何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件

第四章基因工程的主要技术与原理周毅峰2013.03第四章基因工程的主要技术与原理周毅峰核酸的提取与纯化核酸电泳分子杂交PCR技术DNA序列分析大分子相互作用核酸的提取与纯化核酸电泳分子杂交PCR技术DNA序列分析大分1、核酸的提取与纯化破碎细胞或包膜－内容物释放材料准备核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中1、核酸的提取与纯化破碎细胞或包膜－内容物释放材料准备核酸分20－60bp1.1、基因组DNA的提取与纯化DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂DNA钠盐比游离态更易溶于水DNP在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的1%DNP在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的2倍20－60bp1.1、基因组DNA的提取与纯化DNA溶于水，生物材料的准备新鲜，或者冻存的样品液氮中研磨加缓冲液EDTA螯合Mg2+、Ca2+SDS变性蛋白质β-巯基乙醇、DTT打开二硫键和抗氧化PVP与酚和多糖结合及抗氧化裂解细胞除杂加CTAB或SDS结合多糖和蛋白加酚仿去蛋白纯化与保存加乙醇或异丙醇沉淀加乙醇反洗涤吹干水或TE溶解－20℃保存生物材料的准备新鲜，或者冻存的样品液氮中研磨加缓冲液EDTA基因组DNA的提取酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀基因组DNA的提取酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试剂盒细胞基因组DNA试剂盒血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试

CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解SDS法流程图

（以动物组织为例）

动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶

利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离、纯化蛋白质的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分离、纯化多糖的去除：核酸分离、纯化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合核酸分离、纯化盐离子的去除：70％的乙醇洗涤多酚的去除：核酸分离、纯化盐离子的去除：CTAB溶液配制好备用，65℃水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化65℃水浴一个小时氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉等体积预冷的异丙醇，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次。用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存猕猴桃DNA提取实例

CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入CTAB溶液配制好备用，65℃水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取猕猴桃基因组DNA猕猴桃基因组DNA闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；原理1.2、碱裂解法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；原理1.2、染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时,生成不溶的PDS，这些复合物从溶液中沉淀下来。变性染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。碱裂解法利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差所用的试剂作用①葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。②EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。③NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。所用的试剂作用①葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DN冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的K+置换Na+，生成不溶的PDS用于沉淀DNA。⑤乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。④KAc-HAc缓冲液⑥RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。高浓度的K+置换Na+，⑦TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑧酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。⑦TE缓冲液DNA保存液。Tris-HCl维持溶液中pH值碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”悬浮菌体。第一步：悬浮菌体25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA沉淀。SolutionIII的配制：5M乙酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融基因细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低基核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猴桃大提，10000转20min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解基因组DNA的提取质粒DNA的提取核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因对策DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质重新纯化DNA，去除蛋白、材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题问题二：DNA降解。对策

原因材料不新鲜或反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少。对策

原因实验材料不佳或量少尽量选用新鲜（幼嫩）的材料DNA提取常见问1.2、RNA的提取与纯化细胞RNA的含量 每个细胞的RNA量约为10-5μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…1.2、RNA的提取与纯化细胞RNA的含量 每个细胞的RNA液氮中研磨加蛋白变性剂去除DNA和蛋白提供超低温抵制酶活性异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠使蛋白和核酸分离异硫氰酸胍、β-巯基乙醇抑制RNase活性LiCl2沉淀RNA酚仿或水饱和酚抽提DNA和蛋白，将RNA留水相中乙醇洗涤杂质，乙醇或异丙醇沉淀RNA纯化和沉淀RNA液氮中研磨加蛋白变性剂去除DNA和蛋白提供超低温抵制酶活性异异硫氰酸胍/苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。异硫氰酸胍/苯酚法原理：步骤:材料准备：尽量新鲜。器具准备：0.1%DEPC处理24小时，灭菌；裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。步骤:影响RNA提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存影响RNA提取的因素材料：样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量样品破碎及裂解：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素纯化：影响RNA提取的因素1.3核酸的纯度与浓度鉴定紫外分光光度法核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。各种碱基的紫外吸收光谱可通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯

