细胞工程nn课件

细胞工程

CELLENGINEERING——改造和培养细胞、组织、器官、个体的工程刘广发1《细胞工程》主要内容（1）细胞工程的基础知识与基本技术；植物组织培养；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；花药及单倍体植株培养；原生质体制备与细胞融合；人工种子制备；植物脱病毒技术；2《细胞工程》主要内容（2）动物细胞与组织培养动物细胞融合细胞重构与动物克隆淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体染色体转移与基因转移人类干细胞研究原核细胞的原生质体融合真菌细胞的原生质体融合3参考文献自编.细胞工程讲义罗立新等.细胞工程.华南理工大学出版社，2003李志勇编著.细胞工程.科学出版社，20034探究式自主学习计划自愿组成学习小组，3人左右，选出组长；每组选一个主题，时间约10min；各组需准备PowerPoint;各组最高可得8分；其他同学可提问、补充或更正；教师讲评和讨论；5探究式自主学习安排（2）顺序课题学习小组8动物细胞与组织培养9动物细胞融合10细胞重构与动物克隆11染色体转移与基因转移12人工种子制备13原生质体制备与细胞融合（植物）14原核细胞的原生质体融合15真菌细胞的原生质体融合7细胞工程的三个层次细胞水平：细胞培养,细胞融合，整株培养；细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞器；基因水平：基因转化；8第一章细胞工程发展简史

一.植物细胞工程1902德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具全能性；1904德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长成植株；1922Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺绿的叶和根；1930-34李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏胚正常生长；1934美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠根尖病毒愈少；10植物细胞工程1935-36中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长；1937美国White发现VitB促进离体根生长，指出IAA能调控生长；1937美国Michel首创用0.5MNaNO3融合两个植物细胞原生质体；1941Overbeek以椰子乳加入培养基，成功培养曼佗罗幼胚；？Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比例低则生根；11植物细胞工程1956Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三万倍；1958Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体和植株；1953Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养；1960英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体；1964印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织；1968Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；12二.动物细胞工程1885Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天；1903Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月；1907美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长出轴突；1914Tomson创立能在培养基中维持器官小块的方法；？Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可无限生长；14动物细胞工程1940Earle建立可无限传代的小鼠结缔组织L系；1951Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系；1958冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合；1960s童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植，获核质杂种鱼；15第二章细胞工程的基础知识与基本技术基础知识

1.原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。

2.真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。17二.基本操作无菌操作概念与技术无菌室布局、卫生、消毒、超净台18基本操作2.细胞培养取样灭菌培养传代收获除菌取样3.细胞融合原生质体融合筛选4.转基因细胞（个体）19第三章植物细胞工程植物组织培养；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；花药及单倍体植株培养；原生质体制备与细胞融合；人工种子制备；植物脱病毒技术；主要内容：20第一节植物组织培养

在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。

全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。21植物组织培养过程离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化芽根植物体培养22配MS培养基1.基本组分：mg/L

蔗糖3%,KNO31900,NH4NO31650,CaCl2440,MgSO4370,KH2PO4170,2.微量无机物：Na2•EDTA37.3,FeSO427.8,MnSO422.3,ZnSO48.6,H3BO36.2,KI0.83,Na2MoO40.25,CoCl20.025,CuSO40.0253.微量有机物：mg/L

肌醇100，腺嘌呤5，甘氨酸2，烟酸0.5,吡咯醇0.5，硫胺素0.1，生物素0.01，

激动素(KT)0.04—10吲哚乙酸（IAA）1—304.Agar10g/L预备阶段（1）246-苄基腺嘌呤（6-BA）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸馏水稍加热使其溶解；萘乙酸（NAA）：先用少量95%乙醇和少量0.1mol/L的NaOH溶解；25预备阶段（2）选择合适的外植体外植体大小要适宜；外植体的部位影响其分化能力和器官分化的类型；外植体的年龄影响其分化率；同一植物不同部位的分化需不同的生长素/激动素比例；不同物种的相同部位外植体分化能力不一样；27预备阶段（3）除菌

