疫苗的种类类和特征3、基因疫疫苗的优缺缺点1990年年9月14日，美国国国立卫生生研究院（（NationalInstitutesofHealth,NIH）正正式批准安安德生（W.F.Anderson）领导导的治疗小小组为一位位因腺苷脱脱氨酶（ADA）基基因缺陷而而出现严重综合性性免疫缺陷陷症（SCID））的４岁女女孩作基因因治疗。安安德生采用用白细胞培培养，以带带正常ADA基因的的病毒感染染白细胞，，再将白细细胞注入体体内。到1991年年5月，经经7次注射射，患儿体体内ADA水平达到到正常人的的25％，，免疫功能能逐渐恢复复。1、基因疫疫苗的生产产方法基因疫苗又又称核酸疫疫苗、也称称为裸DNA疫苗，，其方法是是：（1）将编编码某种搞搞原蛋白的的外源基因因克隆到真真核质粒之之中。（2）将将这种质质粒作为为疫苗注注射到动动物体内内。（3）质质粒的DNA转转录产生生蛋白质质成为抗抗原，激激活动物物体内的的免疫系系统。达达到免疫疫的目的的。2、基基因疫苗苗的种类类和特征征目前，基基因疫苗苗在治疗疗流感病病毒、乙乙型肝炎炎、结核核病、疟疟疾、狂狂犬病、、乳腺癌癌、肺癌癌、前列列腺癌、、艾滋病病、干细细胞淋巴巴瘤、脑脑炎病毒毒等等方方面已经经进入研研发阶段段。基因疫苗苗的特征征：（（1）基基因疫苗苗既具有有预防作作用、又又具有治治疗作用用。（（2）既既能激发发机体产产生免疫疫应答，，本身又又具有免免疫作用用。3、基因因疫苗的的优缺点点基因疫苗苗的优点点：（1）基基因疫苗苗的抗原原结构接接近天然然构象。。（2）抗抗原性强强。（3）生生产成本本低。基因疫苗苗的缺点点：急需解决决的是转转基因生生物安全全性问题题，必须须保证质质粒DNA不与与宿主动动物发生生基因整整合，以以防止后后代发生生致畸作作用和出出现遗传传病。五：基因因治疗药药物帕金森氏氏病的患患病原因因是由于于大脑丧丧失了产产生多巴巴胺的细细胞，其其理想的的替代来来源是人人体的胎胎儿组织织，然而而这种细细胞的来来源十分分有限。。为此人们们开始研研究动物物的胎儿儿细胞。。通过基基因重组组技术，，克隆牛牛的多巴巴胺生成成细胞到到大鼠体体内，以以期望能能够大量量生产多多巴胺。。第二节生生物物制药技技术概论论一：从DNA→mRNA→Pr二：细胞胞破碎技技术三：提取取技术四：分离离纯化技技术五：灭菌菌技术六：干燥燥技术七：基因因工程原原理一：从DNA→mRNA→Pr1：DNA的半半保留复复制2：DNA转录录成mRNA3：mRNA逆逆转录成成DNA4：mRNA转转译成蛋蛋白质5：蛋白白质在细细胞内的的加工和和修饰二：细胞胞破碎技技术（一）物物理方法法（二）化化学方法法（三）新新型技术术和方法法（一）物物理方法法1：研磨磨法----细细胞在玻玻璃球、、或者钢钢球之间间被碾碎碎。2：捣碎碎法----在在韦林氏氏捣碎机机中，细细胞被彻彻底捣碎碎。3：高压压匀浆法法----细胞胞被强近近性地通通过小孔孔而剪碎碎。4：超声声波破碎碎法----利利用超声声波的空空穴作用用来破碎碎细胞。。5：快速速冰冻融融化法----（二）化化学方法法1：渗透透冲击法法----在细细胞液中中加入2倍量的的纯水，，由于渗渗透作用用，细胞胞外的水水分进入入细胞内内，导致致细胞膜膜胀破，，而将内内含物释释放出来来。2：干燥燥处理法法----3：自溶溶法----4：酶处处理法----多采用用溶菌酶酶进行处处理。此此外，还还有链霉霉菌酶、、白细胞胞酶C也也可用于于进行酶酶处理。。5：表面面活性剂剂增溶溶溶解法----采用洗洗涤剂破破坏细胞胞壁，使使内含物物释放出出来。常常用的洗洗涤剂有有：（1）十二二烷基苯苯磺酸钠钠阴离子子洗涤剂剂，（2）含有有铵盐、、或者氯氯化十八八烷基三三甲基季季铵盐的的阳离子子洗涤剂剂，（3）脂肪肪醇聚氧氧乙烯醚醚的非离离子型洗洗涤剂。。6：噬菌菌体作用用法----7：电离离辐射法法----（三）新新型技术术和方法法1：激光光破碎法法2：冷冻冻喷射法法3：高速速相向流流撞击法法三：提取取技术1：盐析析法2：有机机溶剂分分级沉淀淀法3：等电电点沉淀淀法4：结晶晶和重结结晶法5：酶酶解法6：萃萃取法（（本章节节重点讲讲解）7：透透析法8：吸吸附法9：过过滤技术术萃取法（1）液液-液萃萃取（2）化化学反应应萃取（3）其其它萃取取技术（4）双双水相萃萃取（1）液液-液萃萃取是利用一一种溶剂剂将生物物产品从从发酵液液中提取取出来的的过程。。萃取设备备有离心心萃取器器。（2）化化学反应应萃取（尚在试试验之中中）05SFT-150超超临界萃萃取反应应仪（3）其其它萃取取技术液膜萃取取反胶团萃萃取电场强化化萃取超临界萃萃取凝胶萃取取所有这样样技术尚尚在实验验室阶段段，还没没有应用用于工业业生产。。（4）双双水相萃萃取由于生物物大分子子在加入入有机相相之后常常常会失失活，因因此出现现了双水水相萃取取技术。。如用聚聚乙二醇醇（PEG）和和葡聚糖糖（Dex），，在水中中可以形形成密度度不同的的二相。。这二相相之间互互相不溶溶混，同同时二相相中的水水溶液均均超过70%。。所以称称之为双双水相。。能构成成双水相相有还有有聚乙二二醇（PEG））和无机机盐。双水相萃萃取的回回收率一一般在80-90%之之间，其其特点是是清除细细胞碎片片的能力力较强。。另外，，由于聚聚乙二醇醇（PEG）和和葡聚糖糖（Dex）对对蛋白质质很稳定定，即使使在常温温下进行行操作也也不会导导致蛋白白质失活活。四：分离离纯化技技术（一）：：膜分离离技术（二）：：层析技技术（三）：：电泳技技术（一）：：膜分离离技术1：渗透透法2：反渗渗透法3：超滤滤技术4：电渗渗析法5：多孔孔陶瓷膜膜分离法法6：渗透透汽化法法3：超滤滤技术（1）微微滤法，，其滤膜膜的孔径径为0.05——2.0um之之间，可可阻留分分子量为为20-100万的物物质，所所需要的的压力在在0.1Mpa以下，，适用于于细菌、、微粒的的过滤，，（2）超超滤法，，也称为为错流过过滤，其其滤膜的的孔径为为0.0015—0.20um之间间，可阻阻留分子子量为3-50万的物物质，所所需要的的压力在在0.1--0.3Mpa，，适用于于大分子子蛋白质质与小分分子有机机物的分分离，（3）纳纳滤法，，其膜孔孔径为纳纳米级细细孔，能能截流的的最小分分子为1nm，，截留分分子量为为200—1000。。所需要要的压力力在1.50Mpa。。可用于于分子量量相差无无几的氨氨基酸之之间的分分离。（二）：层析析技术层析技术用于于目的产品的的高效分离和和纯化。根据层析所使使用的介质不不同，可分为为1：无机基质质分离介质2：有机高分分子基质分离离介质。1：无机基质质分离介质以多孔硅胶、、可控孔径的的玻璃、氧化化锆、氧化铝铝、羟基磷灰灰石为主要载载体所制成的的球形、或者者无定形颗粒粒。