判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0纯DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染纯RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染1.3核酸的纯度与浓度鉴定紫外分光光度法核酸分子中的碱基具DNA或RNA的定量，OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。直接测定核酸浓度DNA或RNA的定量，OD260=1.0相当于50μg/ml荧光光度法核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）荧光光度法核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的DNA的完整性测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。RNA的完整性测定：完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。DNA的完整性测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核1、短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。1.4、核酸的保存①DNA的储存1、短期贮存：1.4、核酸的保存①DNA的储存RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃保存。注意避免Rnase的污染；分装，避免反复冻融；如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin，保存时间可延长。②RNA的储存RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃2、核酸电泳DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。2、核酸电泳DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及2.1、琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型β-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿α-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间适用于DNA大片段的分离。2.1、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的2.2、DNA电泳影响因素DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。DNA分子构型对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同2.2、DNA电泳影响因素DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液琼脂糖/％标准高强度低熔点低粘度低熔点0.30.5700bp～25kb0.8500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb1.0250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb1.2150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb1.580bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb2.0100bp~3kb100bp~3kb3.0500bp~1kb500bp~1kb4.0100bp~500bp6.010bp～100bp不同类型琼脂糖分离DNA片段大小范围不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶）琼脂糖/％标准高强度低熔点低粘度低熔点0.30.5700bp电场强度电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。溴化乙锭（EB）电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。电泳时所加的浓度：临界点的游离EB质量浓度为0.1mg/ml~0.5mg/ml电场强度溴化乙锭（EB）EB代替品EB代替品何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE电泳缓冲液2.3、DNA电泳上样缓冲液（loadingbuffer）指示剂监测电泳的行进过程，指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。10mmol/l的EDTA螯合Mg2＋，防止电泳过程中DNA被降解一定浓度的甘油或蔗糖增加样品的比重和密度以保证DNA沉入加样孔内，而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。溴酚蓝指示剂目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓冲液，DNA样品中仅需加入1/10的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。2.3、DNA电泳上样缓冲液（loadingbuffer倒胶点样倒胶点样2.4、DNA电泳上样量的控制

在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带即可观察到清晰结果。对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。2.4、DNA电泳上样量的控制在分析性电泳中，一般样品投入2.5、脉冲场凝胶电泳

pulsed-fieldgelelectrophoresis这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。脉冲电场电泳示意图2.5、脉冲场凝胶电泳

pulsed-fieldgele3、分子杂交分子杂交(molecularhybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P或125I)、生物素或荧光酶等）探针（DNA、RNA或蛋白质）进行相同或不同种类分子间相互特异识别而发生结合的过程。3、分子杂交分子杂交(molecularhybridiza3.1核酸探针一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。根据标记物不同可分为放射性探针和非放射性探针两大类；放射性标记物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d)非放射性标记物半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。3.1核酸探针一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记寡核苷酸探针（oligonucleotidprobe）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或RNA），能与被检测长链DNA或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA或RNA分子的存在。常用寡核苷酸探针的标记物放射性同位素标记：32P、33P、35S非放射性标记：生物素、地高辛生物素－dUTP、生物素－dATP、地高辛－dUTP等寡核苷酸探针（oligonucleotidprobe）：是杂交探针的标记：ABC荧光标记杂交探针的标记：ABC荧光标记杂交探针的标记：ABC显色酶标记杂交探针的标记：ABC显色酶标记地高辛－dUTP杂交探针的标记：地高辛系统标记地高辛－dUTP杂交探针的标记：地高辛系统标记两种地高辛－dUTP显色系统两种地高辛－dUTP显色系统DIG探针杂交过程DIG探针杂交过程杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性）足够长度（至少12个碱基）内部不含互补区探针的制备方法或来源包括：人工合成cDNA合成同源序列mRNAGACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCAGACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCA杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条T4-PNP介导的末端标记探针的标记方法切口移位(平移)法引物延伸法末端标记法体外转录或反录法①末端标记TdT介导的末端标记T4-Pol介导的末端标记T4-PNP介导的末端标记探针的标记方法切口移位(平移)法引②DNA聚合酶介导的切口平移标记②DNA聚合酶介导的切口平移标记③DNA聚合酶介导的随机引物法③DNA聚合酶介导的随机引物法④逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）5’TTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA④逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCA转录酶介导的转录标记转录酶介导的转录标记3.2Southern杂交(Southernblotting)目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳①0.4NNaOH变性②1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）中和③使DNA仍保持单链状态①将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上②通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上

洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去检测：放射性标记、检测非放射性标记、检测3.2Southern杂交(Southernblot分子杂交炉紫外交联仪分子杂交炉紫外交联仪M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（λDNA/HindⅢ）1-3，苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经KpnⅠ-PstⅠ、PstⅠ和KpnⅠ酶切以cry1Aa杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用DIG标记探针M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（λDNA/HindⅢ3.3Northern杂交(Northernblotting)(A)RNAisisolatedfromvarioustissuesandisseparatedbysizeusinggelelectrophoresis.(B)Thegelisthenplacedonapaperwick,whichabsorbsanionicsolutionfromatrough(C)AfilterthattrapsRNAisplacedabovethegel,andblottingpaperisplacedabovethefilter.Capillaryactiondrawsthesolutionthroughthegel,trappingtheRNAonthefilter(D)Thefilterisincubatedwithradioactivesingle-strandedDNAcomplementarytothemRNAofinterest(E)AfteranyunboundDNAiswashedoff,autoradiographylocalizesthemRNAinthesamplesthatcontainit.(F)DrawingofadevelopmentalNorthernblotshowingthepresenceofPax6mRNAintheeye,brain,andpancreasofamammalianembryo3.3Northern杂交(NorthernblotSBEIIIWTSBEIIIOXWTSBEIIIOX检测基因的表达水平Northern的应用实例SBEIIIWTSBEIIIOXWTSBEIIIOX3.4、Western印迹法(Westernblotting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗体对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标，二抗）反应显色反应：酶促反应3.4、Western印迹法(Westernblotti何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件三种分子杂交技术的比较SouthernNorthernWestern三种分子杂交技术的比较SouthernNorthernWes3.5、原位杂交(insituhybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态细胞或组织的原位杂交检测特异mRNA是否存在。步骤：细胞或组织的固定后置于载玻片上组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测基本步骤3.5、原位杂交(insituhybridization硫转蛋白在拟南芥根部的原位杂交硫转蛋白在拟南芥根部的原位杂交FluorescentinsituhybridizationchromosomesMulticolorfluorescenceinsituhybridizationofZeamaysL.chromosomes.Studyofmaizechromosomeshasbeenhamperedbyalackofchromosomefeatures.Fluorescentinsituhybridizat菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用基本程序是：将被筛选的大肠杆菌菌落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中转移到硝酸纤维素滤膜上，进行适当的温育，保藏原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原复制平板和膜转印时应在平板和膜上的一侧做三个对应的标签①0.5MNaOH裂解细菌②酸中和③蛋白酶处理④漂洗细胞碎片⑤80℃烘烤与32P-标记的探针杂交放射性自显影在参照平板上挑取目标阳性克隆（阳性菌落）扩大培养菌落原位杂交复制平板和膜转印时应在平板和膜上的一侧做三个对应的标签①0.噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交4、PCR技术4.1PCR技术发展简史聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外扩增的一种方法AppliedBiosystemsGeneAmpPCR9700Thermocycler4、PCR技术4.1PCR技术发展简史聚合酶链反应(PoDr.HargobindKhorana（1922－）Khorana(1971)等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。序列分析方法未成熟寡核苷酸引物合成还处于手工及半自动合成阶段热稳定的DNA聚合酶未见报道因此这个想法没有实际意义！！但是：TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1968"fortheirinterpretationofthegeneticcodeanditsfunctioninproteinsynthesis"Dr.HargobindKhoranaKhorana(1加速分子生物学发展进程的一项“简单而晚熟”技术TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis1944－Dr.MullisjoinedtheCetusCorp.inEmeryville,California,asaDNAchemistin19791983年，Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。加速分子生物学发展进程的一项“简单而晚熟”技术TheNoMullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow片段Klenow片段不耐热，每个循环加一次酶是一个笨拙的中看不中用的实验室方法扩增的DNA片段很均一，真实性较高，只有所期望的一种DNA片段1988年Keohanog改用T4DNAPol但仍是每个循环加一次酶Mullis最初使用的DNA聚合酶是Klenow片段Klen1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.(1988)Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.239:487-491.