自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗外植体

无菌滤纸吸干切割

无菌外植体若干块无菌外植体置培养基上28常用消毒剂的使用和效果

消毒剂使用浓度/%清除消毒时间/min灭菌效果次氯酸钠2容易5~30很好次氯酸钙9~10容易5~30很好漂白粉饱和溶液容易5~30很好升汞0.1~1较难2~10最好酒精70~75容易0.2~2好过氧化氢10~12最容易5~15好溴水1~2容易2~10很好硝酸银1较难5~30好抗生素4~50mg/L中等30~60较好29植物不同器官的消毒和处理种子

纯酒精浸10min，无菌水洗净，次氯酸钙（10％）浸20～30min，无菌水洗3～5次，无菌滤纸吸干；；果实

纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（2％）浸10min，无菌水反复冲洗，剥除种子和内部组织；茎切段

自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（2％）浸15～20min，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干；叶片

自来水洗净，纯酒精漂洗，升汞（0.1％）浸1min，或次氯酸钠（2％）浸15～20min，无菌水反复冲洗，无菌滤纸吸干；

30诱导去分化形成愈伤组织添加较高浓度的生长素；固体培养；液体培养；光照培养；黑暗培养；31形成愈伤组织所需的激素只需生长素类激素，如菊芋的块茎；只需细胞分裂素激素，如芜菁根；需上述两类激素，但有不同比例，多数植物；还需复杂的天然提取物（椰子乳）等；32生长素类激素吲哚乙酸（IAA）,常用1～10mg/L;吲哚丁酸（IBA）,常用1～5mg/L；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-5～10-7mol/L;萘乙酸（NAA），常用1.0mg/L；33细胞分裂素类激素激动素（KT）6-苄氨基嘌呤（6-BA）玉米素先加少量碱液预溶34继代增殖阶段移植扩增；分割继代；35光照培养室36生根长芽阶段生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用；外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同；37长芽生根阶段38移栽成活阶段保湿是关键；避免强光直射；温度适宜；39植物组培的优缺点优点：ABCD缺点：ABC40手指玫瑰41第二节植物细胞培养和次生代谢物生产本方法的历史、现状1956年，Routier&Nickell首先提出把植物细胞当作工业合成天然产物的途径；1968年，Reinhard,Corduan&Volks经培养生产出“哈尔碱”（harmine);1972年，Furuya&Ishii经培养生产出“维斯纳精”（Visnagin);1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”；1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”，达到60mg/L；目前世界最大的细胞培养罐达20t；42红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物43细胞培养和原植物的天然产物量的比较

产量

物种

天然产物细胞培养原植物橘叶鸡眼藤

蒽醌900微克/克干重

110微克/克干重决明蒽醌鲜重的0.334%

种子干重的0.21%长春花

蛇根碱干重的1.3%

干重的0.26%三角叶薯蓣

薯蓣皂苷26mg/克干重

20mg/克干块根人参

人参皂角苷鲜重的0.38%

鲜重的0.3~3.3%烟草

烟碱干重的3.4%

干重的2~5%烟草

泛醌0.5mg/克干重

16mg/克干叶大红罂粟

蒂巴因130mg/克干重

140mg/克干叶44从植物培养细胞中获得的各类物质氨基酸核酸蛋白质碳水化合物脂类维生素有机酸抗白血病药抗肿瘤药抗病毒药抗微生物药酶抑制剂色素香料甜味剂鸦片杀虫剂激素强心苷核苷酸橡胶阿司匹林奎宁可卡因第二节植物细胞培养和次生代谢物生产45培养植物细胞制造疫苗2006年2月，美国Dow

AgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗；将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗，以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。

46第二节植物细胞培养和次生代谢物生产悬浮培养

1.成批培养（封闭式培养）优点：易于操作；次生代谢物含量高；缺点：效率低；2.半连续和连续培养47第二节植物细胞培养和次生代谢物生产固定化细胞培养

次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性；细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质和各种物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于回收次生代谢物；48第二节植物细胞培养和次生代谢物生产平床培养系统优点：制作简单；能生产较多次生代谢物；缺点：占地面积大；分化区比例较小；02供应受限；49包埋法固定细胞

