重组葡激酶和尿激酶在治疗实验性视网膜中央动脉阻塞中的比较解析

重组葡激酶和尿激酶在治疗实验性视网

膜中央动脉阻塞中的比较【摘要】目的观察重组葡激酶(recombinantstaphylokinase，r-Sak)治疗实验性视网膜中央动脉阻塞(centralretinalarteryocclusion，CRAO)的效果及其对全身的影响。方法15只猫(30只眼)静脉注射光化学药物3%孟加拉红后，用氩绿激光照射视网膜动脉形成阻塞模型，静脉给予r-Sak和尿激酶(urokinase，UK)溶栓，通过荧光素眼底血管造影判断动脉再通情况，同时作血液生化指标的检查。结果成功地建立了CRAO模型，实验用药给药4h后，r-Sak组CRAO的完全再通率为100%，而UK组的完全再通率仅为60%。使用r-Sak后血液中凝血、纤溶、抗纤溶指标与空白对照组比较均差异无显著意义。结论光化学法可建立和临床相似的CRAO模型，R-Sak是一种高效安全、特异性强的溶栓药，在临床治疗CRAO上有较好的应用前景。【关键词】视网膜动脉闭塞/治疗；尿激酶/治疗作用；磷酸转移酶类/治疗作用；光化学疗法中分类号：R774.1R770.5文献标识码：A文章编号：1005-1015(2000)02-0114-04Comparisonofrecombinantstaphylokinaseandurokinaseinthe

treatmentofexperimentalocclusionofthecentralretinal

arteryYAOYong，ZHOUYunqiu，CAIJiping.(DepartmentofOphthalmology，ChangzhengHospital，SecondMilitary

