分子生物学-分子克隆

分子克隆

（基因工程）周坤houkunfu@前言二十世纪40年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA

50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制深刻意义在于：解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题50年代末和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。

从而阐明了遗传信息的流向和表达问题DNAmRNA蛋白质

转录

翻译tRNA，rRNA

逆转录复制这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础

基因工程的诞生70年代初，DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。1972年，美国学者Berg.P等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。

基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。

基本概念基因工程的核心是重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。所谓克隆（clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。在基因工程中所指的克隆，是指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。基本概念这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecularcloning）。由于研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（genecloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域——生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。细胞克隆技术：在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用的最为充分。哺乳动物的克隆：克隆概念在个体水平上的应用采用了核质分离、细胞融合、体外培养及胚胎移植等技术

主要内容①从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。②在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。④筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。⑤从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之实现功能表达。应用实例重组DNA技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行基因交流。利用大肠杆菌（E.coli)、酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的重组蛋白质。1、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物——人胰岛素上市（1979年美国基因技术公司）牛、猪胰岛素素，免疫反应应化学合成人胰胰岛素基因插入E.coli表达载体中-半乳糖苷苷酶基因后融合蛋白溴化氰水解混合重建2、用酵母细细胞生产乙型型肝炎病毒亚亚单位疫苗包膜蛋白核心蛋白病毒DNA乙肝病毒用基因工程方方法制备乙肝肝表面包膜蛋蛋白为抗原亚亚单位疫苗无无致病力，很很安全、高效效。