细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要［目的］通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。［方法］以大肠杆菌E.CQ1KL2SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。［结果］经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的）NA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌吟和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响）NA的复制和转录。总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。因此，在使用诱变剂时要注意使用的剂量。本实验所用诱变剂是紫外线，其剂量主要由紫外灯功率、照射时间、与紫外灯的距离决定。因此，可以通过调节紫外灯功率、照射时间和与紫外灯的距离来控制诱变剂的剂量，也就控制了诱变剂的诱变效果。营养缺陷型菌株是指在营养上表现某种缺陷的菌株，必须在培养基中添加某种有机营养成分后才能正常生长。突变前的菌株称为野生型菌株，或原养型菌株。能够满足野生型生长的最低营养成分的合成培养基称为基本培养基。能够满足营养缺陷型菌株生长的培养基称为完全培养基。营养缺陷型菌株在生产实践中可作为杂交育种和发酵核苷酸、氨基酸等中间代谢产物的出发菌株或生产菌株，在遗传分析中也可以作为遗传分析菌株。同时也是研究微生物代谢途径的重要材料。诱变处理后，突变频率较低，只有把大量的野生型淘汰后缺陷型才便于检出。对营养缺陷型菌株进行浓缩时，采用的方法有青霉素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。本实验采用青霉素法。这种方法只能应用于细菌中，其原理是青霉素能能阻止生长中细菌细胞壁骨架结构的合成，从而使生长中的细胞的细胞壁不完整而在高渗溶液中成为原生质体，但对停止生长繁殖的细菌没有作用2］。诱变处理后的细菌经过一般中间培养，让其突变型充分表达，然后培养在含有青霉素的基本培养基上，就可以淘汰（杀死）大部分的野生型细菌，从而达到浓缩目的。营养缺陷型的检出方法有多种，本实验采用逐个测定法。将浓缩过的缺陷型菌液涂于完全培养基平板上，将长出的菌逐个地按一定排列次序分别点种基本培养基和完全培养基上。经过培养后，若完全培养基上某一位置出现菌落，而在基本培养基的相应位置却没有生长，那么在完全培养基上那个位置的菌落可能就是营养缺陷型。点种时一般先点种基本培养基，而后点种完全培养基。点种方格图如图1。最后，通过生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定。在基本培养基中添加混合氨基酸和混合维生素，观察是否出现浑浊的生长圈。若产生生长圈，则该处加的营养物质即是该缺陷型菌株不能合成的，则该菌株称为该物的缺陷型。1材料和方法1.1材料1.1.1培养基1）LB液体培养基：酵母膏0.5g，蛋白豚1g，氯化钠0.5g，水100ml,pH7.2，高压灭菌121C，20min。LB固体培养基：在上述液体培养基中添加2%的琼脂。2）2XLB液体培养基：酵母膏0.5g，蛋白豚1g，氯化钠0.5g，水50ml,pH7.2。3）基本培养基：Vogel50X（即浓缩50倍）：MgSO4-7H2O10g，柠檬酸100g,N3NH4HPO4-4H2O175g,K2HPO4-2H2O599.88g水600ml。使药品溶解后再定容1000ml。基本固体培养基：50X2ml，葡萄糖2g，蒸馏水98ml，琼脂2g,pH7.0，高压灭菌121C，20min。无N基本培养基：K2HPO40.7g,KH2PO40.3g,柠檬酸钠・3H2O0.5g,MgSO4-7H2O0.01g,葡萄糖2g，水100ml,pH7.0,高压灭菌121°C,20min。