SaikiRK,ScharfS,FaloonaF,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.(1985)Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysesfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.230:1350-1354.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PC4.2PCR技术基本原理和操作类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物基本反应步骤变性退火延伸变性4.2.1PCR技术基本原理4.2PCR技术基本原理和操作类似于DNA的天然复制①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链①模板DNA的变性②模板DNA与引物的退火(复性)③预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5min模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNATaqDNA聚合酶94oC5min模板DNTaq酶模板DNAdNTP引物Buffer94℃

30s55℃1min72℃2.5minTaq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃7～10min循环25～35次Taq酶94℃30sTaq酶72℃7～10mi第二轮扩增第三轮扩增第一轮扩增产物目的基因目的基因第二轮扩增第三轮扩增第一轮扩增产物目的基因目的基因琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用下面的公式计算。PCR反应动力学Y＝(1＋X)nY：代表DNA片段扩增后的拷贝数X：表示平均每次的扩增效率n：代表循环次数平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件4.2.2PCR技术反应体系、条件和过程引物、酶(热稳定性DNA聚合酶)、dNTP、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液①PCR反应的基本成分

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul标准的PCR反应体系：4.2.2PCR技术反应体系、条件和过程引物、酶(热稳定性ddH2O11μLcDNA第一链模板1μL2×GCbuffer25μLdNTP(25mmol/L)8μLP7(10μmol/L)2μLP8(10μmol/L)2μLLATaqDNApolymease1μL在0.1mL离心管中加入下列溶液:总体积50μL

RT-PCR

ddH2O②10×扩增缓冲液KCl500mmol.L-1Tris-HCl100mmol.L-1(pH8.3-8.8)MgCl15mmol.L-1明胶0.1%在延伸温度（72℃）下，pH值接近7.2，二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用1.5mMMg2+，有时使用Mn2+。dNTP都能结合Mg2+，因此Mg2+的浓度要大于dNTP，KCl对扩增大于500bp长度和改善DNA片段产物是有益的②10×扩增缓冲液KCl500标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP（终浓度：250µmol/L）③dNTP④酶及其浓度SelectionforDNApolymeraseKlenow酶，早期采用，该酶不耐热，缺点有①温度要求低(37℃)，受热即失活；②产物特异性不高；③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；④扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTPthermostableDNApolymerases①TaqDNApolymerase②TthDNApolymerase—fromT.thermophilus③VENTDNApolymerase—fromT.litoralis④Sacpolymerase⑤pfupolymeraseTaqDNA聚合酶分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mgthermostableDNApolymerasesTa离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感，最适浓度为50mmol/L。忠实性：没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意抑制剂：尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂内源DNA：不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存：在-20℃至少6个月。离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感，最适浓度为5如何选择最合适的DNA聚合酶

－－PCR实验的不同需求特异性：基因组扩增、RT-PCR保真性：基因筛选、测序、TA克隆长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测如何选择最合适的DNA聚合酶

－－PCR实验的产品类型产品名称产品性能化学修饰天为时代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:THERMO-START®DNAPolymeraseStratagene:SureStart™Taq大大提高PCR反应的特异性化学修饰不影响后续实验抗体抑制Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinum®

TaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蜡封

Promega：TaqBeadTM

HotStart热启动Taq酶产品类型产品名称产品性能化学修饰天为特点：3′→5′核酸外切酶活性，降低碱基错配率用途：表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP）高保真酶特点：3′→5′核酸外切酶活性，降低碱基错配率用途：表达基因产品类型生物公司性能比较PfuDNAPolymerase

天为时代StratagenePromega在目前已发现的所有耐热聚合酶中,Pfu保真度最高碱基错配率最低

PyrobestTM

DNAPolymerase

TaKaRaTliDNAPolymerasePromega产品类型生物公司性能比较PfPromega中国公司普洛麦格（北京）生物技术有限公司产品Promega中国公司高保真＋高扩增效率混合酶－热启动耐热聚合酶－3′→5′核酸外切酶用途超长片段扩增、测序构建基因图谱复杂模板扩增：GC含量高、二级结构高保真＋高扩增效率混合酶－热启动耐热聚合酶用途超长片段特点产品性能高扩增效率天为时代：TaqPlusTaKaRa：ExTaqTM

复杂模板扩增高保真天为时代：TaqPlatinumInvitrogen：PfxPlatinumTaqDNApolymeraseHighFidelity保真度低于Pfu聚合酶但扩增效率较高长片段扩增天为时代：LongTaq