（1））可控孔径的的玻璃的化学学成份中SiO2，其表表面可以通过过涂层来进行行性能上的修修饰。

（2）对于多肽肽药物的纯化化分离，为了了获得较高的的分离效率。。常常选用孔孔径在25nm以上的球球形硅胶介质质。常用的亲亲水凝胶介质质，几乎都是是二醇型化学学键合硅胶。。

（3）羟羟基磷灰石（（HAP）与与生物体有很很好的相容性性，已经用于于蛋白质、柱柱子酸的分离离。球形的羟羟基磷灰石产产品有KOBECERAM、HASI，片形的的羟基磷灰石石产品有中科科院生化所生生产的产品。。羟基磷灰石石（HAP））用于生物制制剂分离纯化化的例子有：：细胞蛋白、、病毒和亚细细胞颗粒、细细菌蛋白、精精蛋白、重组组蛋白、核蛋蛋白、水解酶酶、异构酶、、转移酶、氨氨基酸、多肽肽、多糖。无机基质分离离具体方法（1）离子交交换层析，其其介质有强阳阳、弱阳、弱弱阴、强阴之之分。（2）亲水凝凝胶层析，（3）大孔反反相层析，是是指在无机基基质分离介质质的表面涂有有烷基介质，，其中长链烷烷基介质涂层层适用于分离离小肽，短链链烷基介质涂涂层适用于分分离多肽及蛋蛋白质。（4）疏水作作用层析，用用于分离亲水水性强有蛋白白质，（5）亲和介介质层析，针针对不同的生生物大分子需需要采用不同同的特异性亲亲和介质。2：有机高分分子基质分离离介质常用的有机高高分子基质分分离介质有：：（1）苯乙烯烯—二乙烯苯苯共聚物----属于交交联体性质，，常用的有Mono-Q、Mono-S介质。。（2）N-乙乙烯吡啶共聚聚物，属于亲亲水性凝胶体体性质，常用用的有TSK-gel-DEAE-5PW、TSK-gel-SP-5PW、TSK-gel-CM-5PW。（3）聚甲基基丙烯酸酯介介质。根据层析方法法不同，又可可分为：（1）纸层析析（2）薄层层层析（3）离子交交换层析（4）凝胶分分子筛层析（5）亲和层层析（3）离子交交换层析目前能够在工工业上加以应应用的离子交交换层析设备备有瑞典Pharmacia公司生生产的----BioPilot中中试层析系统统，其进样量量可达10L。全自动BioProcess标准层层析系统，其其流速可达4-20升/小时。A：离子交换换剂B：离子交换换剂的类别C：离子交换换剂的处理A：离子交换换剂的性质离子交换剂是是一种不溶性性的固体物质质，由二部份份组成：（（1）一部份份是不溶性的的骨架，（（2）另一部部份是通过静静电吸引在骨骨架上的离子子。离子部分分可以与溶液液中的同性带带电基团发生生交换。离子交换剂的的骨架由不同同的材料所组组成：

