生物化学-电泳课件

电泳

Electrophoresis

一、定义

电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。三、电泳分析技术的分类

1.根据被分离样品的量多少分析电泳制备电泳2.根据电泳电压的高低常压电泳0～500V

高压电泳500～3000V3.根据电泳中是否使用支持物自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳—使用支持物(1)按支持物的物理性状不同，可分为①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳

(2)按支持物的装置形式不同，可分为①平板式电泳②

垂直板式电泳③垂直柱式电泳4.根据电泳系统pH是否连续连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳

不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如PAGE、IFE

优点是在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高.电泳技术应用基础理论研究;临床诊断;工业制造.以蛋白质分子为例:

F=EQ

（Q：有效电荷，E：电位梯度）

F’=6rv（F’：摩擦阻力，v：在介质粘度η中半径为r的颗粒的移动速度）F=F’EQ=6rv

EQv=————6r

迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。

VQM==E6r

2.离子强度（I）溶液的I越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。

I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢3.缓冲液的pHpH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。5.分子筛在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。5.温度电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）醋酸纤维薄膜电泳

Celluloseacetatemembraneelectrophoresis，CAME

二、特点1.吸附作用小2.电渗作用小3.需加样量少4.吸水性差

血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点蛋白组分

相对分子重量

等电点Alb12

6624813000020000013000001500000

4.865.025.025.126.8～7.3

丽春红S染色扫描法结果

蛋白组分

g/L

占蛋白百分数（%）

Alb

35～5257～681

1.0～4.01.0～5.72

4.0～8.04.9～11.2

5.0～10.07.0～13

6.0～13.09.8～18.2氨基黑10B染色洗脱法结果

蛋白组分

平均值

参考范围

Alb1265.593.126.169.0917.4057.45～71.731.76～4.484.04～8.286.79～11.3911.85～22.97几种疾病的蛋白电泳变化

病名

Alb

1

2

肾病肝硬化原发性肝癌多发性骨髓瘤慢性炎症无丙种球蛋白症双白蛋白血症↓↓↓↓↓↓↓

↑↓AFP

↑↑↑↓

↑

↑-桥

↑

↓↑↑↑↑↑↑↓↓

三、影响醋纤电泳结果的因素

1.

电泳图谱不齐①

点样时血清点加不均匀②

薄膜局部干燥③

电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少④

缓冲液变质⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行2.电泳图谱分离不清①

标本加量过多②

电流过低③

薄膜结构过分致密，透水性差④

薄膜表面干燥3.

电泳速度慢①电流过低②供给薄膜的液量不足③电泳时温度过低④缓冲液离子强度过高⑤薄膜中杂质多4.

白蛋白区带中间部分不着色，染色不足可能为染料使用过久或加血清过多5.γ球蛋白向反方向移动主要因为电渗现象可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

[原理]CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等点电不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后,CAM经染色和漂洗，可清晰呈现5条区带。再经脱色，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。—+白蛋白α1α2βγ加样[器材和试剂]1.器材（1）醋酸纤维薄膜（8×2mm）（2）点样器（3）染色皿，漂洗器，镊子（4）722型分光光度计（5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽2.试剂（1）巴比妥缓冲液（pH8.6I=0.06）（2）氨基黑10B染色液（3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O（4）洗脱液：0.4mol/LNaOH[操作]1.将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上。2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润。3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。4．用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。5．电泳（1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。（2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启电源通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。6.染色电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5~10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。7．漂洗从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰可见5条色带，待干。8.定量（1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。（2）计算

吸光度总和（T）=A+α1+α2+β+γ（吸光度）

血清蛋白组分的相对百分数：A%=A/T×100%α1%=α1