将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又分为凝胶包埋法和微胶囊法。⑴凝胶包埋法固定化（gelimmobilization)

①海藻酸盐（alginate)β-角叉胶（β-carrageenan)琼脂糖（agarose)琼脂（agar)聚丙烯酰胺（polyacrylamide)壳聚糖（chitosan)白明胶（gelatin)50微胶囊法

微胶囊法是利用天然的或合成的高分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球囊，培养基成分和代谢产物等小分子物质可以通过，细胞不能通过，使囊内成为一个微小环境。51第二节植物细胞培养和次生代谢物生产立柱培养系统

1.细胞固定化琼脂固定细胞52褐藻酸钙固定细胞无菌大量培养植物细胞

等量混合→注入尼龙网→配制4%褐藻酸钠，灭菌氯化钙溶液（2%）浸浴褐藻酸钙固定的细胞团

第二节植物细胞培养和次生代谢物生产53第二节植物细胞培养和次生代谢物生产立柱培养系统

优点：占地面积小次生代谢物产量高缺点：制作较复杂O2供应受限54立柱培养系统操作要素：取静止期细胞，并使细胞达到一定密度；控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2供应；某些种的细胞培养需光照；尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）；第二节植物细胞培养和次生代谢物生产55提高次生代谢物产量的途径生物种性：

1.选择高产的品系或细胞系；目测法，化学分析法，外因选择法；2.诱变筛选高产细胞系：化学法，物理法；3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系；第二节植物细胞培养和次生代谢物生产56提高次生代谢物产量的途径培养条件:1.培养基：

A碳源：常用蔗糖，但应因种摸索；

B氮源：常用NO3-和NH4+，（或单用或兼用）；

C生长调节剂：生长素及细胞分类素。两者的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生产具极大影响；

D供给目的产物的直接或近直接前体物质；

第二节植物细胞培养和次生代谢物生产57提高次生代谢物产量的途径培养条件:2.物理因子：

A光质和光量（适量光照）；

B温度：25~30℃；

C通气：底部通气好；

DpH值：5~6第二节植物细胞培养和次生代谢物生产58第三节植物原生质体制备与融合原生质体（protoplast):去除全部细胞壁的细胞；亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生质的原生质体（有核或无核）；微原生质体（miniprotoplast):经细胞松弛素B处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体；原生质球（球状体，spheroplast):残存少量细胞壁的原生质体；几个名词：59植物原生质体研究的意义有利于进行远缘杂交；有利于引入生物大分子、细胞器等；有利于进行细胞操作（核、叶绿体等）；60植物原生质体的制备(1)机械法：高渗处理植物（外植体，愈伤组织，液培细胞）质壁分离机械切割原生质体（亚原生质体）缺点：难，少，分生组织不宜；61酶解法1.酶的购置与纯化

市售的纤维素酶一般都是复合酶，含：纤维素酶C1；纤维素酶Cx；纤维二糖酶；果胶酶；

磷脂酶；

核酸酶；

过氧化物酶；酚类；此外，还有蜗牛酶；植物原生质体的制备(2)最好应纯化62酶解法2.取材：干净，高活性A幼嫩的根、茎、叶；B悬浮培养的细胞和体细胞胚；

无需灭菌，最好同步化；

C花粉母细胞和四分体；

分生能力强，应使用蜗牛酶；植物原生质体的制备(3)63外植体除菌：外植体肥皂水洗清水洗酒精（75%，10s）次氯酸钠（3%，15min）无菌水洗3~4次无菌滤纸吸干

植物原生质体的制备(4)64外植体酶解

除菌后叶片撕去下表皮切块放入反应液25～30℃不时轻摇反应液转绿2～4h

植物原生质体的制备(5)65外植体酶解缓冲液：pH值5.5~5.8渗透压稳定剂：糖、甘露醇、山梨醇等膜保护剂：钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸钾（0.3%）表面活性剂：Tween80适当时间适当温度植物原生质体的制备(6)66原生质体分离