3、生物钢扫描电子显微微镜下的蜘蛛蛛单丝表面扫描电子显微微镜观察下的的蜘蛛单丝断断面蜘蛛丝被拉断断时显示出的的“皮”结构构，也称"鞘"结结构（箭头头所示部分））蜘蛛丝被拉拉断时显示示出的"芯"结构，也称称"剑"结构（箭头头所示部分分）目前世界范范围内开发发的基因工工程多肽药药物、疫苗苗、抗体有有五百多种种理论意义1、彻底填填平了生物物种属间不不可逾越的的鸿沟2、重组技技术缩短了了进化单位位3、能按人人们的意愿愿定向改造造、培育新新品种4、解决医医学与生物物学上长期期无法解决决的许多重重大（如是是什么基因因、在什么么地方、什什么时间、、起什么作作用？如何何起作用？？）人们预言，，21世纪纪是生命科科学的世纪纪，以基因因工程为主主导的生物物技术可能能对世界的的重大问题题－－饥饿饿、疾病、、能源、污污染等提出出切实的解解决办法，，推动社会会生产力的的飞速发展展。一、分子克克隆中常用用的工具酶酶在重组DNA与基因工程程中，对目目的基因的的分离、剪剪切和重组组涉及到一一系列酶催催化反应，，这些酶就就像外科医医生的手术术刀一样，，是进行基基因工程操操作必不可可少的工具具。常分为为限制性核酸酸内切酶（restrictionendonuclease）、连接酶（ligase）和核酸修饰酶酶（modifyingenzyme）。限制性核酸酸内切酶限制性核酸酸内切酶是是指能识别别DNA的的特殊序列列，并在识识别位点或或其周围切切割双链DNA的一一类酶。它主要来源源于原核生物，可将侵入入宿主细胞胞的外源性性DNA迅迅速降解，，而对细菌菌自身的DNA，则则通过甲基基化酶在该该种限制酶酶切位点甲甲基化修饰饰而保护自自身的DNA不被降降解。限制性内切切酶由于能能限制外源源DNA的的“入侵””而得名。。限制性核酸酸内切酶的的命名命名是根据据含有该酶酶的微生物物种属而定定。通常有有三个斜体字母的缩写表示示。第一个大写写字母取自自细菌属名的第一个字字母；第二、三个个小写字母母取自微生生物种名的头两个字字母；第四四个字母代代表该微生生物同种内内不同的株系；如果同一一株名发现现几种限制制酶，则根根据其被发发现和分离离的先后顺顺序，用罗罗马数字表表示。例如，从大大肠杆菌（（EscherichiaColi）RY13株中发现分分离的第一一种限制酶酶，称为EcoRI。限制酶的分分类及特点点根据限制酶酶的组成、、辅因子及及切割DNA方式不不同，可分分为I、II、III型。重组DNA技术中常常用的是II型限制制性内切酶酶。II型酶酶作用特点点是有严格格的识别、、切割顺序序，以内切切方式水解解双链DNA中的磷酸二酯键键，产生的DNA片段段5‘端为为磷酸基，3’端为为羟基。识别顺序一一般为4－－6个碱基基，通常是是回文结构构（palindrome））。识别序序列的大小小决定其切切割DNA后产生的的片段的长长短。44＝256、46＝＝4096、48＝＝65536II型酶切切割双链DNA产生生3种不同同的切口：：⑴在对称轴轴中心同时时切割双链链，产生平末端或称钝性末端（blintend），如如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3‘3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG……5'⑵在对称轴轴两侧相对对位点分别别切割一条条链。从5'端切切割产生5'端突突出的粘性性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'……GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'⑶从3'端端切割产产生3'端突突出的粘性性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3‘3'…G▲ACGTC……5'3'…GACGTC…5'同工异源酶酶1.定义义：能识别别相同序列列但来源不不同的两种种或多种限限制酶2.特点点：1）识识别相同顺顺序2）切割位位点的异同同KpnIGGTACCSstICCGCGGAsp718GGTACCSacICCGCGG同尾酶有些限制酶酶识别序列列不同，但但产生相同同的粘性末末端，称这这些酶为同同尾酶。如：BamHI(GGATCC)和Sau3AI(NGATCN)由此产生的的DNA片片段可借粘粘性末端相相互连接，，在DNA重组时具具有更大的的灵活性5‘…G▼AATTC…3’5‘…N▼AATTN…3’星号活力EcoRI*