（1）硅酸铝，，

（2）多多糖，

（3）天然的聚聚合物。离子交换剂所所吸附的带电电基团有：（（1）酚基基、羟基、羧羧基、磺酸基基---形成成阳离子交换换剂，

（2）氨基、芳芳香氨基----形成阴阴离子交换剂剂。B：离子交换换剂的类别（1）以聚丙丙乙烯及其衍衍生物为骨架架的离子交换换树脂----如商品树脂Dowex（（美国）、Zerolite（英国国）、Amberlite（美国））、上海树脂脂厂生产的#704、#724、#732、华华北制药厂生生产的101树脂。（2）以纤维维素、或者微微晶纤维素作作为骨架的离离子交换树脂脂---如羧甲基纤维维素（CM-纤维素）、、磷酸基纤维维素（P-纤纤维素）、磺磺乙基纤维素素（SE-纤纤维素）、二二乙氨基纤维维素（DEAE-纤维素素）。（3）以葡聚聚糖凝胶作为为骨架的离子子交换树脂----如DEAE-Sephadex，DEAE-Sephadex-A-25。（4）以聚丙丙烯酰胺作为为骨架的离子子交换树脂----（5）以琼脂脂糖凝胶作为为骨架的离子子交换树脂----如CM-Sepharose-CL-6B，DEAE-Sepharose-CL-6B。。C：离子交换换剂的处理离子交换剂在在使用之前必必须经过前处处理，以除去去杂质、并使使得交换剂充充分溶胀。方方法是先将离离子交换剂在在水中充分浸浸泡1—2天天，或者在沸沸水中煮沸4—5小时，，然后用酸、、碱反复处理理。所用酸碱碱的浓度为0.5mol/L。（（1）阳离子子交换剂经过过碱洗→水洗洗→酸洗→水水洗的处理序序。

（2））阴离子交换换剂经过酸洗洗→水洗→碱碱洗→水洗的的处理序。离子交换剂在在使用时，要要用起始缓冲冲液充分洗涤涤，以达到所所要求的离子子浓度和PH值。

（1）阳离子交交换剂应采用用阴离子型缓缓冲液，如磷磷酸、乙酸、、柠檬酸等等等酸性缓冲液液，

（2））阴离子交换换剂应采用阳阳离子型缓冲冲液，如Tris，胺盐盐、吡啶等等等。（4）凝胶分分子筛层析A：凝胶层析析的骨架介质质B：凝胶层析析介质的主要要产品的品牌牌C：根据不同同洗脱液的凝凝胶层析分类类A：凝胶层析析的骨架介质质（1）天然多多糖类介质（2）纤维素素类介质（3）葡聚糖糖类介质（4）琼脂糖糖类介质（5）合成大大分子类介质质B：凝胶层析析介质的主要要产品的品牌牌以葡聚糖类介介质为骨架的的Sephadex。以以琼脂糖类类介质为骨架架的Sepharose、Bio-GelA。。

以琼脂糖糖+葡聚糖为为骨架的Superdex。

以葡葡聚糖+聚丙丙烯酰胺为骨骨架的Sephacryl。

以琼琼脂糖+聚丙丙烯酰胺为骨骨架的Ultrogel。

以聚羟羟甲基酰胺类类为骨架的Trisacryl。以以聚丙烯酰酰胺为骨架的的Bio-GelP。以以聚苯乙烯烯为骨架的Bio-Beads-S-X。以以聚乙烯醇为为骨架的Toyopearl。C：根据不同同洗脱液的凝凝胶层析分类类（1）水相淋淋洗凝胶过滤滤层析，简称称凝胶过滤。。是指针对水水溶性的生物物大分子，按按照其分子大大小进行分离离的方法。（2）有机溶溶剂淋洗凝胶胶渗透层析，，简称凝胶渗渗透。是指针针对脂溶性的的生物大分子子，按照其分分子大小进行行分离的方法法。（5）亲和层层析亲和层析（AFC）是针针对专一性结结合的生物大大分子所进行行的分离纯化化方法。亲和层析常用用的介质和载载体有：（（1）葡聚糖糖，

（2））琼脂糖，（（3）聚丙丙烯酰胺，（（4）交联联聚苯乙烯，，

（5）交交联聚甲基丙丙烯酸酯，（（6）亲和和性高聚物。。（三）：电泳泳技术1：纸电泳2：醋酸纤纤维膜电泳3：凝胶电电泳----淀粉凝胶电电泳，琼脂糖糖凝胶电泳，，聚丙烯酰胺胺凝胶电泳。。