MedicalUniversity，Shanghai200003，China)[Abstract]ObjectiveToinspecttheeffectsofrecombinantstaphylokinase(r-Sak)andthechangesoffibrinolyticactivityinthesystemiccirculationinthetreatmentofexperimentalcentralretinalarteryocclusion(CRAO).MethodsTheanimalmodelofCRAOin15cats(30eyes)wassetupbylaserirradiatingabranchofcentralretinalarteryafterintravenousinjectionof3%rosebengal，andthenthearterialthrombiweredissolvedbyintravenousinjectionofr-Sakandurokinase(UK).ThepatencyofthearterieswasevaluatedbyFFA.Moreover，thechangesoffibrinoliticactivityinthebloodwereexaminedbyphlebotomizing.ResultsThemodelofCRAOwassuccessfullysetup.Fourhoursafterinjectionofthrombolysisdrugs,thecompletelyreopenedproportioninr-Sakgroupwas100%,whileinUKgrouptheproportionwas60%.Atthesametime,nosignificantsystemicfibinnolyticactivationwasobservedinr-Sakgroup.ConclusionsAnexperimentalCRAOmodel,whichhasthesimilarpathologicalprocessesofocclusionofcentralretinalarteryandintraarterialthrombosisasthoseinclinic,canbesetupbyusingphotochemicalmethod,andr-Sakiscapableoflysingthrombuswithoutsignificantactivationofcirculatingplasminogen.【Keywords]Retinalarteryocculusion/therapy;Urokinase/therapeuticuse;Phosphotransferases/therapeticuse；Photochemotheraph基因重组技术生产的重组葡激酶（r-Sak）是一种血栓特异性溶栓药，近年来在动物实验和临床实验研究中均取得了良好的疗效。为了寻求视网膜中央动脉阻塞（CRAO）的有效治疗方法，我们采用光化学法建立家猫实验性CRAO模型，选用r-Sak为溶栓治疗药物，尿激酶（UK）为对照药物，同时设立空白对照组，在比较疗效的同时观察药物对循环系统的影响，为CRAO临床治疗提供动物实验资料，现报告如下。1材料和方法1.1实验动物成年雄性家猫15只30只眼，体重2.5〜3.5kg，随机分为3组，即r-Sak组，UK组及NS组（空白对照组），每组5只10只眼。1.2模型建立实验猫腹腔内注入3%戊巴比妥溶液（30mg/kg）麻醉，切开股静脉，插入套管针并接上三通管，建立通畅的静脉通道。用5%新福林、双星明眼液散瞳。用三面镜检查眼底，找出1支和伴行静脉有一定距离的动脉，激光（氩绿，波长514nm，美国HGM公司）设置在能量100〜150mW，光斑直径50um，时间0.2s，光凝点选在动脉稍离开视盘处。股静脉内注入3%孟加拉红（rosebengal，上海第二试剂公司生产，自行配制）溶液40mg/kg体重，4s后以激光照射所选动脉，平均照射10点。最初见动脉收缩，血流变慢至可见单个红细胞通过光照变窄处，随后血流停止，血栓形成。此时见阻塞处远端的动脉变细，颜色变淡，未见视网膜出血。激光照射后1h行荧光素眼底血管造影（fundusfluoresceinangiography，FFA）检查（2.5%荧光素钠，0.15ml/kg）。1.3溶栓药物治疗模型建立后1.5h，分别自股静脉内注入r-Sak（上海医科大学分子遗传研究室，0.25mg/kg）、UK（上海生化制约厂，2.5万U/kg）溶液（均溶于20ml等渗盐液中）及等渗盐液，首次给予用药量的一半10ml（冲击剂量），在5min内注完。剩余的10ml每隔5min注入2ml，在25min内缓慢注入。用药后4h重复FFA检查，观察血管的再通情况。用药后血管再通情况根据FFA检查结果评价，并以计分方式分为：0分为不通，1分为部分再通，2分为再通。负责FFA检查并对再通情况进行评分者不知道所查动物的用药情况，以保证检查结果的客观公正。于用药前30min，给药后30、60、90min分4次抽血查血浆凝血酶原时间(prothrombintime，PT)、纤维蛋白原含量(fibrinogen，Fg)、纤溶酶原含量(plasminogenPlg)、a-抗纤溶酶(a-plasmininhibitor,a2-PI)、纤维蛋白降解产物D-二聚体测定(D-Dimer)2,另取少量血查凝血时间(coagulationtime,CT)。1.4制作病理标本随机选择2例已建立模型并经FFA造影显示有CRAO的动物，空气栓塞法处死，摘出眼球，以3%戊二醛和2%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，甲苯胺蓝染色。1.5统计学处理用参照单位分析(Ridit分析)法、四格表资料的确切概率计算法及t检验对数据作统计学处理。2结果2.1模型建立情况病理切片光镜检查可见视网膜动脉内血栓，其主要成分为纤维素，网络有白细胞、红细胞和血小板。血管壁基本完整，未见明显的坏死变薄。模型建立后的FFA检查证实有分支阻塞存在。2.2溶栓结果用药后4hFFA检查结果Ridit分析法各取R值的95%可信区间分别为：NS组：0.6750〜1.0124；UK组：0.3263〜0.6187；r-Sak组：0.1438〜0.3112。用药组与空白对照组(NS组)的95%可信区间均无重叠，差异有显著意义。r-Sak组与UK组的95%可信区间无重叠，差异有显著意义(表1)。表1猫CRAO溶栓实验结果Tab.1TheresultoflysingthrombusinexperimentalCRAOAnimalgroupsEyenumberscore.Completelyreopenedrate(%)TotalnumberCompletelyreopenedPartlyreopenedunopenedNSgroup1001910UKgroup106221460r-Sakgroup10100020100.0:unopened1:partlyreopened2:completelyreopened2.3血液生化指标测定结果用药前后血液生化指标测定：凝血时间(CT)(表2)；凝血酶原时间(PT)测定(表3)；纤维蛋白原(Fg)含量测定(表4)；纤溶酶原(Plg)活性测定(表5)；a2-抗纤溶酶('-Pl)活性测定(表6)；D-Dimer测定(表7)。3讨论CRAO模型的建立方法，常用的有激光光凝法⑴、外侧开眶眼动脉钳夹法、插管注入栓塞物法⑵、玻璃体内注入内皮素-1法⑶等。它们或者对视网膜和血管壁有严重的热损伤口,4］，或者形成的机制和临床不相似［2,3］，不适合作溶栓治疗模型。本实验采用的光化学法，是在静脉内注入光化学药物孟加拉红，此药为光敏药物⑸，在血管内可大量吸收激光能量，激发血液中的氧转变为氧自由基，氧化破坏血管内皮细胞和血小板膜，从而启动凝血系统。同时损坏的血小板可释放一系列促凝血因子并为凝血提供磷脂表面，因而可大大加速血栓的形成。此法所用激光能量小，对血管壁的直接损伤较小⑸，形成的血栓和机体内的血栓形成类似，为临床研究CRAO的治疗提供了较好的动物实验模型。表2猫溶栓实验过程中CT测定Tab.2ThedetectionofCTintheexperimentallysingthrombusofa