过滤法离心法（低速）漂浮法（不同比重）植物原生质体的制备(7)67原生质体洗涤

以新的渗透压稳定剂或培养液轻轻洗涤2~4次;植物原生质体的制备(8)68原生质体鉴定1.直接镜检：球形，低渗破裂，荧光增白剂(UV下细胞壁显绿色荧光）2.活力测定：双醋酸荧光素（FDA）染色法：FDA进入细胞，被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不能进入死细胞；台盼蓝染色：台盼蓝不能进入活细胞；胞质环流观察；植物原生质体的制备(9)69植物原生质体的培养基无机成分:KNO3725;CaCl2·2H2O685;MgSO4560;NH4NO3288;K2HPO468;Na2·EDTA37.3;Fe2SO4·7H2O27.8;H3BO43.0;MnSO4·4H2O10.0;ZnSO4·7H2O2.0;KI0.75;Na2MoO4·2H2O0.25;CoCl2·6H2O0.025;CuSO4·5H2O0.025糖类：(mg/L)

葡萄糖68000；蔗糖250；果糖250；核糖250；木糖250；甘露糖250；甘露醇250；鼠李糖250；山梨醇250；纤维二糖250；维生素：

(mg/L)

维生素C2.0；维生素B11.0；维生素B61.0；氢化胆碱1.0；对氨基苯甲酸0.02；叶酸0.4；生物素0.01；维生素A0.01；维生素D30.01；维生素B120.01；生长调节物：

酪蛋白250；肌醇100；椰子汁20ml；NAA1.0；6BA0.5；2,4-D0.2；有机酸：

柠檬酸40；苹果酸40；反丁烯二酸20；丙酮酸钠20；V-KM培养基(mg/L)70植物原生质体再生培养方法（1）固体平皿培养法原生质体悬液2ml小培养皿MS培养基配制的1.2%agar2ml

（25~28℃，置大皿内（预加湿滤纸）腊带封口培养100~300lux，12h•d-1)分化培养基

愈伤组织成苗摇匀冷却71固体平皿培养法

优点：便于定点观察原生质体不易破裂

缺点：通气较差原生质体与琼脂混合不易掌握原生质体过于分散植物原生质体再生培养方法（1）72液体培养法原生质体置液体培养基中培养，不时轻摇，能较快生长。细胞团形成后应移到固体培养基中才能继续生长或诱导分化成苗。缺点：原生质体易受损通气较差操作较麻烦植物原生质体再生培养方法（2）73液体浅层培养法（液-固法）营养琼脂培养基（0.6%）小皿凝固放置无菌滤纸注入3mL原生质体悬浮液放大皿内（垫湿滤纸）封口保温，光照

（或不光照）轻摇愈伤组织分化培养基成苗植物原生质体再生培养方法（3）74液体浅层培养法（液-固法）

优点：通气好营养均匀生长较快

缺点：需定期添加培养基不易更换培养基植物原生质体再生培养方法（3）75小块液培法

原生质体悬浮液琼脂糖（0.8%）

切小块置液体培养基中80~100rpm，25~28℃愈伤组织移放分化培养基成苗植物原生质体再生培养方法（4）混匀倒平皿凝固

76小块液培法

优点：缺点：植物原生质体再生培养方法（4）77固体活性炭培养基

琼脂培养基+1%活性炭原生质体悬浮液

平皿培养成苗植物原生质体再生培养方法（5）混匀凝固优点：缺点：78混合培养（液体或固体培养基）

将两种原生质体混合培养

有何意义？植物原生质体再生培养方法（6）79植物原生质体融合回顾1909Kuster把洋葱根放在浓硝酸钙溶液中，见质壁分离的亚原生质体，复原时观察到亚原生质体的融合；1931Plower用针插入原生质体，使质膜和液泡膜融合；1937Michels观察到同种和不同种原生质体的融合；1960Cocking用真菌纤维素酶获得大量番茄根的原生质体；1970Power用NaNO3使燕麦和玉米的原生质体融合；1971Takete首次将烟草原生质体再生成完整的植株；1972Carlson首次经原生质体融合获得种间杂种烟草；1973Keller提出高pH高钙法诱导原生质体融合；1974

