侵袭性真菌感染的实验诊断-2011课件

侵袭性真菌感染的实验室诊断十堰市太和医院检验部湖北医药学院检验系杨宏伟女，58岁，T2DM16年。旅游后38.1℃，轻咳，CT右肺尖0.4cm结节，生化、肿瘤标志物均正常。住院后CT右肺尖0.8cm、0.4cm两个结节。正电子发射计算机断层显像(PET/CT)右上肺高度代谢灶，右肺门高代谢淋巴结。抗TB治疗1月，CT示右上肺两结节融合成1.8cm×2.4cm大病灶；PET/CT右上肺、右肺门高代谢灶，恶性病变可能性大。开胸探查，切除病灶，病理，右上肺隐球菌肺炎，多核巨细胞内隐球菌3+。口服氟康唑。病例(中国医学论坛报)：DFI（deepfungalinfection）真菌侵犯毛发、表皮、甲床以外的组织（皮下组织、黏膜、肌肉、内脏器官、中枢神经系统等）引起的感染。2007年欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)侵袭性真菌感染协作组(IFICG)和美国国立变态反应与传染病研究所霉菌病研究组(NIAID-MSG)将IFI改称IFD。国内未获响应，现仅用于侵袭性念珠菌病(invasivecandidosis,IC)和曲霉病(invasiveaspergillosis,IA)。IFD（invasivefungaldisease）真菌感染的实验诊断方法及问题形态学检查：经验？阳性率？培养+鉴定：时间长，敏感性？血清学检查：敏感性？特异性？分子生物学检查：标准化？侵袭性真菌病的致病菌条件致病菌念珠菌曲霉隐球菌接合菌镰刀菌暗色真菌酵母菌毛孢子菌枝顶孢霉致病性双相真菌组织胞浆菌球孢子菌芽生菌马内菲青霉孢子丝菌念珠菌病隐球菌病侵袭性曲霉病侵袭性真菌病(IFD)主要包括

IC10%~49%；

IA62%~85%；骨髓移植者IA病死率70%~90%；接合菌致IFI病死率70%~100%。美国Lin统计1995~2001文献1941例IA，死亡率58%（骨髓移植者86.7%，中枢N系统感染或播散性IA88.1%）。病死率IFI分级诊断标准诊断级别高危因素临床特征微生物学检查组织病理学证据拟诊++--临床诊断+++-确诊++++（1）重要脏器罹患时的症状与体征（2）相应的血、尿常规改变，生化检查指标异常（3）各种基础病（血液病、艾滋病…..）的临床与实验室检查表现（4）持续发热96h，经积极的抗菌治疗无效（5）影像学检查（X线、CT等）：

肺IA:胸膜下密度增高结节样实变——病灶周出现晕轮征——实变区液化，空洞或新月征；

肺孢子菌肺炎:两肺毛玻璃样间质病变；

鼻脑毛霉病:鼻窦、眼眶颅骨骨组织破坏。临床表现特征（1）合格标本直接镜检发现菌丝且连续2次培养同种真菌阳性。（2）BALF镜检发现菌丝，培养真菌阳性。（3）合格标本或BALF镜检或培养发现新生隐球菌。（4）G试验连续2次阳性。（5）GM试验连续2次阳性。（6）血液、胸水、BALF用LA法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性。有临床诊断价值的微生物学检查（1）血液真菌培养阳性，但曲霉、青霉（马尔尼菲青霉除外）需排除污染。（2）导管相关性真菌血症，导管培养与血培养均阳性，且为同一真菌。（3）胸水真菌培养阳性。（4）肺组织真菌培养阳性。（5）合格痰标本或BALF镜检发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体。（6）胸水、CSF、血液直接镜检发现新生隐球菌。（7）直接导尿培养念珠菌>105CFU/ml。有确诊价值的微生物学检查以下列念珠菌属最常见:

白色—（C.albicans）光滑—（C.glabrata）热带—（C.tropicalis）近平滑—（C.parapsilosis）克柔—（C.krusei）都柏林—（C.dubliniensis）季也蒙—（C.guilliermondii）。一、念珠菌属（Candida）IC发病的重要前提是念珠菌定植（1）革兰染色、乳酸酚棉蓝染色，镜检4~6μm圆或卵圆芽胞，可见出芽，假菌丝。