4：聚焦焦电泳----密度梯度度电泳，等电电点聚焦电泳泳，亲和电泳泳。根据电泳的操操作方式不同同，可将电泳泳分为：1：园盘电泳泳，

2：平平板电泳，3：连续凝凝胶电泳，4：连续流流动电泳。五：灭菌技术术1：干热灭菌菌法

2：湿湿热灭菌法3：紫外线线灭菌法4：过滤灭菌菌法

5：化化学灭菌法六：干燥技术术1：烘干法（（1）喷雾雾干燥

（2）气流干燥燥

（3）沸沸腾干燥（（4）鼓式干干燥2：真空干燥燥法3：冷冻干燥燥法第三节：基因因工程技术基因克隆操作作，就是将外外源性的DNA分子结合合到病毒、质质粒、或者其其它载体系统统这中。组成成新的遗传物物质，然后转转入到宿主细细胞内继续繁繁殖。人们已经成功功地将人或者者动物的某些些基因，如胰胰岛素基因、、生长激素基基因、胸腺激激素基因、干干扰素基因、、乙型肝炎病病毒抗原基因因、口蹄疫病病毒抗原基因因导入到大肠肠杆菌之中。。如将将人人的的生生长长激激素素基基因因导导入入到到大大肠肠杆杆菌菌之之中中，，在在9升升的的细细菌菌培培养养液液中中，，所所能能提提取取出出的的生生长长激激素素产产量量=从从50万万头头羊羊脑脑中中提提取取的的数数量量。。一：：基基因因工工程程的的四四个个技技术术基基础础二：：基基因因工工程程的的步步骤骤基因因重重组组技技术术图图示示一：：基基因因工工程程的的四四个个技技术术基基础础1：：发发现现了了限限制制性性内内切切酶酶----能能够够识识别别DNA分分子子的的某某些些特特异异性性位位置置，，将将DNA双双链链切切成成带带有有粘粘性性末末端端的的片片段段。。2：：发发现现了了DNA连连接接酶酶----能能够够将将断断裂裂的的DNA修修复复，，连连接接成成完完整整的的DNA分分子子。。3：：发发现现了了运运载载外外源源性性目目的的基基因因的的载载体体。。4：：发发现现了了导导入入外外源源基基因因的的手手段段。。二：：基基因因工工程程的的步步骤骤（一一））：：工工程程载载体体的的构构建建----质质粒粒、、科科斯斯质质粒粒、、噬噬菌菌体体λ、、单单链链噬噬菌菌体体M13。。（二二））：：DNA分分子子的的重重组组（三三））：：基基因因的的分分离离（四四））：：重重组组体体的的选选择择和和鉴鉴定定（五五））：：重重组组DNA的的表表达达（一一））：工工程程载载体体的的构构建建1、、基基因因工工程程载载体体的的定定义义2、、基基因因工工程程载载体体有有四四种种质粒粒科斯斯质质粒粒噬菌菌体体λ单链链噬噬菌菌体体M13酵母菌人人工染色色体1、基因因工程载载体的定定义能够克隆隆外源性性DNA，并能能使其在在大肠杆杆菌中繁繁殖的载载体称为为基因工工程载体体。基因工程程载体的的共同特特点是：：

（1）能在在大肠杆杆菌中自自主复制制，接上上外源DNA后后还能够够自我复复制。（（2））很容易易从细菌菌核酸中中分离出出来。2、质粒粒（1）质质粒的特特性（2）常常用的质质粒（3）质质粒pBV220的结结构（4）质质粒的分分离和提提纯（5）质质粒上的的克隆方方法（1）质质粒的特特性质粒是染染色体外外的遗传传物质，，它们是是双链、、闭环的的DNA分子，，质粒的的分子量量较小，，质粒的复复制不依依赖于染染色体DNA，，用氯霉霉素阻止止细胞染染色体DNA的的蛋白质质合成途途径后，，细胞染染色体的的复制也也受到抑抑制，但但是，质质粒仍能能继续复复制。质粒上带带有抗药药性选择择标记。。质粒上带带有几种种限制性性内切酶酶的切断断点位。。外源基因因的插入入不会破破坏质粒粒的复制制特性。。（2）常常用的质质粒pBV220pBR322pBG-2pMK16pCYC184科斯质粒粒噬菌体λλ单链噬菌菌体M13酵母菌人人工染色色体质粒PBR322质粒PGBKT7-53质粒PGEM-3Z质粒PUC18/19科斯质粒粒l噬菌体基因组酵母菌人人工染色色体（3）质质粒pBV220的结结构ori-------复制起起始点clts857-------抑抑制子基基因，在在31℃时，其基基因产物物具有阻阻抑PL的活性，，当温度度升高时时，这种种阻抑活活性就丧丧失，PL就开始指指导合成成mRNA。PR-------启动子子1PL--------启动动子2BglII--------限制制酶切割割位点EcoRI---------限限制酶切切割位点点

SmaI----------限制酶酶切割位位点BamHI--------限制酶酶切割位位点SalI---------限制酶酶切割位位点PstI------------限制酶酶切割位位点HindIII---------限制酶酶切割位位点，以以上切割割位点形形成多克克隆区域域，可在在此插入入外源性性目的基基因。RrnB-----------核糖体体终止基基因（终终止子））