Kao提出聚乙二醇法诱导原生质体融合；1977Kao把高pH高钙法与聚乙二醇法相结合；1978Melchers获得属间杂种（番茄╳马铃薯）；1979Senda提出电激法融合原生质体；1987斯维格将电融合与微培养结合；80化学法诱导融合

（无菌操作）按一定比例混合双亲原生质体悬液；吸一份混合液于表面皿上，静置10min；滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，轻轻摇匀；

PEG溶液组成：PEG50%（MW=1560~6000)glucose0.1mol/LCaCl210.5mmol/LKH2PO40.7mmol/L

pH5.5

植物原生质体融合（1）81植物原生质体融合（2）化学法诱导融合(续前）25℃保温15~45min，不时轻摇；滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀；

高钙高pH溶液组成：

glycine50mmol/LCaCl2

50mmol/Lglucose300

mmol/LpH10.510~15min后，再滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀；10~15min后，再加1~2mL原生质体培养液，摇匀；用20mL原生质体培养液洗5次，间隔5min；加0.5mL原生质体培养液，微滴培养；82物理法诱导融合微电极法两个微电极尖端分别与两个靠近的原生质体表面接触，用5~12μA的电流刺激1~5毫秒，促成融合。平行电极法相距200μm的微电极插入原生质体溶液中，先通入交变电场，使其紧密接触成串珠状；再施以适当电脉冲，原生质体接触区发生可逆击穿而融合；植物原生质体融合（3）83不对等细胞融合（灭活一方原生质体）植物原生质体融合（4）84原生质体融合后的产物亲和杂种细胞（难）部分亲和的杂种细胞

含双方胞质及一方核含双方胞质及一方核和少量它方染色体

（细胞周期短或继代次数少的一方，染色体易保留）3.异核质杂种（少）4.嵌合植株85融和体的鉴别细胞鉴别

细胞大小色素有无细胞核大小荧光鉴别植株鉴别

形态特征染色体显带同功酶法、过氧化物酶法分子杂交法RFLP法RAPD法86杂种细胞筛选显微操作法要有：可识别标志显微操作仪能培养单个原生质体的培养基遗传互补法要有具突变标记的品种1.白化互补法2.生长互补法3.抗性互补法4.代谢互补法

87西红柿与马铃薯杂交研究进展1971年，Power提出设想1978年，Melchers用原生质体融合法获得9株杂种株1983年，Shepard亦融合成功亟待解决的问题：

1.哪些基因和条件决定果实与块茎的形成2.光合作用产物的运输方向与分配3.光合作用产物是否足以供应地上和地下部分的生长、发育需要1994年,Schoenmakers继续本研究1995年，Wolters还在研究88第四节单倍体植物的诱发与利用

一.单倍体植物的特点：株矮，叶、花、果小，生活力弱；高度不育；？89二.单倍体植物的利用：可加快培育新品种；有利于突变体的选择与利用；？第四节单倍体植物的诱发与利用（2）90三.诱导产生单倍体植株的途径：

(一）自然发生1.孤雌生殖2.孤雄生殖3.无融合生殖第四节单倍体植物的诱发与利用（3）91三.诱导产生单倍体植株的途径：

(二）人工诱导：1.花药培养：1.1选取成熟度适中的花蕾或幼穗；1.2花药预处理；

1.3选择适当的培养基与培养条件：

1.3.1只需简单培养基；1.3.2培养基尚需添加激素；1.3.3培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺；第四节单倍体植物的诱发与利用（4）921.4培养条件：

降低气压；纯N2密闭处理30~60min，或掺入O22.5~5.0%；0.5mol/L甘露醇处理2天；花药平放；适当密植；第四节单倍体植物的诱发与利用（5）931.5花药单倍体植株的形成途径：

1.5.1生殖细胞退化，由营养细胞分裂产生；（常见）1.5.2小孢子细胞不分化成营养细胞和生殖细胞，直接分裂、分化长成；（常见）

1.5.3营养细胞和生殖细胞都参与愈伤组织和胚的形成；1.5.4仅由生殖细胞分裂形成；第四节单倍体植物的诱发与利用（6）942.离体花粉培养挤压法分离花粉；自然散开法分离花粉；3.未授粉子房或胚珠的培养4.杂交法获单倍体植株第四节单倍体植物的诱发与利用（7）955.单倍体植物的加倍用秋水仙素（0.2~0.4%）处理24~48h；