星号活力：：限制性内切切酶在非标标准反应条条件下，能能够切割一一些与其特特异性识别别顺序类似似的序列，，这种现象象称星号活活力。诱发星号活活力常见原原因：1、高甘油油含量（>5%，V/V））2、内切酶酶用量过大大，（>100U/µgDNA）3、低离子子强度：<25mmol/L4、高pH值：pH>85、含有机溶溶剂：二甲甲基亚砜、、乙醇、乙乙烯二乙醇醇等6、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二价阳离离子。。。应用在分子生物物学和基因因工程中具具有举足轻轻重的地位位。其主要要胜用途：：1、改造及及组建质粒粒2、组建基基因组DNA物理图图谱3、基因组组DNA同同源性研究究4、DNA重组克隆隆及亚克隆隆5、、DNA杂杂交交与与序序列列分分析析注意意事事项项酶切切底底物物DNA要要纯纯，，抽抽提提时时酚酚／／氯氯仿仿要要去去除除干干净净。。所加加酶酶量量不不应应超超过过10％％（（RE保保存存在在50％％的的甘甘油油中中－－20度度较较稳稳定定））。。取酶酶时时量量要要准准，，最最后后加加酶酶，，最最好好在在冰冰箱箱里里加加。。酶切切反反应应2小小时时左左右右，，可可延延长长，，节节约约酶酶量量。。两种种酶酶有有相相同同的的缓缓冲冲液液，，可可双双酶酶切切；；不不同同，，先先用用需需低低盐盐缓缓冲冲液液的的限限制制酶酶消消化化，，再再用用需需高高盐盐缓缓冲冲液液的的酶酶消消化化。。DNA连连接接酶酶连接接酶酶可可催催化化DNA分分子子中中相相邻邻5'磷磷酸酸基基和3'羟羟基基末端端之之间间形形成成磷酸酸二二酯酯键键，使使DNA切切口口封封合合或或使使两两个个DNA分分子子或或片片段段连连接接。。常常用用的的有有T4（噬噬菌菌体体））DNA连连接接酶酶和和E.ColiDNA连连接接酶酶。。DNA聚聚合合酶酶重组组DNA技技术术中中，，聚聚合合酶酶（（polymerase））的的最最重重要要作作用用是是以以DNA或或RNA为为模模板板在在体体外外合合成成DNA或或RNA。。可分分为为DNA聚合合酶酶和和RNA聚合合酶酶两两大大类类。。RNA聚合合酶酶以以DNA为模模板板合合成成RNA。常常用用于于离离体体条条件件下下，，合合成成单单链链RNA作为为杂杂交交探探针针。。常用用的的DNA聚聚合合酶酶有有大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I大大片片段段(klenow)以DNA为为模模板板，，催催化化5‘‘→→3’’核核酸酸链链的的延延长长，，另另有有3‘‘→→5’’的的外外切切酶酶活活性性。。常常用用于于DNA3‘‘末末端端的的标标记记和和填填充充；；cDNA第第二二链链的的合合成成，，DNA测测序序。。磷酸酸酶酶牛小小肠肠碱碱性性磷磷酸酸酶酶（（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP）），，催催化化DNA或或RNA的的5'磷磷酸酸基基水水解解。。常用用于于去去除除线线状状载载体体DNA两两端端的的5'磷磷酸酸基基团团，，防防止止载载体体自自身身连连接接环环化化；；也也用用于于用用32P标标记记DNA的的5'末末端端之之前前除除去去原原来来的的5'磷磷酸酸基基。。逆转转录录酶酶以RNA为为模模板板，，合合成成cDNA链链（（5'→→3'）），，另另有有RNA酶酶H活活性性。。常常用用于于cDNA第第一一，，二二链链的的合合成成及及反反转转录录PCR（（RT-PCR））。。名称称功功能能及及应应用用大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I以以DNA为为模板板，，催催化化5’’→→3’’核酸酸链链的的延延长长，，另另有有3’’→→5’’的外外切切酶酶大片片段段（（klenow））活性性。。常常用用于于DNA3’’末末端端的的标标记记和和填填充充、、cDNA第第二二链链的的合合成成、、DNA测测序序。。TaqDNA聚聚合合酶酶以以DNA为模模板板，，催催化化5’’→→3’核酸酸链链的的延延长长，，另另有有弱弱的的5’→→3’的外切酶活性，，耐高温温。常用用于PCR及DNA测测序。末端转移移酶催催化化NTP中的NMP通通过其磷磷酸基与与DNA3’’-OH连接接而使DNA链链延长，无需模板板。常用于于3'端端标记记或形成成DNA共聚尾尾巴。逆转录酶酶以以RNA为模板，，合成cDNA链（5’→→3’）），另有有RNA酶酶H活性。常常用于cDNA第第一、二二链的合合成及反反转录PCR（（RT-PCR）。RNA聚聚合酶以以DNA为模板合合成RNA。