PvuI-----------带有有青霉素素抗性基基因Ampr。（4）质质粒的分分离和提提纯A：质粒粒的分离离和提纯纯的定义义B：质粒粒的分离离和提纯纯的基本本步骤C：质粒粒的分离离和提纯纯的方法法A：质粒的分分离和提提纯的定定义质粒提纯纯就是指指大量的的染色体体DNA中分离离和纯化化质粒DNA。。由于染色色体DNA的分分子量要要比质粒粒DNA大得多多，染色色体DNA提取取后多数数已经断断裂成线线性分子子，而质质粒DNA则呈呈闭环型型，因因此可以以实现分分离和提提纯，B：质粒粒的分离离和提纯纯的基本本步骤细菌培养养和质粒粒扩增收集和裂裂解细菌菌质粒提纯纯C：质粒粒的分离离和提纯纯的方法法（a）差差示离心心沉淀法法（b）DNA变变性处理理法（c）氯氯化铯梯梯度密度度离心法法。（a）差差示离心心沉淀法法染色体DNA多多数是缠缠绕在细细胞溶菌菌物的残残渣之中中，密度度较大，，可以采采用离心心法除去去。（b）DNA变变性处理理法采用热变变性、或或者用温温和的碱碱（PH=12.5））变性，，可以断断开染色色体DNA上的的氢键、、而质粒粒上的共共价键则则不能断断开，当当温度逐逐渐冷却却进行复复性操作作时，染染色体DNA成成线性分分子，而而质粒DNA则则呈闭环环型，可可以实现现分离。。（c）氯氯化铯梯梯度密度度离心法法在DNA中加入入足够数数量的嵌嵌入染料料溴乙锭锭，染色色体DNA分子子结合得得多、相相对密度度较大，，而质粒粒DNA则结合合得很少少、相对对密度较较小，经经过平衡衡等密度度离心之之后，二二类DNA分子子处于不不同的色色带区内内，可实实现分离离。（5）质质粒上的的克隆方方法先将质粒粒DNA用限制制酶切开开，在体体外连接接外源性性DNA，再将将重组后后的工程程质粒转转化到细细胞之中中。质粒粒上的克克隆方法法有3种种：A、插入入失活法法B、定向向克隆法法C、磷酸酸酯酶处处理线型型质粒DNA法法A：插入入失活法法（a）插入失活活蓝白斑斑筛选技技术根据插入入失活原原理，筛筛选重组组子。由由于外源源基因的的插入，，导致LacZ失去活性性，菌落落显白色色，而未未插入重重组子的的菌落显显蓝色。。（b）抗抗药性基基因插入失失活原原理质粒同同时含含有二二个抗抗药性性基因因，一一个为为青霉霉素抗抗性基基因，，另一一个为为四环环素抗抗性基基因。。插入入外源源性DNA会导导致质质粒四四环素素抗性性基因因失活活。先将重重组质质粒转转化到到对青青霉素素敏感感的大大肠杆杆菌之之中，，并在在培养养基中中加入入青霉霉素，，结果果没有有被转转化的的亲本本菌株株死亡亡，存存活的的是转转化菌菌株。。在存活活的转转化菌菌株中中，同同时含含有：：（1）重重组质质粒、、（2）不不含重重组DNA的自自体环环化质质粒。。再将转转化菌菌株接接种到到含四四环素素的培培养基基中----自自体环环化质质粒在在四环环素培培养基基上能能够正正常生生长----重重组质质粒在在四环环素培培养基基上则则不能能生长长（达达不到到预期期目的的）（c））抗药药性基基因插插入失失活的的改进进方法法（由于于最终终需要要的重重组质质粒在在四环环素培培养基基上则则不能能生长长，因因此无无法直直接选选择出出重组组工程程菌））在含四四环素素的培培养基基中再再加入入一种种亲脂脂的螯螯合剂剂萎蔫蔫酸（（5-丁基基吡啶啶-2-甲甲酸、、fusaricacid）或或者喹喹啉-2-羧酸酸。将转化化菌株株接种种到改改良后后的四四环素素的培培养基基上。。凡是是能够够正常常生长长的菌菌株---90%以以上是是重组组工程程菌。。B、定定向克克隆法法将载体体质粒粒pBR322同时时用二二种限限制酶酶BamHI、、HindIII进进行消消化内内切，，形成成二个个不同同粘性性末端端的接接头。。用凝凝胶电电泳法法分离离其中中的大大片段段。将外源源性DNA也用用二种种限制制酶BamHI、HindIII进行行消化化内切切，形形成二二个不不同粘粘性末末端的的接头头。质粒+外源源性DNA----由于于粘性性末端端互补补而形形成连连接。。质粒本本身由由于二二个不不同粘粘性末末端的的接头头不能能互补补，无无法进进行环环化。。结果果所得得到的的DNA都都是重重组型型。C、磷磷酸酯酯酶处处理线线型质质粒DNA法在DNA片片段进进行连连接时时，二二个核核苷酸酸之间间必须须是：：（1）一一个带带有5`-磷酸酸基、、（2）另另一个个带有有3`-羟羟基。。如果果用碱碱性磷磷酸酯酯酶、、或者者用小小牛肠肠道磷磷酸脂脂酶处处理已已经经经过内内切的的质粒粒DNA，，就可可以除除去5`-磷酸酸基。。因此此，在在复性性时就就能阻阻止质质粒DNA的环环化。。而外源源性DNA由于于带有有5`-磷磷酸基基，仍仍然能能够结结合到到质粒粒DNA上上，形形成带带有二二个-OH缺口口的开开环分分子（（内环环一端端HO-OH缺缺口、、外环环另一一端HO-OH缺口口）。。