TaKaRa：LATaq

Invitrogen：

ElongaseAmplificaitonSystem

特别适用于保真度较高的超长片段扩增特点产品性能高扩增-controlledtemperature

-controlledrateoftemperaturechangeThermocyclerThermocyclerGradient-Thermocycleranautomaticmachine,acomputer-controlledthermalblock,inwhichthetemperaturecanberapidlychangedandfinelycontrolledGradient-Thermocycleranaut引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。⑤引物Ⅰ设计引物的原则引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物扩增跨度：以500bp为宜引物碱基：G+C含量以40-6⑤引物3′端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑤引物3′端的碱基要求严格配对⑥引物中有或能加上合适的酶切引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会引物的解链温度两个引物之间的Tm值差异最好在

2-5℃引物量：引物的解链温度Ⅱ简并引物设计（degenerateprimers)如：AsnPheTyrAla对应的核苷酸序列(?)AAUUUUUAUGCUAACUUCUACGCC等N/ATCGⅡ简并引物设计（degenerateprimers)如：AⅢ设计引物的方法设计引物的操作流程同源性比较序列下载引物设计筛选根据所需要检测的基因在/pubmed查询有关序列利用primerpremier5.0等软件进行设计和筛选Ⅲ设计引物的方法设计引物的操作流程同源性比较序列下载引物设计何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件同源性比较/blast/blast.cgi中在线比较采用OMIGA，PGCENE进行两两比较或多序列比较同源性比较http://www.ncbi.nlm.nih.g何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件上游引物下游引物发荚结构，点击显示的△G的绝对值不应大于5，所形成的发荚结构3′端为突出端影响较小，5′端影响较大引物自身形成二聚体，点击显示的△G的绝对值不应大于5引物在目标基因序列中间形成错配的情况，点击显示的△G的绝对值不应大于15上下游引物形成配对的情况，点击显示的△G的绝对值不应大于5这几个参数对引物设计的影响顺序：FalsePriming>HairpinandCrossDimer>Dimer得到产物的机率，应大于50%上游引物下游引物发荚结构，点击显示的△G的绝对值不应大于5，⑥PCR反应条件的选择温度与时间的设置三温度点法双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸(标准反应)二温度点法除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。较短靶基因(长度为100～300bp)时⑥PCR反应条件的选择温度与时间的设置三温度点法双链变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板⑦PCR实验操作过程⑦PCR实验操作过程PCR产物纯化PCR产物纯化PCR产物纯化试剂盒PCR产物纯化试剂盒PCR产物电泳⑧PCR常见问题正对照有条带，而样品则无原因：该Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解模板:含有抑制物，含量低反应条件：退火温度太高，延伸时间太短优化纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间PCR产物电泳⑧PCR常见问题正对照有条带，而样品则无原因非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带原因：引物特异性差酶纯度不高Mg2+浓度偏高退火温度偏低Buffer不合适循环次数过多解决：重新设计引物或者使用巢式PCR换用高纯度的酶降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法更换Buffer减少循环次数非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：酶量过多模板不纯循环次数过多dNTP、Mg2+浓度偏高退火温度偏低Buffer不合适解决：适量用酶纯化模板减少循环次数适当降低dNTP和镁离子的浓度适当提高退火温度更换Buffer拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物双脱氧法测序

(Sangerdideoxyprocedure

)5DNA序列的测定(Sangerdideoxyprocedure

)大规模测序的策略和测序技术的发展化学法测序(Maxam-Gilbertprocedure)

双脱氧法测序(SangerdideoxyproceduFrederickSangerDNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′，5′-磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。5.1双脱氧法测序(Sangerdideoxyprocedure

)①双脱氧法测序原理FrederickSangerDNA的合成过程中，在合成的何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理课件双脱氧法测序基本过程双脱氧法测序基本过程自动测序电泳装置自动测序电泳装置AnexampleofaportionofachromatogramfromautomatedsequencingAutomatedsequencingisbasedonthedideoxymethodology,butfourdifferentfluorescentdye-labelledddNTPsareused.Thuseachfluorescentlabelcanbedetectedbyitscharacteristicspectrum.Theproductsareseparatedbyautomatedelectrophoresisandthebandsdetectedbyfluorescencespectroscopy.Anexampleofaportionofac

