生物药物分析

第八章抗生素类药物的剖析一、效价的测定方法：1、稀释法：原理：用液体培育基逐级将抗生素稀释，在各管中加入等量的试验菌液，进行培育，察看克制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，进而求得被测抗生素的效价。X=(T/S)*C

X样品效价(U/ml)

T

检品液最大稀释倍数S标准品液最大稀释倍数

C标准品液效价

(U/ml)检测终点判断

1、试验菌生长完整克制3、指示剂变色4

2、生长50%克制、电位差的改变5、菌种的溶血现象等2、比浊法原理：将必定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培育基内，混匀后，经短期培育（约3-4h），丈量培育基浊度，其浊度与细菌数、细菌集体质量存在直接关系，在必定的范围内切合比耳定律。影响要素物理要素:1、散射现象2、菌液浓度：3、细菌体大小的变化培育基：成分、酸度、培育温度、通气等条件影响。金黄色葡萄球菌，pH在。培育：温度、振摇。3、琼脂扩散法即管碟法原理：抗生素在涂布特定菌的琼脂培育基内扩散，形成必定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，经过透明培育基察看抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。在相同条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反响(抑菌圈)进行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液．对必定试验菌所得的剂量反响曲线，在必定剂量范围内应相互平行。依据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。进而能够较为正确地测定供试品的效价公式里各字母意义要记下。影响抑菌圈半径的要素：r29.21DT(logMlogC4DTH)（1）D的影响要素：抗生素自己构造、分子量等杂质：琼脂含量：菌种抗衡生素的吸附作用：pH影响分子的形式、温度影响扩散D增大，r也增大2）T的影响：一般T增添，r增大。3）M的影响：在必定的范围内，小管内M越大，抑菌圈直径越大。4）C的影响：C越小，抑菌圈直径越大5）H的影响：培育基增厚，则抑菌圈减小。操作步骤：1、试验菌的纯化与悬液的制备、缓冲液、灭菌水与培育基的制备、标准品、供试品的称量、溶解与稀释、双碟的制备及放管、滴加药液、恒温培育、丈量抑菌圈直径或面积、计算二、靠谱性测试:经过统计各组均数间的方差，以试品间、回归、剂间（列）、碟间（行）的方差与偏差项（S2）的比值（称F值），来确立各自差别的显着性程度和实验结果的靠谱性。F值（F值=该项方差/偏差项S2）可作为察看实验显着性程度的一个指标试品间差别不显着（P>）回归项特别显着（P<）偏离平行不显着（P>）剂间差别显着（P<）碟间差别不显着（P>）三、链霉素呈色反响:1、茚三酮反响：蓝紫色化合物2、坂口反响（sagaguchitest)：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，8-羟喹啉分别与次溴酸钠反响，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。3、糖类反响：莫利西反响(Molischtest)，五碳糖或六碳糖在硫酸存在的条件下脱水成羟甲基糠醛，与蒽酮显蓝色，与α-奈酚呈红紫色。4、埃尔松-摩根（Elson-Morgantest)

：样品在强酸或强碱水解后开释出氨基己糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液（Ehrlich试剂）成红色，在540nm处可定量测定。5、麦芽酚反响(maltoltest)：链霉素在碱性溶液中水解，重排，生成麦芽酚在酸性溶液中与三价铁离子联合，形成紫红色络合物。四、四环素类抗生素（认识）（一）呈色反响1、浓硫酸反响四环素深紫色；金霉素蓝色至绿色；土霉素朱红色；强力霉素黄色；、三氯化铁反响：含有酚羟基，遇三氯化铁立刻呈色反响，（二）荧光反响:土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光（三）紫外光谱（四）色谱五、大环内酯抗生素（认识）(一）呈色反响、硫酸反响：遇硫酸均呈红棕色、莫利西反响：糖类的反响3、Seliwanaff反响：脱水