2N基本培养基：KHPO0.7g,KHPO0.3g，柠檬酸钠・3HO0.5g,MgSO•7HO0.01g,硫2424242酸铵0.2g，葡萄糖2g,水100ml,pH7.0,高压灭菌121C,20min。1.1.2菌株：大肠杆菌E.colKSF+121.1.3混合氨基酸和混合维生素：氨基酸分7组，其中6组每组6种氨基酸，每种氨基酸等量研细充分混合。表1混合氨基酸配制I赖氨酸精氨酸甲硫氨酸半胱氨酸嘌吟胱氨酸II组氨酸精氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸嘧啶m丙氨酸甲硫氨酸苏氨酸羟脯氨酸甘氨酸丝氨酸W亮氨酸半胱氨酸谷氨酸羟脯氨酸异亮氨酸缬氨酸V苯丙氨酸胱氨酸天冬氨酸甘氨酸异亮氨酸酪氨酸用色氨酸嘌吟嘧啶丝氨酸缬氨酸酪氨酸训脯氨酸第7组是脯氨酸，因为这种氨基酸易潮解，所以单独成一组。把维生素B「B2、B6泛酸，对氨基苯甲酸(BAPA)，烟碱酸及生物素等量研细，充分混合，配成混合维生素，组成第8组。1.1.4器材：移液枪，枪尖及枪尖盒，玻璃棒，7cm小培养皿，9cm培养皿，涂布棒，酒精灯，无菌超净台，接种环，三角瓶，烧杯，容量瓶，试管，离心管，离心机，牙签，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，黑布等。1.2方法1)材料准备：LB液体培养基：10ml/100ml三角瓶，4个LB固体培养基：250ml/500ml三角瓶，1个2XLB液体培养基：3ml/试管，1个无N基本培养基：5ml/100ml三角瓶，1个2N基本培养基：5ml/100ml三角瓶，1个基本固体培养基：300ml/500ml三角瓶，1个生理盐水：4ml/试管，10个7cm小培养皿，1个9cm培养皿，20个1ml枪尖，1盒200们枪尖，1盒牙签，1瓶2）将大肠杆菌接种于5mlLB液体培养基三角瓶中，37°C培养过夜。3）取过夜培养后的菌液0.3ml，加入新的5mlLB液体培养基三角瓶中，继续培养4-6h，然后倒入5ml离心管中，7000rpm离心3-4min，弃上清液，打匀沉淀，加入生理盐水4ml，吸取菌液3ml于7cm小皿中，将培养皿置于紫外灯下约30cm处，将处理的培养皿连同盖一起放入灯下灭菌1min，然后打开皿盖照射3-4min,照射后，将2XLB液体培养基加入处理过的菌液平皿中，混匀，用黑布包好，置于37C避光培养12h以上。4）吸取菌液3ml于5ml离心管中离心（7000rpm）3-4min，弃上清，加4ml生理盐水，打匀沉淀。重复两次。最后重悬于3ml生理盐水中，取0.2ml菌液于5ml无N基本培养基中，37C培养12h。5）加入2N基本培养基5ml，加入氨苄青霉素（10JJg/ml）20pl，终浓度约20pg/ml，再放入37C培养。6）从培养12、16、24h的菌液中，分别取0.1ml菌液加到基本培养基和完全培养基中，涂布均匀，放入温箱37C培养。7）检出营养缺陷型。上述平板培养36-48h后，进行菌落计数。选取完全培养基上长的菌落数远大于基本培养基的那一组，用灭过菌的牙签挑取完全培养基上长处的菌落200个，分别点种于基本和完全培养基平板上，注意顺序是先基本后完全。置37C培养过夜。8）选在基本培养基上不生长，完全培养基上生长的菌落，在基本培养基上划线，37C培养，24h后仍然不生长的是营养缺陷型。9）生长谱法测定：将是营养缺陷型的菌落接种于10mlLB液体培养基三角瓶中，置37C培养过夜。取菌液于5mi离心管中，7000rpm离心3-4min,弃上清，打匀沉淀，共离心洗涤两次，最后加4ml生理盐水制成菌悬液。取菌液1ml于培养皿中，融化后冷却至40-50C的基本培养基倾注，混匀平放。待凝，共二皿，将皿底分成,9个格子，编号1-9,依次在编号为1-8的格子出培养基上加少量混合氨基酸和混合维生素，编号9处做空白对照。置37C培养24h，观察生长情况，据此确定该菌株是哪种营养缺陷型。2结果与分析2.1结果（1）营养缺陷型的检出：有菌落在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长，该菌落可暂认为是营养缺陷型菌株。（2）复证：该菌株并非营养缺陷型菌株。