最后后得到到DNA重重组型型。（二））：DNA分子子的重重组1、粘粘性末末端连连接法法2、同同聚物物接尾尾法3、人人工合合成接接头法法4、人人工接接头+平平齐齐末端端的DNA链（三））：基基因的的分离离（1））物理理学密密度梯梯度离离心法法（2））凝胶胶电泳泳分离离技术术（3））互补补DNA分分离法法（c-DNA法））（4））鸟枪枪法（1））物理理学密密度梯梯度离离心法法不同DNA片段段，其其密度度不同同，借借此进进行密密度梯梯度离离心，，实现现分离离。（2））凝胶胶电泳泳分离离技术术通过凝凝胶电电泳，，分段段收集集大小小不同同的DNA片段段，然后用用快速速转化化法来来检验验其目目的蛋蛋白质质，进进行基基因定定位。。实现现分离离。（3））互补补DNA分分离法法（c-DNA法））第一步步、双链cDNA的的制作作第二步步、线线性质质粒DNA的制制作第三步步、双双链cDNA和和线性性质粒粒DNA链链的拼拼接第一步步、双链cDNA的的制作作mRNA↓↓逆逆转录录酶cDNA第一一链互互补链链↓↓碱水水解除除去mRNA模模板cDNA第一一链（（3`-端端带有有发夹夹环））↓↓逆转转录酶酶、或或者用用大肠肠杆菌菌聚合合酶I从从cDNA第一一链3`-端的的发夹夹环开开始合合成cDNA第第二链链↓↓SI核酸酸酶降降解发发夹环环得得到双双链cDNA↓↓双双链链cDNA--（同同聚物物接尾尾法））---加加上人人工接接头CCCCCCmRNA的的分离离Oligo-dT纤纤维素素柱Oligo-dT磁磁珠法法mRNAmRNA-cDNAHybridnick逆转录录酶RNaseHDNA聚合合酶T4连连接酶酶T4DNA聚聚合酶酶处理理形成成平头头末端端NickTranslationcDNA的的合成成方法法之1逆转录录酶末端转转移酶酶dCTPRNAaseHDNA聚合合酶cDNA的的合成成方法法之2第二步步、线线性质质粒DNA的制制作质粒PstI（（双环环型））↓↓限制制酶线线性性质粒粒PstI—DNA链↓↓末末端转转移酶酶在在线性性质粒粒DNA链链上加加上GGGGGGGG第三步步、双双链cDNA和和线性性质粒粒DNA链链的拼拼接双链cDNACCCCCC+线性性质粒粒DNA上上GGGGGGG↓↓退退火、、复性性cDNA——重组组质粒粒↓↓转转化到到细菌菌中进进行大大量扩扩增↓↓特特定的的限制制酶形形成成特定定位点点内切切的双双链cDNA，，带有有粘性性末端端。↓↓进进行行其它它类型型的DNA二次次重组组。（4））鸟枪枪法A：鸟鸟枪法法的具具体步步骤B：鸟鸟枪法法的优优缺点点A：鸟鸟枪法法的具具体步步骤先将供供体细细胞的的染色色体DNA，经经过酶酶处理理、或或者物物理学学方法法切割割成基基因水水平的的很多多片段段。↓↓将将每每一片片段和和载体体进行行重组组。↓↓转转化化到受受体菌菌中进进行基基因增增殖。。↓↓采采用适适当的的筛选选方法法，从从众多多的菌菌落中中选出出带有有目的的基因因的菌菌株。。↓↓从从选择择出的的菌株株中回回收重重组DNAB：鸟枪枪法的的优缺缺点鸟枪法法的优优点----采采用鸟鸟枪射射击去去命中中“预预定目目标””的原原理，，该方方法能能够绕绕过直直接分分离目目的基基因的的难关关。鸟枪法法的难难点----必必须有有一种种有效效的目目的基基因检检测方方法，，常用用mRNA作为为探针针，进进行原原位杂杂交法法检验验。（四））：重重组体体的选选择和和鉴定定（1）遗传学学方法（2）免疫学方法（3）原位杂杂交法（4）原位放放射免疫法（5）聚合酶酶连锁反应（（PCR法））选择克隆株株（6）蛋白质质转译表达法法（1）遗传学学方法类似于细菌抗抗生素抗性培培养试验----如果所需要的的基因为抗药药性基因，就就可以从受体体细胞是否从从对药物敏感感的不抗药状状态转变为抗抗药状态，来来判断它是否否获得了抗药药性基因。（2）免疫学学方法当受体细胞获获得了某一基基因之后，常常常在细胞中中出现由该基基因编码的蛋蛋白质，因此此可以通过免免疫的方法制制备出针对这这种蛋白质的的抗体，然后后将这种抗体体用荧光染料料进行标记。。当用这种荧光光抗体处理细细胞克隆株时时，含有这一一基因的克隆隆株，由于其其蛋白质能与与抗体进行特特异性结合而而显出荧光。。这样就可以以把含有这种种目的基因的的克隆株筛选选出来。（3）原位杂杂交法A：原位杂交交法的定义B：原位杂交法的的步骤A：原位杂交交法的定义使用带P标记记的特异性RNA、DNA，作为探探针，就可以以在原位鉴定定含有这个基基因的菌落或或者噬菌斑，，这种方法称称为原位杂交交法。B：原位杂交法的的步骤将细菌菌落转转移到硝化纤纤维素滤膜上上，