常常用于离离体条件件下，合合成单链链RNA作为杂交探针针。二、分子子克隆中中常用的的载体基因工程程载体（（vector）是供供插入目目的基因因并将其其导入宿宿主细胞胞内表达达或复制制的运载工具具。什么样样的载体体才是较较为理想想的呢？？其基本本条件是是：①能自主主复制并并能带动动插入的的目的基基因一起起复制。。②具有适适当的限限制性酶酶切位点点，以便便目的基基因的插插入。③载体分分子大小小合适，，太大不不易复制制；太小小不易容容纳较大大目的基基因。④具有合合适的筛筛选标记记（如抗抗药性基基因，酶酶基因等等），以以便筛选选阳性克克隆。⑤如作为为表达载载体，要要配备适适当的调调控元件件，如启启动子、、增强子子等。载体的分分类一般常用用的载体体按来源源分有质粒（plasmid）、噬菌菌体（phage）和病毒毒（virus）。天然的的质粒、、噬菌体体、病毒毒都需经经过人工工改造才才能成为为合乎要要求的基基因工程程载体。。质粒和噬噬菌体常常用于以以原核细细胞为宿宿主的分分子克隆隆；动物病毒毒常用于于以真核核细胞为为宿主的的分子克克隆。载体按得得到的产产物分类类：克隆载体体（cloningvector）主要用用于DNA大量扩增增，并不不需要得得到目的的基因所所编码的的蛋白质质。表达载体体（expressionvector），使插插入的目目的基因因可转录录、进而而翻译成成多肽链链而设计计的载体体，具有有表达外外源基因因的能力力。质粒载体体染色体质粒质粒是存存在于细细菌染色色体外的的小型环环状双链链DNA分子，，能在宿宿主细胞胞独立自自主地进进行复制，并在细细胞分裂裂时保持持恒定地地传给子子代细胞胞。质粒带有有某些遗传信息息，会赋予予宿主细细胞新的的遗传性性状，如如质粒携携带的氨氨苄青霉霉素抗性性基因使使宿主细细胞对氨氨苄青霉霉素产生生抗性，，从而轻轻易地筛筛选出成成功转化化了质粒粒的细菌菌。载体质粒粒上往往往还引入入了“多克隆位位点（multiplecloningsites）”，，即一段段人工合合成的DNA序序列，上上面含有有密集的的多种限限制性酶酶切位点点，以供供插入外外源基因因片段。。另外，较较好的载载体往往往还引入入多种用用途的辅助序列列，如供蓝蓝白斑筛筛选的LacZ基基因。pBR322质质粒图图谱氨苄青霉霉素抗性性基因四环素抗抗性基因因多克隆位位点pUC质质粒粒图谱突变型lac-E.coli表达β-半乳糖苷苷酶的ω片段。如果插入入的外源源基因是是在lacZ基基因内，，就会影影响lacZ的的表达，，利用lac-E.coli为转染或或感染细细胞，在在含X-gal的培养养基上生生长时会会出现白白色菌落落；若无无外源基基因插入入，则出出现蓝色色菌落。。多克隆位位点编码β-半乳糖苷酶的的α片段α-互补补：（alphacomplementation）pUC质质粒带有有大肠杆杆菌β-半乳糖糖苷酶基基因的一一个片段段LacZ基因，它编码码β-半半乳糖苷苷酶的一一个片段段，而宿宿主细胞胞能编码码与这个个片段互互补的ββ-半乳乳糖苷酶酶的另一一部分，，实现互补，形成完完整的ββ-半乳乳糖苷酶酶，此酶酶能分解解发色底底物X-gal，形成成蓝色菌落落。当外源源基因插插入后，，LacZ基因因被破坏坏，不能能合成完完整的ββ-半乳乳糖苷酶酶，因此此不能分分解底物物X-gal，，菌落成白白色。因此通过过蓝白斑斑筛选可可以筛选选、鉴定定重组体体与非重重组体载载体。噬菌体载载体是一种细细菌病毒毒，可作作为克隆隆载体。。其优点点是可以以在体外外包装产产生感染染性很高高的噬菌菌体颗粒粒。目前使用用的噬菌菌体载体体主要有有λ噬菌体体衍生物物载体、粘粒载体体和单链M13噬菌体载载体等。除M13噬菌体载载体外，，这类载载体的特特点是其其容量比比质粒载载体大，，即可插插入较大大的外源源DNA片段（（如20kb以以上）。。噬菌体体头部尾部尾丝噬菌体感感染细菌菌示意图图M13噬菌体目前常用用的单链链载体是是经改建建的M13mP系列。其其中引入入了lacZ基基因一部部分和多多克隆位位点，因因此也可可用蓝白白斑筛选选重组DNA。。M13噬菌体基基因组是是单链环环状DNA，当当它侵犯犯宿主菌菌后，在在细菌胞胞内酶的的作用下下，单链链DNA转变成成复制型型双链DNA，，可提取出出来做基基因重组组。双链DNA在大大肠杆菌菌中复制制100-200拷贝贝后，M13的合成转转变成不不对称地地合成双双链中的的一条，，产生大大量单链链DNA，并包包装成成成熟的噬噬菌体颗颗粒，透透出菌壁壁，释放放到培养养基中。。