间苯二酚糖红霉素

淡黄色；

糖醛衍生物螺旋霉素

亮紫红色；

具颜色产物碳霉素深青紫色；柱晶白霉素淡青色；（二）薄层色谱(三)光谱学鉴识紫外光谱红外光谱六、利福霉素类抗生素（认识）呈色反响：、浓盐酸反响：、三氯化铁：向1ml利福霉素的溶液中，滴加三氯化铁乙醇溶液，有绿色，蓝绿色。表示有酚羟基、硝酸盐反响：利福平，溶液中加入硝酸钠溶液，颜色由橙色变为暗红色。七、杂质检查1、青霉素过敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白(青霉噻唑基团)凝胶过滤法分别，用Penamaldate法测定HgCl2青霉噻唑衍生物Penamaldate衍生物（285nm）2、链霉素毒性杂质:链霉胍,链胍双氢链糖;双氢链霉素;链霉素醛基化合物;神经毒性：二链霉胺二链霉胺含量测定原理:二链霉胺等不被KBH4复原，能与盐酸氨基脲反响，生成的缩氨脲在233nm有汲取峰3、四环素杂质：脱水四环素、差向四环素、差向脱水四环素(HPLC测定)4、土霉素杂质：脱水土霉素、差向土霉素、α-阿扑土霉素、β-阿扑土霉素等降解产物.(薄层分别，荧光测定)第九章维生素及辅酶类药物剖析一、维生素C类的剖析1、性质酸性：烯二醇构造—酸性。一元酸.能与NaHCO3作用生成钠盐C3-OH，pKa=(共轭效应)C2-OH，pKa=(邻位羰基)复原性：烯二醇基—复原性。与硝酸银反响可生成金属银黑色积淀与2，6-二氯吲哚酚反响（2，6-二氯靛酚）荧光反响：糖的性质:VC的构造很象糖构造，拥有糖的性质。可在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水等反响，转变为糠醛，再与吡咯在50℃反响生成蓝色，用于鉴识反响2、鉴识：复原性：维生素C分子中的二个烯醇基拥有强复原性能够被氧化为二酮基利用糖类的性质可在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水等反响，转变为糠醛，再与吡咯在50℃反响生成蓝色。紫外分光光度法:依据维生素C在盐酸液（L）中，243nm有最大汲取3、含量测定碘量法：维生素C因为分子中的烯二醇基拥有复原性,能被I2氧化成二酮基.1mol维生素C与1molI2定量反响.终点颜色：无色→蓝色。反响条件：酸性使VC在空气中氧化速度减慢。溶剂新沸放冷的水。减少水中溶解氧的影响要清除亚硫酸的影响则在滴定前加入丙酮或甲醛。2)2,6-二氯靛酚滴定法原理：在酸性下，维生素C氧化型是红色的;复原型是无色的.酸性下直接用2,6-二氯靛酚滴定，用滴定剂自己的颜色变化指示终点，不需要此外的指示剂。与1，10-菲洛啉-铁（III）试剂的比色法鉴于维生素C将Fe(Ⅲ)复原生成Fe(Ⅱ),Fe(Ⅱ)与菲洛啉形成桔红色络合物，在510nm有最大汲取。紫外分光光度法二、维生素E的剖析合成型为dl-α-生育酚醋酸酯天然型为d-α-生育酚醋酸酯检查：天然维生素E采纳硫酸铈滴定法检查游离生育酚。游离生育拥有复原性，可被硫酸铈定量氧化取本品，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈滴定L)滴定（黄色），耗费硫酸铈滴定液L)不得过。每1ml硫酸铈滴定液L)相当于的游离生育酚，维生素E中所含的游离生育酚的限量相当于不得过％。三、辅酶Q10的剖析1、鉴识依据氧化型和复原型颜色不一样来鉴识氧化型辅酶Q10复原型辅酶Q10（黄色）（无色）氧化型辅酶Q10可将复原型亚甲蓝（无色）氧化而显蓝紫外汲取光谱，275nm第十章核苷酸类药物剖析一、嘌呤类核苷酸药物剖析1、鉴识定糖法地衣酚orcinol反响：核酸与浓盐酸共热时，可形成糠醛(绿色670nm)二苯胺反响：脱氧核糖核酸经酸水解后得脱氧核糖（蓝色595nm）间苯三酚反响：此中的核糖在水溶液中加间苯三酚，水浴，显玫瑰红色第十三章酶类药物的剖析一、酶活力测定方法固准时间法在适合的条件下，使酶和底物共同保温一准时间，测定产物生成的量或底物耗费的量，计算出酶的含量（或活力）。[E]表示酶浓度，[P]为反响产物浓度，t表示酶作用时间，K为常数。连续监测法在酶反响过程中，连续记录不一样时间的底物耗费量或产物生成量。（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法复原型辅酶（NADH和NADPH）在340nm处有紫外汲取，氧化型辅酶（NAD+和NADP+）在340nm处无紫外汲取.利用340nm处每分钟汲取度高升或降低的速率与酶活性成正比的关系，计算出酶的活力单位。包含：直接测定法:大部分需NADH（NADPH）参加的脱氢酶，可利用紫外分光光度法直接测定反响系统在340nm处汲取度的变化，计算酶活力单位。丙酮酸＋NADH＋H+乳酸＋NAD+340nm处汲取度降低的速率与NADH的氧化速率成正比，与LDH的活力成正比。偶联法:此类酶催化反响不需NAD+或NADP+，但当与需NAD+或NADP+的脱氢酶反响偶联此后，能用紫外分光光度法测定.由脱氢酶惹起的反响为指示反响，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力起码大100倍。