Sanger测序仪采用96个毛细电泳管的阵列，可以同时进行96个这样的测序反应，每个反应得到的Read长度可以达到1000bp以上

MEGABACE1000DNA测序仪Sanger测序仪采用96个毛细电泳管的阵列，可以同时进多道移液器96孔反应板多道移液器96孔反应板②双脱氧法测序程序将待测基因序列打断成较短重叠的DNA片段群DNA片段连入载体，在E.coli体内扩增，挑取单菌落，分离纯化重组载体测序加入DNA聚合酶，dNTP以及带有荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP凝胶电泳，检测标记过的核苷酸片段的荧光信号。根据重叠序列，通过软件处理，DNA序列信息②双脱氧法测序程序将待测基因序列打断成较短重叠的DNA片测序载体pUC：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有所不同，但基本均由pUC衍生而来，使用时需先变性M13系列和pUC系列的测序载体的使用避免了使用物理方法分离大量的DNAM13：单链噬菌体载体，目前很少采用测序载体pUC：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有测序DNA聚合酶①DNA聚合酶ⅠKlenow片段5′→3′的聚合酶活性，3′→5′的外切酶活性持续合成能力不强，不能复制富含二级结构的模板区以ddNTP为底物的能力远比在dNTP低易受DNA制备时经常产生的污染物的影响，且只对单链模板有效测序DNA聚合酶①DNA聚合酶ⅠKlenow片段5′→3′②T7噬菌体聚合酶(测序酶)是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，缺乏3′→5′外切酶活性能产生出非常漂亮的DNA梯带，每条带都具有相似的强度，可读的DNA序列可覆盖凝胶的全长测序酶催化ddNTP结合的速率是dNTP的33%具有1.0和2.0两个版本，2.0取代了1.0，能对折叠成二级结构的模板起作用测序酶526位氨基酸为Tyr，若换成Phe，结合ddNTP的能力下降2000倍，将E.coliDNAPolⅠ或TaqdnaPol类似氨基酸换面Tyr其结合ddNTP的能力提高8000倍②T7噬菌体聚合酶(测序酶)是一种经过修饰的T7噬菌体DN③TaqDNA聚合酶它在高温下（70℃）进行终止链反应的能力可减少测序反应中由于模板DNA上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同，从顶部到底部条带逐渐减弱，出现阴影。可用于富含二级结构的模板催化ddNTP结合的与该区模板DNA序列的影响TaqDNAPol和PfuPol催化ddNTP结合的速率比结合dNTP的速率低两个数量级③TaqDNA聚合酶它在高温下（70℃）进行终止链反应的能通用引物的使用避免了合成不同引物的麻烦（M13正反向，T7，SP6等）M13Primers（TaKaRa公司）M13Primer各引物位置图通用引物的使用避免了合成不同引物的麻烦（M13正反向，T7，碱基序列：5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3′SP6PromoterPrimer形态冻结干燥品。可用灭菌水或TEBuffer(pH7.5～8.0)溶解后使用用途作为具有SP6Promoter载体的测序用引物或PCR用引物碱基序列：5′-CATACGATTTAGGTGACAC5.2化学法测序(Maxam-Gilbertprocedure)

经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后，根据X光片所显现的相应条带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序是一个DNA化学降解的过程，而不是生物合成过程化学试剂处理具有末端标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物注意：只能标记一个碱基，多碱基标记会产生错误。标记方式：羟基磷酸化反应、大肠杆菌聚合酶IKlenow片段及[α-32P]dNTP标记、用末端转移酶标记DNA片段的3′端

5.2化学法测序(Maxam-GilbertprocedG系统；pH8.0硫酸二甲酯→G→m7G→C8~N9断裂→脱G

A+G系统；pH2.0哌啶甲酸（pidine）→嘌呤环N质子化→脱嘌呤C系统；1.5mol/LNaCl（高盐）C+肼（hydrazine）→脱C

T+C系统（非高盐条件）肼(hydrazine)→打开嘧啶环→重新5C环化→脱嘧啶G系统；pH8.0A+G系统；pH2.0C系统；1.化学降解法测序基本过程化学降解法测序基本过程生物信息分析普通的序列分析软件序列的拼装：CAP（contigassemblingprogramme）同源性的比较：BLAST，ClustalW等。集成软件：如BioEdit等。提供如少数序列的拼装，同源性的比较，开放阅读框的查找，酶切位点的查找等功能。学会利用丰富的网上资源。生物信息分析普通的序列分析软件测序技术的发展双脱氧末端终止法(Sanger测序法)1970s同位素标记，手工1980s荧光标记，自动1990s毛细管电泳合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）合成测序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）连接测序（Sequencin