因此可可以从大大肠杆菌菌培养基基中分离离单链DNA。M13噬菌体的的最大特特点就是是能产生生单链DNA，，这是独独一无二二的。因此从培培养基上上收获到到的含目目的基因因的M13单链DNA可直直接作为为模板进进行双脱脱氧链终终止法测序和寡核苷酸酸定点突变。λ噬菌体（lambdlabacteriophage）λ噬菌体是是一种大肠肠杆菌病毒毒，为线性性双链DNA，它的的两端各有有12个碱碱基的互补补粘性末端端，称COS位点。。当噬菌体体侵入宿主主细胞，两两个粘性末末端互补结结合，形成成环状分子子。λ噬菌体侵侵入细菌后后，即可裂解生长（环状DNA在细菌菌中多次复复制，合成成大量噬菌菌体基因产产物，装配配成噬菌体体颗粒，裂裂解宿主菌菌），又可可以溶源生长（λ噬菌体体DNA整整合到细胞胞染色体基基因组DNA中，与与染色体DNA一起起复制，并并遗传给子子代细胞，，宿主细胞胞不被裂解解）。λ噬菌体基基因组中功功能相关基基因集中分分布。包装限制性性。重组子子大小在75％－105％，，可被包装装成为成熟熟颗粒。λDNA在在体外可包包装成病毒毒颗粒（将将重组DNA包装进进入头部或或尾部蛋白白中），并并高效感染染大肠杆菌菌。粘粒载体（cosmidvector，又称称柯斯质粒粒载体）粘粒载体由由质粒DNA和λ噬菌体DNA两部分组成成。粘粒具有质质粒的特性性，在宿主主细胞中能能自主复制制，有克隆隆位点，也也有抗药性性基因。同时粘粒又又具有λ噬噬菌体的特特性。在λλDNA中中主要是λλDNA的的粘性末端端COS位位点及其与与包装有关关的短片段段。能按λλ噬菌体DNA分子子的同样方方式环化起起来，克隆隆外源DNA后，经经体外包装装能高效进进入大肠杆杆菌细胞。。粘粒的一大大特点是能能容纳长达达35－45kb的的大片段外源源DNA，因此常用用作大片段段外源DNA的克隆隆。外源基因插插入到两个个线状粘粒粒之间λ噬菌体的的A蛋白切切下COS位点以外外部分，中中间部分包包装到外壳壳蛋白中，，组成成熟熟的噬菌体体颗粒。重组子与λ噬菌体DNA体外外包装系混混合真核细胞用用载体真核细胞用用作克隆基基因的表达达具有很多多优点，如如它能识别别和剪切外外源基因中中的内含子子并加工成成成熟的mRNA，，对表达的的蛋白质进进行翻译后后加工和修修饰（如糖糖基化）等等，这些都都是原核细细胞办不到到的。目前所用的的真核载体体大多是所所谓穿梭载体（shuttlevector），，它既含有有原核细胞胞的复制原原件，又含含有真核细细胞的复制制原件，因因此它既可可以在原核核细胞中复复制扩增，，也可以在在真核细胞胞中扩增、、表达。由由于在原核核体系中基基因工程的的重组、扩扩增、测序序等易于进进行，所以以利用穿梭梭载体，首首先把要表表达的基因因装配好后后再转到真真核细胞中中表达，这这为真核细细胞基因工工程操作提提供了很大大的方便。。真核细胞载载体又可分分为哺乳动物细细胞载体，酵母细胞载载体和昆虫细胞载载体。哺乳动物物细胞载体体通常是用用能在真核核细胞中复复制的DNA或RNA病毒来来构建，如如腺病毒载载体、逆转转录病毒载载体等。人工染色体体前面我们提提到过用粘粘粒载体可可以克隆长长达35－－45kb的外源基基因片段，，但是还有有许多基因因过于庞大大，不能作作为单一片片段克隆于于这些载体体中。人类基因组组、水稻基基因组工程程的工作需需要能容纳纳更长DNA片段的的载体，这这就使人们们组建了一一系列人工工染色体来来满足克隆隆更长外源源DNA片片段的需要要。如酵母人工染染色体（yeastartificialchromosome，，YAC）），这是由由酵母染色色体基因组组的基本功功能单位和和pBR322构成成的，能自自我复制的的线性克隆隆载体。另另外还有细菌人工染染色体（bacterialartificialchromosome，，BAC）），以及还还在研究之之中的哺乳动物人人工染色体体（mammalianartificialchromosome，，MAC））。三、目的基基因的分离离与合成目的基因（targetgene）又称外源基因，即我们所所要研究的的感兴趣的的基因。从从生物材料料中制备出出包含有目目的基因在在内的DNA片段，往往往是分子克克隆最重要要的一步。。限制性内切切酶直接分分离获得直接分离法法用于一些些物理图谱谱（物理图图谱是指标标明限制性性核酸内切切酶在DNA分子上上的限制位位点数目、、限制片段段大小及其其排列顺序序的图谱））已确立，，背景资料料比较清楚楚的原核生物基基因的制备。