比如：谷草转氨酶的测定：三联酶活测定:引入一个协助酶反响，将被测酶反响系统与指示酶反响系统联系起来，构成一个“三合一”酶反应系统，使底物转变率、协助酶反响和NADH（NADPH）氧化速率之间成正比函数关系，协助酶和指示酶的活力一定大大超出测定酶活力。比如：磷酸肌酸+ADP肌酸＋ATP(1)葡萄糖＋ATPG-6-P＋ADP(2)G-6-P+NADP+葡萄糖酸-6-磷酸＋NADPH＋H+(3)被测反响，(2)协助反响，HK（己糖激酶）协助酶，指示反响，G-6-PDH（6—磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。（二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法固定浓度法依据酶催化反响，使反响产物达到额定的浓度时其反响时间与酶浓度成反比的原理进行设计的.[P]=K[E]t以所需时间的倒数（1/t）对酶浓度作图即可制备标准曲线。优点：1、记录时间。2、正确二、酶活性测定方法的设计一、正交设计——多要素选择正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是一种高效的利用正交表来安排多要素多水平设计试验的方法。经过奇妙的安排和分组，用较少的试验次数，就能剖析各要素的作用大小，找出最正确的试验条件。利用各要素所对应指标的极差R及均匀极差D作出判断。正交试验精选中性蛋白酶活力测定条件:中性蛋白酶是一种蛋白水解酶，活力测定以酪蛋白为底物，水解产物与福林试剂在碱性状况下反响生成有色物质，于680nm处测定汲取值。中性蛋白酶作用受缓冲液的pH值、底物浓度、反响时间及酶浓度等要素的影响。供试品：%的中性蛋白酶溶液。底物：酪蛋白实验方案实验取四个要素：PH值、底物浓度、反响时间、酶浓度。每个要素选三水平，属于多要素多水平，为此采纳L9（34）正交表进行实验。正交试验表实验号ABCD正交实验安排表缓冲液pH底物浓度反响时间酶浓度1111121222313334212352231各要素试验值计算结果均匀极差越大，对应的要素影响越大。缓冲液PH值，底物浓度%，酶浓度用100U/ml为最正确反响条件。反响时间为10，20，30min，对OD值无显着影响。各要素试验值的方差剖析结论：PH值（A）、底物浓度（B）、酶浓度（D）为特别显着因子；反响时间（C）为非显着因子。三、酶类药物的检测肽键水解酶胰蛋白酶:由动物胰脏中提取的一种蛋白水解酶。原理:胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基构成的肽键、酰胺键及酯键，水解速度为酯键>酰胺键>肽键。BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)苯甲酰－L－精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，酯键被水解生成苯甲酰L－精氨酸，在253nm波优点的汲取度随酶促反响递加，所以连续记录不一样时间的产物生产量，依据活力单位定义计算酶活力。测定法：取呈直线的汲取度，按下式计算：P为每mg供试品含胰蛋白酶的单位，U；A1为直线上停止的汲取度；A2为直线上开始的汲取度；T为A1至A2读数的时间，min；W为测定液中供试品的量，mg；汲取度每分钟改变，即相当于1个胰蛋白酶单位。弹性蛋白酶测定原理:刚果红－弹性蛋白法：以刚果红——弹性蛋白为底物，因为刚果红——弹性蛋白联合的共价键能被弹性酶水解，依据刚果红在495nm处有最大汲取，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。单位：20分钟水解1mg刚果红－弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。方法:尿激酶效价测定原理(气泡上涨法):尿激酶激活人体内纤维蛋白溶酶原使其转变为纤维蛋白溶酶；纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变为纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过度的状况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。操作(气泡上涨法)试管中加纤维蛋白原溶液（37℃水浴）标准品(或供试品)加混淆溶液立刻摇匀计时，反响系统应在30～45秒内凝固，当凝块内吝啬泡上涨到系统体积一半时作为反响终点。以尿激酶的浓度为横坐标，以反响时间的对数为纵坐标。b2.脂键水解酶－胰脂肪酶(PancreaticLipase)原理:胰脂肪酶是一种水解酶，在必定条件下把甘油三脂类脂肪水解，最后生成甘油及脂肪酸。底物:橄榄油用已知浓度的标准碱溶液滴定，可定量地测定脂肪酸的量，进而得悉脂肪酶活力。测定步骤:计算:每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸的酶量，为1个活力单位。