用含荧光增白剂（CalcofluorWhite，CFW）的10%~20%KOH涂片，紫外线激发呈蓝白或绿色荧光。（2）培养于沙氏培养基生长乳白色酵母样菌落；玉米粉-Tween80琼脂生长假菌丝、厚壁孢子；

CHROMagar培基上（35℃）菌落呈色：白念-绿色，热带-蓝灰，粉红、边缘模糊-克柔。其他种为白色至粉红色。血清（鸡蛋清）中37℃2~3h白念产生芽管。种间鉴别用糖发酵和糖同化试验。常规检查（1-3）-β-

D-葡聚糖检测（1-3）-β-D-葡聚糖检测b1,6glucansb1,3PPLbilayerchitinergosterolb1,3glucansynthasemannoproteins真菌细胞壁成份，占50%以上其他微生物、动物及人的细胞不含该成份用于侵袭性真菌感染的早期诊断BG检测的特点可检测多种致病真菌感染念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等不能用于检测隐球菌和接合菌感染阳性结果代表存在侵袭性真菌感染真菌对数生长期释放量最大

,可被体内葡聚糖酶降解(glucanase)每周检测2次BG检测用于念珠菌血症

BG检测敏感度明显高于Mannan检测79.6%vs42%阳性早于血培养阳性和临床症状出现对于念珠菌血症,BG检测是首选检查Clin.Infect.Dis.2005.41:654–659.J.Clin.Microbiol.2005.43:5957–5962J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013BG检测用于侵袭性肺曲霉感染（IPA)敏感度为55%-100%特异度为52%-100%对于确诊IPA，阳性率为85.7-100%高度可疑IPA，阳性率为52.4-66%Med.Mycol.2006.44:5163–5172J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013J.Clin.Microbiol.2005.43:299–305BG检测用于肺孢子菌检测BG是肺孢子菌包囊壁的组成成分可释放入血液可用于肺孢子菌检测目前常用的试剂Fungitec-G(Japan)界值为20pg/mL

Fungitell(US)界值为60pg/mL或80pg/mL

GKT-5MSet动态真菌检测试剂盒(金山川公司)界值为20pg/mL或50pg/mL

（4）多串连PCR（multiplextandemPCR，MT-PCR）以ITS1、ITS2、EF1-α、β微管蛋白（β-tubulin）为靶基因，可测常见念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌、接合菌等。（5）反向线点杂交（reverselineblothybridization，RLB）和基因芯片（oligonucleotidemicroarray）技术。尚未获批准。185个种中有20多个可致机会性感染常见为:烟曲霉（A.fumigatus）、黄曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）。棒曲霉（A.clavatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、杂色曲霉（A.versicolor）也有报告。二、曲霉菌属（Aspergillus）曲霉菌孢子是链状的，成熟后脱落，2~5μm，易在空气中悬浮。经空气吸入孢子致病，与定植无关。曲霉鉴定主要依靠形态学特征血清学试验：G试验，GM试验。分子生物学诊断：同念珠菌属。包括:菌落颜色，分生孢子梗形态、颜色，产孢结构数目，顶囊形态等。烟曲霉耐高温，40℃（38.5~50℃）生长良好。半乳甘露聚糖抗原检测

（GM试验）曲霉半乳甘露聚糖抗原b1,6glucansb1,3PPLbilayerchitinergosterolb1,3glucansynthasemannoproteinsGM抗原乳胶凝集试验（Pastorex®）