catmodelAnimalgroupsAnimalnumberCT(s)Preadministration30minpostadministration60minpostadministration90minpostadministrationNSgroup515.2+0.3614.9+0.7015.0+0.6515.0+0.63UKgroup515.2±0.85P>0.0517.0+1.570.05>P>0.0117.4+1.050.05>P>0.0124.8+1.04PV0.001r-Sakgroup515.4+0.42P>0.0515.7+1.22P>0.0514.5+0.70P>0.0515.9+1.22P>0.05表3猫溶栓实验过程中血浆PT测定Tab.3ThedetectionofplasmaPTintheexperimentallysing

thrombusofacatmodelAnimalgroupsAnimalnumberPlasmaPTratio?Preadministration30minpostadministration60minpostadministration90minpostadministrationNSgroup50.985+0.0460.978+0.0330.972+0.0290.978+0.040UKgroup50.972+0.074P>0.051.032+0.022PV0.011.067+0.062PV0.0051.304+0.095PV0.001r-Sakgroup51.005+0.028P>0.050.992+0.033P>0.050.988+0.038P>0.051.014+0.079P>0.05.PlasmaPTratio=PTofdetectedplasma/PTofnormalplasma表4猫溶栓实验过程中血浆Fg含量测定Tab.4ThedetectionofplasmaFgintheexperimentallysing

thrombusofacatmodelAnimalgroupAnimalnumberFg(mg/100ml)Preadministration30minpostadministration60minpostadministration90minpostadministrationNSgroup5168.3+3.2167.6+5.8170.2+7.1167.8+8.2UKgroup5168.8+10.7P>0.05105.4+16.6PV0.00189.9+18.1?PV0.00174.7+15.9?PV0.001r-Sakgroup5169.2+2.7P>0.05166.8+3.4P>0.05162.6+5.40.05>P>0.01158.8+3.20.05>P>0.01.ComparewithbothNSgroupandr-Sakgroup表5猫溶栓实验过程中血浆Plg活性Tab.5ThedetectionofplasmaPlgintheexperimentallysing

thrombusofacatmoldelPlg(%).AnimalgroupAnimalnumberPreadministration30minpostadministration60minpostadministration90minpostadministrationNSgroup5102.6+2.3100.8+2.7101.3+3.2104.6+2.7UKgroup5105.2+3.6P>0.0568.2+9.9PV0.00121.2+7.3PV0.00120.4+5.0PV0.001r-Sakgroup5102.4+4.2P>0.05101.4+5.4P>0.0599.9+8.2P>0.05102.1+3.9P>0.05.Plgcontent(%)=Plgcontentofdetectedplasma/PlycontentofnormalplasmaX100%表6猫溶栓实验过程中血浆a2-PI活性测定Tab.6Thedetectionofplasmaa-PIintheexperimentallysing

thrombusofacatmodelAnimalgroupAnimalnumbera-PI(%)Preadministration30minpostadministration60minpostadministration90minpostadministrationNSgroup5252.4+27.6241.6+23.7246.0+12.8247.2+14.5UKgroup5245.8+24.1P>0.0577.8+16.6PV0.00163.0+10.3?PV0.00152.8+8.7?PV0.001r-Sakgroup5245.1+28.7P>0.05227.8+16.3P>0.05226.2+14.70.05>P>0.01229.7+12.00.05>P>0.01.ComparewithbothNSgroupandr-Sakgroup表7给药后60min猫血浆D-Dimer测定Tab.7ThedetectionofplasmaD-Dimer60minafter