每克含有的胰脂肪酶单位供试品耗费NaOH（L）的体积空白耗费NaOH（L）的体积W:供试品取样量（g）供试品稀释倍数。糖苷键水解酶－溶菌酶效价测定－比浊法:以溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重复而成。只好水解NAMC1和NAGC4之间的β－1，4糖苷键。溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，致使溶菌，溶液的汲取度降落。在必定的条件下，每分钟汲取度降落为一个酶活力单位。计算：酶活力单位（u/mg）=W为测试液中供试品的重量（μg）测定溶菌酶活性-比色法:用染料艳红K－2BP标志的为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）反响后离心除掉未分解底物，上清液比色，汲取度为溶菌酶活力的函数。超氧化物歧化酶效价测定:SOD测定方法：间接法：使用氧自由基指示消除剂，SOD与指示消除剂竞争O2-，进而克制指示消除剂与O2-的联合，依据指示消除剂与O2-反响速度的变化可间接测定SOD的活性。包含：黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法和邻苯三酚法。黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法:原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生O2-，氧化型细胞色素C被O2-复原为复原型细胞色素C，后者在550nm有最大汲取，所以测定氧化性细胞色素C在加入SOD前后的光汲取变化可间接计算酶活性。方法:注意点:在特定条件下，25℃（）每分钟克制细胞色素C复原速率达50％所需要的酶量为一个活力单位。重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，所以反响系统中一定增添EDTA。反响系统中含过氧化氢酶可惹起复原型细胞色素C发生过氧化作用，进而扰乱检测的正确。邻苯三酚法:原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红酚，同时生成O2-，当有SOD存在时因为它能催化O2-与H+联合生成O2和H2O2，进而阻挡了中间产物的累积。定义:在必定条件下，每分钟克制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为一个酶活力单位。操作:定义:在必定条件下，每分钟克制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为一个酶活力单位。门冬酰胺酶原理：测定步骤:在上述规定条件下，每分钟催化L-门冬酰胺水解开释1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位.比活力测定方法：采纳Lowry法测定蛋白质含量，比活力=酶活力(U)/蛋白含量(mg)。天冬氨酸酶活力的测定一个酶活力单位定义为在测定条件下，每小时每克细胞转变生成1μmol天冬氨酸所需的酶量.第十四章多糖类药物剖析一、多糖的分子量测定1、凝胶色谱法：将分子量不一样的蛋白质经过必定孔径的凝胶固定相，因为各组分流经体积的差别，使不一样分子量的组分得以分别。最初淋出的是最大的分子。Kd=0，Ve=V0；Kd=1，Ve=V0+Vi；0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi2、粘度法3、超离心法4、高效液相色谱色谱条件：凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。标准曲线：标准曲线：LogMW=a+btRMW为重均分子量，tR为保存时间待测多糖分子量（GPC专用软件）重均分子量Mw=∑(RIiMi)/∑RIiMi为供试品在保存时间ti时的分子量，RIi在第i部分中被洗脱物质的量（重量）。二、多糖的含量测定1、比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）硫酸咔唑法:己糖醛酸测定在浓硫酸中，己糖醛酸与咔唑溶液反响生成的反响物呈红色。520nm比色乙酰丙酮法：氨基己糖氨基己糖在碱性条件下加热，可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，该衍生物与对－二甲氨基苯甲醛反响，反响物呈红色，于525nm测定汲取度。硫酸苯酚法：测定糖含量（总糖）原理：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，该单糖在强酸性条件下，与苯酚反响生成橙色衍生物。在490nm处有最大汲取，其吸光度与浓度呈线性关系。蒽酮法:测定糖含量（总糖）原理：多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生产糠醛类衍生物，与蒽酮作用形成蓝色化合物，620nm进行比