↓用用碱处理滤膜膜上的菌落，，使质粒DNA变性，↓↓

待DNA固定在滤滤膜上之后，，洗去细胞碎碎屑，

↓用用P标记的的RNA探针针、或者DNA探针进行行连接酶反应应。

↓洗洗去多余的P标记的RNA探针↓↓

通过放射射自显影，找找出与探针杂杂交的菌落↓↓

阳性菌菌落中就含有有重组的目的的基因。原位杂杂交的的图示示（4））原位位放射射免疫疫法A：原原位放放射免免疫法法的原原理B：原原位放放射免免疫法法的显显色试试剂C：原原位放放射免免疫法法的步步骤A：原原位放放射免免疫法法的原原理原位杂杂交法法+蛋蛋白质质抗原原抗体体反应应----原位位放射射免疫疫法B：原原位放放射免免疫法法的显显色试试剂碱性磷磷酸酶酶----将无无色的的底物物5-溴-4-氯吲吲哚磷磷酸盐盐（BCIP））转化化为蓝蓝色的的产物物。辣根过过氧化化物酶酶----将3-氨氨基-9-乙基基咔唑唑氧化化成褐褐色产产物或或将4-氯氯萘酚酚氧化化成蓝蓝色产产物。。I125标记的的二抗抗----放射射自显显影检检测。。荧光素素异硫硫氰酸酸盐标标记的的二抗抗----紫外外灯。。金标记记的二二抗----金金颗粒粒包裹裹，可可以表表现红红色。。生物素素结合合的二二抗----与与凝集集素紧紧密结结合，，酶的的显色色反应应进行行检测测。C：原原位放放射免免疫法法的步步骤对于已已知的的基因因产物物（蛋蛋白质质）↓↓提提纯纯，注注射到到家兔兔体内内，制制备免免疫血血清（（抗体体）↓↓提提取取特异异性抗抗体IgG↓↓IgG通过过碘化化作用用，标标记上上I↓↓将将转转化的的细菌菌涂布布于培培养皿皿中↓↓碱碱处处理，，使细细菌裂裂解，，菌落落释放放出抗抗原，，↓↓加加入经经过标标记的的特异异性抗抗体IgG，抗抗原、、抗体体发生生免疫疫反应应。↓↓通通过过放射射自显显影检检测出出来↓↓阳阳性性菌落落中就就含有有重组组的目目的基基因。。（5））聚合合酶连连锁反反应（（PCR法法）选选择克克隆株株样品DNA+复复制所所需要要的引引物核核苷酸酸短链链（大大约2-个个核苷苷酸左左右））+DNA聚合合酶+大量量的三三磷酸酸脱氧氧核苷苷酸dATP、、dTTP、、dGTP、dCTP↓混混合加加热，，使得得DNA双双链分分开（（这一一过程程称为为DNA变变性））↓↓冷冷却，，（DNA复性性），，引物核核苷酸酸短链链分别别附在在2条条单链链DNA的的两端端，聚聚合酶酶就会会从引引物开开始，，沿着着DNA单单链进进行复复制式式的DNA合成成。↓第第二次次混合合加热热，使使得DNA双链链分开开。↓↓第第二二次冷冷却，，合成成第二二批次次的DNA。↓↓如如此此反复复加温温+冷冷却。。可重重复无无数次次。只只要聚聚合酶酶的功功能正正常+有足足够的的三磷酸酸脱氧氧核苷苷酸dATP、、dTTP、、dGTP、dCTP。就就可以以大量量复制制出与与样品品DNA一一样的的DNA分分子。。差异展展示PCR法（（DD-PCR)基本原原理：：将具具有两两组细细胞在在某一一条件件下可可表达达的mRNA群群体体通过过逆转转录方方法变变成相相应的的cDNA群群体，，以此此为模模板，，利用用一对对特殊殊引物物，在在一定定条件件下进进行PCR扩增增，得得到与与mRNA相对对应的的DNA。。通过过变性性聚丙丙烯酰酰胺电电泳，，检测测差异异条带带。（6））蛋白白质转转译表表达法法----cDNA克克隆中中带有有特异异性的的mRNA互补补的顺顺序，，提取取细胞胞mRNA。----用用碱处处理待待筛选选的菌菌落使使细胞胞变性性，DNA固定定在滤滤膜上上。↓mRNA与已已经固固定的的DNA进进行杂杂交，，形成成RNA-DNA复复合体体↓↓提提取RNA-DNA复合合体，，加热热处理理，使使其释释放出出mRNA↓↓将将mRNA进行行转译译：（（1）在在无细细胞蛋蛋白质质合成成系统统中转转译-----兔网网状细细胞溶溶解产产物、、小麦麦胚抽抽提物物（商商品名名BRL、、NEN））（（2））在非非洲爪爪蛙的的卵母母细胞胞中转转译↓↓转转译译产物物进行行蛋白白质属属性鉴鉴定：：采用用方法法：（（1）免免疫沉沉淀法法（（2））SDS-聚丙丙烯酰酰胺凝凝胶电电泳法法。↓↓最最终终定位位出相相应的的重组组工程程菌DNA。（五））：重重组DNA的表表达---真核核基因因在大大肠杆杆菌中中的表表达1、表表达条条件2、表表达细细则3、表表达方方式1、表表达条条件（（1））（1））重组组基因因中必必须具具有一一个能能够被被大肠肠杆菌菌RNA聚聚合酶酶（转转录酶酶）识识别的的启动动子。。大大肠杆杆菌原原核基基因的的起始始密码码子为为AUG。。真真核基基因的的起始始密码码子为为ATG，，ATG不不能被被大肠肠杆菌菌RNA聚聚合酶酶识别别。（2））重组组DNA转转录出出的mRNA，，必须须有一一个核核糖体体结合合位点点，大大肠肠杆菌菌自身身DNA转转录出出的mRNA，，在其其核糖糖体结结合位位点上上有一一个转转译起起始密密码子子（AUG）+SD序序列，，SD序列列与大大肠杆杆菌的的16S-rRNA的3`端端碱基基实现现互补补。（3））真核核基因因重组组到大大肠杆杆菌之之后，，真核核基因因DNA不不能被被细菌菌基因因的内内含子子分割割成二二段，，因为为在大大肠杆杆菌原原核细细胞中中缺乏乏蛋白白质拼拼接系系统。。1、表表达条条件（（2））（4））真核核基因因必须须位于于大肠肠杆菌菌启动动子下下游的的有效效控制制区域域内，，以便便使得得RNA聚聚合酶酶在识识别启启动子子之后后，立立即开开始蛋蛋白质质的转转译。。（5））真核核基因因所产产生的的mRNA必须须相当当稳定定，并并且能能够被被大肠肠杆菌菌的核核糖体体所转转译。。