administrationAnimalgroupsAnimalnumberPositivenumberPositiverateNSgroup500%UKgroup55100%r-Sakgroup55100%r-Sak是近年来基因工程的产物E7】，它在体内与纤溶酶原（Plg）相互作用形成1：1的无活性的复合体Plg.Sak［8】，再在一种限速步骤中产生活性Pli（纤溶酶）.Sak，此步骤被Plg激活剂（如Pli.Sak本身）加速，并被Pli抑制剂（如a-抗纤溶酶）延迟。在体内a-PI通过与此复合体中Plg部分的赖氨酸结合位点结合而很快抑制Pli.Sak复合体［9,10】，纤维蛋白通过竞争此赖氨酸结合位点而降低a-PI引起的抑制率，在纤维蛋白表面抑制率可降低到1/100以下⑼，使Plg优先在纤维蛋白凝块上激活。近年来国外在急性心肌梗塞的实验治疗中已证实重组葡激酶是一种高效、特异性的溶栓药，其疗效和选择性均高于rt-PA（组织型纤溶酶原激活物）［11，12】。溶栓治疗的目的是尽快溶解阻塞视网膜动脉内的血栓，使视网膜恢复血供。由于临床治疗CRA0时间的紧迫性［13】，因此需要使用的溶栓药既有较高的溶栓效力，又有较好的安全性，能大剂量重复使用。但目前常用的溶栓药在溶栓的同时也降解血液中的凝血因子，可导致玻璃体和全身重要脏器出血等严重并发症。从表1可以看出，用药组的血管再通情况与阴性对照组比较，差异有显著意义（R的95%可信区间无重叠）。r-Sak组和UK组比较差异亦有显著意义（EB：的95%可信区间无重叠）说明r-Sak、UK的溶栓疗效均较确切，r-Sak的溶栓效力优于UK。本实验设定的几组生化检查指标中，CT、PT和Fg含量是反映凝血系统改变的指标，分别反应内源性、外源性凝血系统和凝血共同途径。Plg用来检查纤溶系统的变化，a2-PI则是用于反映纤溶抑制的指标，全身性纤溶激活必然有Plg活性的降低，同时也会伴有a-PI活性的下降。D-Dimer由于是血栓基质-纤维蛋白降解的特异指标，故可结2合FFA用作血栓溶解的疗效评判。实验中，UK引起了CT和PT的明显延长及Fg含量大幅度下降。说明UK引起了循环中多种凝血因子的降解，涉及到内源性、外源性及凝血共同途径。同时，此组早期即出现了Plg活性和a-PI活性的明显下降，说明用药后有全身性纤溶激活，这与CT、PT的延长及Fg含量的下降相吻合。而在r-Sak组，各个时相的CT、PT、Plg活性等指标均没有明显的改变，用药后60min时Fg含量及a-PI活性虽有下降，但幅度不大，和UK组比较差异有非常显著意义。说明r-Sak有较好的纤维蛋白选择性（特异性），使用较为安全。本实验成功地建立了与临床CRAO的形成机制相似的猫CRAO模型，为今后研究CRAO的治疗提供了便利条件。实验结果表明r-Sak是一种高效安全、特异性强的溶栓药，在治疗临床CRAO上有较好的潜在应用前景。（本文编辑：韦纯义）作者单位：姚勇（200003上海，第二军医大学附属长征医院眼科）周韵秋（200003上海，第二军医大学附属长征医院眼科）蔡季平（200003上海，第二军医大学附属长征医院眼科）姚勇（硕士研究生，现在无锡市解放军101中心医院眼科）参考文献1，VineAK，MaguirePT，MortonyiC，etal.Recombinanttissueplasminogenactivatortolyseexperimentallyinducedretinalarterialthrombi[J].AmJOphthalmol，1988，105:266-268.2，ScheurerG，PraetoriusG，DamerauB，etal.Vascularocclusionoftheretina:anexperimentalmodel.l.Leukocyteaggregates[Z].Graefe?sArchClinExpOpthalmol，1992，230:275-280.3，TakeiK，SatoT，NonoyamaT，etal.Anewmodeloftransientcompleteobstructionofretinalvesselsinducedbyendothelin-1injectionintotheposteriorvitreousbodyinrabbits[J].Graefe?sArchClinExpOphthalmol，1993，231:476-481.4，VineAK，MaguirePT，MortonyiC，etal.Recombinanttissueplasminogenactivatortolyseexperimentallyinducedretinalarterialthrombi[J].AmJOphthalmol,1988,105:266-268.孙兴怀，主编.临床眼科诊治进展[M].上海：上海科学技术出版社，1996.332-333.ScholttB,HartmannM,GuhrsKH,etal.Highyieldproductionandpurificationofreco