(15ng/ml)酶连免疫吸附试验（Platelia®）(1ng/ml)灵敏度（%）

特异度（%）

LA25-7090-100ELISA50-9080-90Sabettaetal.JID1985;152:946Ansorgetal.EurJClinMicrobiolInfectDis1994;13:582Verweijetal.JCM1995;33:3150Maertensetal.Blood2001;97:1604Herbrechtetal.JClinOncol2002;20:1898GM抗原检测原理曲霉galactomannanantigen大鼠EBA-2单克隆抗体双抗夹心法b1,6glucansb1,3PPLbilayerchitinergosterolb1,3glucansynthasemannoproteinsGM试验敏感度为0.71，特异度为0.89血液系统恶性病，敏感度和特异度分别为0.7和0.92骨髓移植患者，敏感度和特异度分别为0.82和0.86实体器官移植患者，敏感度为0.22，特异度为0.84成人敏感度和特异度分别为0.62和0.87儿童敏感度和特异度分别为0.89和0.85,文章较少（仅有2篇），但是呈现出较高的敏感度和特异度。假阳性哌拉西林/他唑巴坦Gluconate与其它的细菌或真菌成分有交叉反应皮炎芽生菌、黑孢霉、拟青霉、产黄青霉、马尔尼菲青霉、粉红单端孢、头状地霉等肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环谷类食物中的GM抗原曲霉感染检测的影响因素半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议：高危人群每周至少检测2次结合影象学、培养结果综合分析诊断结果判定标准界值的确定抗真菌治疗情况GM试验试剂盒推荐界值为1.5时灵敏度为64.7%,特异度为93.5%连续2次>1.5为阳性灵敏度为63.6%，特异度为85.7%临床皮肤科杂志，2005，34（12）：816-817中华内科杂志，2006，42（12）：992-995GM试验对于46例造血干细胞移植后患者的167份血样进行GM抗原的测定，发现以单次测定大于1.0，或者连续2次大于0.8为阳性标准，试验的灵敏度和特异度均较高，根据上述界值，该试验的灵敏度为81.8%，特异度为93.3%。中华医学杂志，2007，28（2）：83-86GM界值FDA将界值定为0.5界值从1.5降到0.5敏感度从76.3%升到97.4%-----21%特异度从97.5%降到90.5%-----7%连续2次I>0.5,阳性预测值更好ClinInfectDis.2007抗真菌治疗的影响确诊侵袭性曲霉病的造血干细胞移植未接受抗真菌治疗，GM试验敏感度87.5%接受抗真菌治疗，敏感度为20%治疗开始后半乳甘露聚糖的测定值会下降，未见下降意味着治疗失败应用卡泊芬净后，半乳甘露聚糖值会出现升高BG检测(阳性界值为60pg/mL)和GM（阳性界值为1.0）比较二者在体内的代谢动力学相似，敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均相同，分别为87.5%、89.6%、70%和96.3%二者联合可以提高特异度和阳性预测值，对敏感度和阴性预测值没有影响侵袭性曲霉感染（IPA)

BG检测与半乳甘露聚糖(GM)检测JClinMicrobiol,2005,43:299-305.约78个种，致病的约17个种和8个变种，引起IFI的主要为:新生隐球菌（C.neoformans），新生变种（var.neoformans）（血清型D型），格特变种（var.gatii）（B、C型），grubii变种（var.grubii）（A型）。在A、B、C、D、AD血清型中，我国已见A、D及AD型，A型最多。三、隐球菌属（Cryptococcus）感染途径：经呼吸道吸入孢子（可从鸽粪、按树分离），侵犯肺与神经系统。鉴定要点：沙氏培养基25℃~37℃均生长。CSF直接或离心沉淀物涂片墨汁染色发现圆或椭圆双层厚壁孢子，外有宽荚膜。菌体可见单个出芽。血清学试验：

隐球菌荚菌多糖抗原胶乳凝集试验(LA),试剂盒法国PaxtorexTMCryptoPlus,红色胶乳颗粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)单抗。标本：血清、CSF、BALF、尿，血清和CSF用链霉蛋白酶56℃、30min预处理。ELISA法：多抗包被，酶标记单抗检测。不受RF干扰。隐球菌乳胶凝集试验隐球菌LA检测—荚膜抗原隐球菌乳胶凝集试验多克隆IgG抗体敏感性可达99%假阴性前带效应解决方法：稀释假阳性与类风湿因子、丝孢酵母菌、DF-1菌感染血清有交叉反应解决方法：采用单抗、标本前处理隐球菌性脑膜炎涂片墨汁染色法检出隐球菌的阳性率分别为64.86%乳胶凝集试验检测患者血清和脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原的阳性率分别为91.67%,100%第二届全国深部真菌感染学术会议，2007.3.15-3.18，杭州

肺隐球菌病

2000年7月-2007年7月疑诊肺部隐球菌感染的患者27例血清乳胶凝集试验肺活检组织病理检查经病理证实肺隐球菌病9例，乳胶凝集试验全部阳性非隐球菌感染患者18例，乳胶凝集试验全部阴性

牟向东等。中华结核和呼吸杂志，2008，31（5）：360-363分子生物学方法以PCR和分子杂交技术为基础