（6））真真核核基基因因所所表表达达出出的的异异种种蛋蛋白白质质，，不不会会被被细细胞胞蛋蛋白白酶酶所所降降解解。。2、、表达达细细则则（1））使使用用强强启启动动子子（2））调调节节适适当当的的表表达达温温度度（3））使使用用表表达达诱诱导导剂剂3、、表表达达方方式式（1））融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式（2））非非融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式（3））分分泌泌蛋蛋白白表表达达方方式式（1））融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式A：：融融合合蛋蛋白白的的定定义义B：：融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式的的优优缺缺点点C：：融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式的的改改进进措措施施D：：融融合合蛋蛋白白的的具具体体表表达达方方式式A：：融融合合蛋蛋白白的的定定义义融合合蛋蛋白白的的氨氨基基酸酸端端由由大大肠肠杆杆菌菌原原核核基基因因编编码码、、而而另另一一端端（（羧羧基基端端））则则由由真真核核基基因因编编码码。。最终终表表达达出出来来的的蛋蛋白白质质=1条条原原核核多多肽肽+1条条真真核核多多肽肽，，因因此此称称为为融融合合蛋蛋白白。。B：：融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式的的优优缺缺点点融合合蛋蛋白白表表达达方方式式的的优优点点----基基因因操操作作简简便便、、蛋蛋白白质质在在细细菌菌体体内内较较为为稳稳定定，，不不会会被被细细菌菌酶酶所所降降解解，，容容易易实实现现高高效效表表达达。。融合合蛋蛋白白表表达达方方式式的的缺缺点点----由由于于融融合合蛋蛋白白中中含含有有原原核核多多肽肽，，带带有有细细菌菌蛋蛋白白质质的的抗抗原原性性，，不不能能直直接接用用作作人人体体注注射射剂剂。。C：：融融合合蛋蛋白白表表达达方方式式的的改改进进措措施施（1））在在体体外外，，采采用用特特异异的的蛋蛋白白酶酶（（凝凝血血因因子子X、、胶胶原原酶酶、、肠肠激激肽肽酶酶））对对融融合合蛋蛋白白进进行行降降解解。。（2））用用化化学学物物质质（（CNBr））进进行行蛋蛋白白质质水水解解，，形形成成原原核核多多肽肽+真真核核蛋蛋白白质质分分子子，，从从而而获获得得具具有有生生物物活活性性的的天天然然真真核核蛋蛋白白质质分分子子。。D：：融融合合蛋蛋白白的的具具体体表表达达方方式式融合合基基因因------融融合合蛋蛋白白基因因结结构构为为““原原核核启启动动子子——原原核核SD序序列列——原原核核结结构构基基因因片片段段——真真核核结结构构基基因因序序列列——原原核核终终止止密密码码子子””关键键：：受体体蛋蛋白白与与外外源源蛋蛋白白的的阅阅读读框框要要对对齐齐两个个蛋蛋白白的的结结合合位位点点的的设设计计很很重重要要，，应应便便于于下下一一步步切切除除受受体体蛋蛋白白的的操操作作。。融合合表表达达载载体体的的构构建建常用用的的受受体体蛋蛋白白（（原原核核细细菌菌表表达达的的蛋蛋白白质质））受体体蛋蛋白白的的切切除除方方法法化学断裂裂法：溴溴化氰（（CNBr）--Met--AA酶促断裂裂法：凝凝血因子子Xa，，有蛋白白酶活性性，识别别序列:Ile－－Glu－Gly－Arg－－AA（2）非非融合蛋蛋白表达达方式A：非融融合蛋白白表达方方式的定定义B：非融融合蛋白白表达方方式的优优缺点C：非融融合蛋白白的具体体表达方方式A：非融融合蛋白白表达方方式的定定义非融合蛋蛋白表达达方式是是指蛋白白质的表表达是以以真核mRNA的起始始密码子子开始，，其结果果使得蛋蛋白质产产物的氨氨基酸端端不带任任何细菌菌性的多多肽序列列。非融合蛋蛋白表达达方式也也称为包涵体型型外源蛋蛋白的表表达。大大肠杆菌菌能积累累某些特特殊生物物大分子子，使之之致密的的聚集在在细胞内内，形成成一种水水不溶性性的结构构。当外外源蛋白白大量表表达时，，这些非非天然的的蛋白质质往往容容易形成成包涵体体。B：非融融合蛋白白表达方方式的优优缺点非融合蛋蛋白表达达方式的的优点----能够产产生天然然的真核核蛋白质质。产物物容易回回收，包包涵体的的密度大大于细胞胞碎片，，破碎细细胞后离离心即可可获得外外源蛋白白。非融合蛋蛋白表达达方式的的缺点----蛋白质质在细菌菌体内容容易被细细菌蛋白白酶所破破坏。产产物丧失失生物活活性，需需要经过过复性，，即使蛋蛋白质重重新折叠叠。C：非融融合蛋白白的具体体表达方方式非融合蛋蛋白表达达方式可可分为2种：（a）非非融合基基因—非非融合蛋蛋白（b）融融合基因因—非融融合蛋白白（a）非非融合基基因—非非融合蛋蛋白基因结构构为“原原核启动动子—原原核SD序列——ATG—真核核结构基基因序列列—原核核终止密密码子””要求1：：SD序序列和ATG之之间的距距离要合合适，相相差2-3个碱碱基，其其表达效效率就大大受影响响。要求2：：ATG和真真核结构构基因序序列之间间必须加加接人工工接头，，以保证证ATG之后的的真核基基因不发发生通读读框架的的改变。。（b）融融合基因因—非融融合蛋白白基因结构构为“原原核启动动子—原原核SD序列——原核ATG——TGATG（真真核基因因起始结结构）—真核结结构基因