从原核生物物中提取纯纯化DNA后，根据据它的限制制酶物理图图谱进行基基因定位，，用适当的的限制性内内切酶将巨巨大的基因因组DNA分子切成成多数片段段，然后进进行分子克克隆。从基因组文文库中筛选选分离组织或或细胞染色体DNA，利用限制制性内切酶酶将染色体体DNA切切割成基因因水平的许多片段，其中即含含有我们感感兴趣的基基因片段。。将这些片段段随机地同适合的克隆载体拼接成重组组DNA分分子，继而而转入受体体菌扩增，，使每个细细菌内都携携带一种重重组DNA分子的多多个拷贝。。不同细菌所所包含的重重组DNA分子内可可能存在不不同的染色色体片段，，这样生长长的全部细菌所携带的各各种染色体体片段就代代表了整个个基因组DNA的所所有序列。。与一般图书书馆不同的的是：基因因组DNA文库没有有图书目录录，建立基基因组文库库后，需结结合适当筛选方法从众多转化化子菌落中中选出含有有某一基因因的菌落，，再进行扩扩增，将重重组DNA分离、回回收，以获获得目的基基因。结合适当筛选方法从众多转化化子菌落中中选出含有有某一基因因的菌落，，再进行扩扩增，将重重组DNA分离、回回收，以获获得目的基基因。存在于转化化细菌内，，由克隆载载体所携带带的所有基基因组DNA的集合合称基因组DNA文库（genomicDNAlibrary））。如人的的基因组文文库包括了了单倍体23条染色色体中所有有的DNA。基因组组DNA文文库就像图图书馆库存存万卷书一一样，涵盖盖了基因组组全部基因因信息，也也包括我们们感兴趣的的基因。逆转录制备备cDNA或从cDNA文库库中筛选尽管同一生生物体中不不同组织细细胞的基因因组是相同同的，但各各种类型细细胞之间以以及同一细细胞在不同同的发育时时期所表达达的基因是是各不相同同的。大多数基因因都会在相相应的细胞胞中特异性性地转录，，如网织红红细胞阶段段，有丰富富的珠蛋白白mRNA。因此由由这些高丰丰度mRNA经过逆逆转录得到到与mRNA互补的的cDNA（complementaryDNA，cDNA）），可直接接进行克隆隆。对于低丰富富mRNA的cDNA克隆，通常常是建成cDNA文库（cDNAlibrary）。即把细细胞总mRNA通过逆转录录合成总cDNA，再与适当当载体连接接后转入受受体菌，从从而得到含含有某种生生物体全部cDNA集合。它的特点是是它只包括括已经被转转录成mRNA的那些基因因序列，且且不包括内内含子及调调控序列，，所以cDNA文库的复杂性要比比基因组文文库低的多多。但由于不同同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的的特定状态态是由特定基基因的表达达所决定的的，因此各各自的mRNA种类就不同同，由此产产生的cDNA又是独特的。与基因组DNA文库类似，，由总mRNA制作的cDNA文库包含了了细胞表达达的各种mRNA信息，自然然也含有我我们感兴趣趣的编码cDNA。然后用适适当的方法法从cDNA文库中筛选选出目的cDNA。cDNA文库cDNA文文库构建过过程化学合成法法如果已知某某种基因的的核苷酸序列列，或根据某某种基因产产物的氨基酸序列列推导出编码码该多肽链链的核苷酸酸序列，再再利用DNA合成成仪通过化学合合成原理合合成目的基基因。利用该法合合成的基因因有：人生生长激素释释放抑制因因子、胰岛岛素原、脑脑啡肽及干干扰素基因因等。聚合酶链反反应聚合酶链反反应（polymerasechainreaction，PCR）是一一种体外快快速的特定定DNA片片段扩增技技术。PCR技术。。可以从一一个细胞、、一滴血液液、一根毛毛发中，经经过30次次左右的循循环扩增，，使目的基基因扩增上上百万倍。。应用时，，常常在在目的基因5'端和和3'端端分别设计计引物，，引物中中又分别别引入合合适的限限制性内内切酶切切位点，，以带有有目的基因因的载体体或细胞胞基因组组DNA为模板板扩增，限制性性内切酶酶酶切后后，PCR产物物两端易易形成粘粘性末端端而利于于进一步步克隆。。逆转录──PCR（reversetranscriptionPCR，RT─PCR））技术，，使得人人们可以以从mRNA入入手，通通过逆转转录得到到cDNA，，在适当当引物存存在下，，经PCR扩增增目的基基因。所所得到的的目的基基因无内内含子、、无调控控序列，，而获得得连续编编码的序序列。