（3）生长谱测定：借其他组同学复证后的营养缺陷型菌株，进行生长谱测定，结果显示没有预期营养缺陷型菌株产生。2.2分析（1）营养缺陷型的检出：观察12、16、24h菌液涂布后培养的菌落生长情况，由于12h培养时间过长，很难找单菌落；24h的完全培养基中的菌落数与基本培养基上菌落数的比例相较16h的要小，因此选择了16h菌液的培养物作为检出接种菌°37C培养过夜，观察菌落生长情况，在72号格子对应的完全培养基生长了菌落，而相同位置的基本培养基却没有菌落生长，因此可以暂认为该菌株为营养缺陷型菌株。（2）复证：挑取上述单菌落，分别在基本培养基和完全培养基上平板划线,37°C培养24h后，观察菌落生长情况，结果发现基本培养基和完全培养基上均有菌落生长。因此，复证结果显示，该菌株并非营养缺陷型菌株。（3）生长谱测定：由于本组在复证中未得到营养缺陷型菌株，因此只能借助他组同学复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱测定°37C培养24h,观察菌落生长状况。在培养皿的9个区域内，1-8号添加了混合氨基酸和混合维生素，9号不添加任何物质，为空白对照组。结果显示，在9号区域有菌落生长，而1-8号均没有菌落生长。在实验过程中，由于对实验步骤的理解发生了差错，结果在9号区域滴加了未灭菌的硫酸镁溶液，因此导致杂菌污染。1-8号添加了混合氨基酸和混合维生素，无菌落生长，因此没有预期的营养缺陷型菌株产生。（4）原因分析：a有可能产生双缺陷型菌株，或者多缺陷型菌株，在生长谱测定时，没有合适的混合氨基酸组合，因此在添加了混合营养物的培养基上也不能生长。b倾注平板时，培养基温度过高，将缺陷型菌株杀死。c有可能滴加混合氨基酸过多，导致氨基酸浓度过高，对菌株的生长起抑制作用。由于氨基酸在培养基内的渗透，培养基的氨基酸浓度存在梯度，因此可能发现环状的微弱的生长圈。d可能产生非上述营养物（氨基酸、嘌吟、嘧啶、维生素、烟碱、生物素等）的营养缺陷型。由于基因突变具有不定向性，在诱变过程中可能产生了某类营养缺陷型，但是不是上述营养物质的缺陷型，因此即使在基本培养基中添加上述营养物质，该缺陷型菌株也不能生长。e在操作方面的因素。比如，由于操作环境和实际教学条件有限，在进行紫外诱变时，紫外诱变的处理时间以及平皿与紫外灯的距离不能很好的控制导致紫外线剂量控制不准确，而且紫外诱变本身具有一定的偶然性，综合考虑，不能产生预期的营养缺陷型菌株;此外，处理后培养的遮光效果则影响微生物的光修复系统，若遮光不严则导致光复活。f在生长谱测定时，离心时本组的菌泥粘度有些大（可能是在培养时培养基成分有问题）导致菌悬液在培养皿内分布不均匀，在倾注后也不能将菌液摇均匀，从而导致不能辨别是否有营养缺陷型菌株产生。g可能与青霉素处理的时间和浓度，以及基本培养基配制的浓度（外界高渗溶液的浓度）有关，导致原生质体破裂，缺陷型菌株生长而被杀死，导致缺陷型菌株获得率下降。3讨论本次实验以大肠杆菌E.coMi2SF+为实验菌株通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定菌株的缺陷型类型。由于基因突变具有的不定向性、低频性的固有因素，以及操作和实验条件有限等因素，通过诱变育种得到想要的新菌种需要高通量，工作量大而且不易得到预期的菌种，因此实验未能得到预期的营养缺陷型菌株是一种正常结果。用青霉素进行浓缩，其原理在前言中已经介绍。在配制的基本培养基中，添加的葡萄糖和硫酸镁可能与维持高渗有关，防止缺陷型以外的菌株形成的原生质体破裂，对缺陷型菌株造成影响］。此外，在青霉素处理时，其时间分为12h、16h和24h，因为在这个过程中处理时间也起到重要的作用。有研究显示，青霉素处理的时间过短就不能有效地杀死大部分我们不需要的细胞，而处理时间过长则所得到需要的缺陷型菌株获得率会大大下降，因为这可能不可避免的造成原生质体的破裂，导致部分缺陷型生长而被青霉素杀死2］。实验有很多注意事项值得我们注意，现总结如下：（1）诱变前后，所用的细胞须采用固定培养条件下得到的细胞。（2）诱变操作采用成分固定的细胞悬液进行实验。究竟用菌体在悬浊液中能够增殖的培养基，还是用菌体不能增殖的某种缓冲液，应该考虑其诱变