以上几种种获取目目的基因因的方法法多用与与编码序序列已知知的基因因，目前前人体已已知基因因只有1／10左右，，所以获获取大量量未知基基因则更更为诱人人和富于于挑战性性，所涉涉及的方方法更多多，如基基因芯片片技术、、酵母双双杂交技技术以及及噬菌体体、细菌菌展示技技术等等等，这些些都有待待我们去去进一步步学习和和研究。。四、DNA分子子的体外外连接通过不同同途径获获取含目目的基因因的外源源DNA，选择择或改建建适当的的克隆载载体后，，下一步步工作是是如何将将外源DNA与与载体DNA连连接在一一起，即即DNA的体外外重组。。这种人工工DNA重组是是靠DNA连连接酶催化两个个双链DNA片片段相邻邻的5'端磷磷酸与3'端端羟基之之间形成成磷酸二二酯键。。通常所所用的连连接酶是是T4噬菌体DNA连连接酶和大肠杆菌菌DNA连接酶酶。质粒载体体外源DNA抗生素抗性基因因EcoRI含重组质质粒的克克隆转化进抗抗生素敏敏感的受受体细胞胞涂布含抗抗生素的的琼脂平平板连接EcoRI外源DNA含抗生素素的琼脂脂平板粘性末端端连接碱性磷酸酸酶处理理载体分分子后连连接如果是构构建表达达型重组组体，因因为启动动子启动动转录以以及转录录后翻译译阅读都都是有方方向的，，因此插插入的目目的基因因也应注注意方向向。一般般采用两种限制制酶消化，由由于粘性性末端不不同，载载体分子子和外源源DNA片段只只能按一一种方向向形成重重组分子子，实现现定向克隆隆定向克隆隆连接效果果与载体体和目的片段段质量有有关3：110µl连接反应应一般约4-5小时，，室温，，20度度左右平端连接接因载体分分子和目目的DNA分子子之间并并不一定定都产生生互补的的粘性末末端，有有的限制制性内切切酶只能能切成平平端。有有时所需需用的两两种限制制性内切切酶切割割后形成成非互补补的粘性性末端，，此时需需设法使使之变成成平端，，如用S1核酸酶消消化或用用Klenow片段和和dNTP补平平3‘端端，成成为平末末端。平末端仍仍用T4DNA连连接酶连连接，只只是效率率低，需需要的DNA浓浓度更高高。人工接头头连接连接子（（linker）是指指人工合合成的一一段双链寡核核苷酸，其中包包含一个个（或两两个）酶切位点点。首先将将接头与与目的DNA片片段进行行平末端端连接，，继而用用适当的的内切酶酶将接头头部位切切出粘性性末端，，最后与与载体进进行粘性性末端连连接。加插头连连接插头（adaptor，又叫叫适配子）与接头头的区别别在于其其一侧末末端是一一个粘性性末端（（内含限限制性内内切酶位位点），，而另一一侧为平平末端，，也可以以是粘末末端。将将其与目目的DNA片段段进行平平端或粘粘端连接接后，即即可直接接与载体体连接。。通过PCR获得得粘末端端PCR技技术的出出现大大大方便了了基因的的克隆。。在进行行PCR时，可可根据载载体上的的克隆位位点设计计PCR引物，，使引物上带有与与载体克克隆位点点相匹配配的限制性内内切酶识识别序列列，通过PCR或或RT──PCR直接产产生可用用于重组组的外源源基因片片段。T-A克克隆TaqDNA聚合酶扩增增目的DNA同时，在其其末端加两个个游离的“A”只要载体切口口处人工加上上游离的“T”，PCR产物即可与与载体连接。。五、重组DNA导入受体体细胞目的基因与载载体在体外重重组后应导入入受体细胞中中才能扩增并并进一步筛选选。转化（transformation））将质粒或以以它为载体构构建的重组分分子导入受体体细胞的过程程。感染（infection））以噬菌体粘粘性质粒和真真核病毒作载载体构建的重重组分子，在在体外经过包包装成具有感感染能力的病病毒或嗜菌体体颗粒，感染染适当细胞并并在细胞内扩扩增的过程。。还有一个易混混淆的名称是是转导（transduction），它它是指细菌基基因被一个噬噬菌体从一个个细菌转移到到另一个细菌菌的过程。转染（transfection）是是由转化和感感染两个词构构成的新词，，指真核细胞胞主动摄取或或被动导入外外源DNA片片段而获得新新的表型的过过程。基因工程中的的受体细胞又又叫宿主细胞胞，分为两类类：原核细胞（如大肠杆菌菌、枯草杆菌菌等）和真核细胞（如酵母细胞胞、哺乳动物物细胞及昆虫虫细胞等）。。1、容易接纳纳重组分子。。2、对载体的的复制扩增无无严格限制。。3、不存在特特异的内切酶酶降解外源DNA。4、不对外源源DNA进行行修饰。5、还需根据选用的载载体及其所具具备的筛选标标记。如质粒pBR322用氨苄青霉素素抗性基因（（Ampr）和四环素抗抗性基因（Tetr）作筛选标记记，受体细胞胞则用对Amp和Tet敏感的大肠杆杆菌HB101细胞。将外源DNA导入靶细胞胞的方法很多多，应根据实实验目的、受受体细胞种类类、外源基因因大小等不同同来选择。导入方法大致致分为三类⑴化学方法：：如CaCl2转化法、磷酸酸钙共沉淀法法。在磷酸钙钙DNA共沉沉淀方法中将将被转化的DNA同正在在溶液中形成成的磷酸钙微微粒共沉淀后后，通过内吞吞作用进入受受体细胞。另另外还有DEAE─葡聚聚糖转化法等等。⑵物理方法：：如电脉冲介导导法、显微注注射法、基因因发射枪一类类的颗粒轰击击技术等。在在转基因动物物实验中，对对体积较大的的受精卵细胞胞或胚胎干细细胞，可将目目的基因重组组体通过微吸吸管直接注射射入细胞核，，即显微注射射法，此法需需要精密仪器器及高超技术术。⑶生物方法：：包括原生质融融合法、脂质质体介导法，，以及λ噬菌菌体的体外包包装感染法和和逆转录病毒毒和DNA病病毒介导的转转染法。其中中重组逆转录录病毒和重组组DNA病毒毒（如腺病毒毒）转染受体体细胞目前常常应用于遗传传疾病或肿瘤瘤的基因治疗疗中。基因片段（特特别是纯化的的DNA）很很难直接导入入受体细胞，，通常将受体体细胞预先加加以处理，使使其提高基因因导入细胞的的效率。例如如用低温CaCl2（冰浴）处理理大肠杆菌，，可以大大提提高质粒的转转化效率。这这种经过预处处理的、容易易导入外源核核酸分子的受受体细胞被称称作“感受态态细胞”（competentcell）。。感受态细胞Ca2+诱导的完整细细胞的转化（（大肠杆菌，，革兰氏阳性性）1970年建立了此此技术，其原原理是与细菌菌外膜磷脂在在低温下形成成液晶结构，，并发生收缩缩作用，使细细胞出现空隙隙，细菌这时时的状态就是是感受态。六、阳性克隆隆的筛选与鉴鉴定通过转化、感感染、转染等等方式，重组组体DNA分分子被导入受受体细胞，经经适当涂布的的培养基培养养得到大量转化子菌落或或转染噬菌斑斑。因为每一重组组体只携带某某一段外源基基因，而转化化或转染时每每一受体菌又又只能接受一一个重组体分分子，所以设设法将众多的的转化菌落或或噬菌斑区分分开来，并鉴定哪一菌落落或噬菌斑所所含的重组DNA分子确确实带有目的的基因，即可得到目目的基因的克克隆，这一过过程即为筛选（screening）。根据载体体系系、宿主细胞胞特性及外源源基因在受体体细胞表达情情况不同，可可采取不同的的筛选方法。。遗传表型改变变筛选法如果克隆载体体携带有某种种抗药性标志志基因，如Ampr或Tetr，转化后只有有含这种抗药基基因的转化子子细菌才能在含该抗生素的培培养板上生存并形成成菌落，这样样就可将转化化菌与非转化化菌区别开来来。如果重组DNA时将外源源基因插入标标志基因内，，如插入Tetr内，使标志基基因Tetr失活，阳性重重组子则不能能在含有Tet的培养板板上生长。用用插入失活筛选的重组子子载体往往带带有另一个抗抗生素抗性基基因如Ampr，因此可以通通过双抗生素对照照筛选，即阳性转化化子可以在含含Amp的培培养板上生长长而不能在含含Tet的培培养板上生长长。显色反应------蓝蓝白斑实验当然，非目的的基因插入的的载体或自身身环化的载体体导入的受体体菌也能在含含抗生素的培培养板上生长长，造成假阳性克隆，因此抗菌标标志筛选只能能是初筛（噬噬菌体载体转转化菌形成的的噬菌斑也可可以进行初筛筛），还需要要进一步确定定重组体是否否含有目的基基因。双抗生素对照照筛选电泳筛选法直接提取重组组DNA进行行核酸凝胶电电泳。DNA的电泳迁移移率与其分子子量的大小成成反比。因此此那些带有外外源DNA的的重组体分子子量大于空载载体DNA，，在凝胶中““跑得慢”。另外用不同的的限制性内切切酶切割重组组DNA，分分析酶切图谱，也可进一步步验证阳性克克隆。分子杂交法筛筛选核酸分子杂交交广泛应用于于鉴别阳性重组组体、筛选基因、确定DNA同源性、研研究基因定位位等，是现代代分子生物学学和基因工程程中最基本、、最重要的技技术之一。主要方式是将将待杂交的核核酸分子固定定在适当的支支持物上，用用放射性标记记或生物素等等非放射性标标记的探针与被固定的分子子杂交，以检测目的的DNA或RNA分子存存在与否及其其位置等。将转化后得到到的菌落或噬噬菌斑原位转转移到硝酸纤纤维素滤膜（（nitrocellulosefiltermembrane，NC膜）上，得到到一个与平板板菌落或噬菌菌斑分布完全全一致的复制制品。原位裂解细胞胞，碱变性，，核酸分子被被固定于膜上上。然后加入标记记的DNA或RNA探