加倍方式？第四节单倍体植物的诱发与利用（8）96Section5.ResearchesonArtificialSeeds

人工种子的研制（1）人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其它成分的人工胶囊；人工种子的构成：胚状体：由组织培养或细胞培养产生；人工胚乳：营养物质+激素+农药+抗生素

+除草剂等；人工种皮：抗压，保水，透气；97Charactersofartificialseeds：不受环境因素制约,一年四季进行工厂化生产；有利于保存该种系的优良性状；成本低，适合于机械化播种；可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长。

Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（2）98Thesynchronousgrowthofembryoid

胚状体的同步化生长：低温法抑制剂法分离法：分离胚性细胞团；通气法：通入N2或乙烯；渗透压法？Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（3）99Preparationforartificialendosperm人工胚乳的制备：

MS培养基+淀粉水解物+激素+抗生素+农药+除草剂等；Anyoneelse？Section5.ResearchesonArtificialSeeds

（4）100Embedmentofartificialseeds人工种子的包埋（滴注法）胚状体褐藻酸钠（终浓4%）

混匀合成胚乳

Section5.ResearchesonArtificialSeeds（5）还有其他方法？10~15minCaCl2（2.0～2.5%）圆形胶囊无菌水漂洗捞起Elvax4260处理干燥圆形人工种子101人工种子的直径由

决定；人工种子内含胚状体数目取决于

；人工种皮的厚度因

而定；

Section5.ResearchesonArtificialSeeds（6）102人工种子的干燥：

自然干燥人工干燥：22±2℃,相对湿度70±5%4~6d;胚状体由玻璃状转为不透明表示发育成熟。Section5.ResearchesonArtificialSeeds（7）干燥的目的？103病毒对植物的危害植物哪些部位可能没病毒或较少病毒？

植物哪些器官或部位无维管束（或维管束不发达）？切割外植体时是大些还是小些比较可能获得无毒组织块？组织块大些还是小些比较容易获得愈伤组织？第六节植物脱病毒技术（1）104脱除不同病毒时所取的茎尖大小一样吗？茎尖很小，实验时应注意哪些问题？为什么有人喜欢用花瓣来脱病毒？哪些外因能被用于脱除病毒？通过培养愈伤组织能脱毒吗？Why？哪些途径可使脱毒植株不再染毒？第六节植物脱病毒技术（2）105第六节植物脱病毒技术（3）茎尖脱毒

1.茎尖培养：茎尖越小越没病毒，但越小越难成活,一般要超过2万个细胞，或至少3~10mg茎尖。2.花瓣培养3.花药培养

106植物脱毒检测（4）电镜法免疫血清法

离心去渣植物组织匀浆上清液纯化病毒

待检植物匀浆上清液动物免疫抗血清（抗体）免疫检测107植物脱病毒进展（5）脱毒马铃薯（青海）染有病毒的普通马铃薯亩产约1吨，脱病毒的马铃薯亩产达4吨；全国年种马铃薯3400万公顷；脱毒草莓

红宝石色，酸甜适口，果汁丰润，果香四溢；脱毒唐菖蒲长势旺盛，花色艳丽，品质提高1~2个等级；脱毒水仙108Chapter3.AnimalCellEngineering

第三章动物细胞工程Themaincontent：动物细胞与组织培养;动物细胞融合;动物细胞核移植与胚胎克隆;淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体;染色体转移与基因转移;109Section1.CultivationofAnimalCellsandTissues

第一节动物细胞与组织培养细胞培养：细胞在体外条件下的保存和生长，在培养过程中不形成组织；组织培养：组织在体外条件下的保存和生长，继续保持组织的结构和功能；器官培养：器官的胚芽、整个器官或器官的一部分在体外条件下的保存和生长，可有器官的分化，并保持器官的立体结构和功能；110细胞系

（Cellline)原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物，包括：有限细胞系和连续细胞系；

细胞株

（Cellstrain)通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物；111一.细胞培养Section1.Cultivationofanimalcellsandtissues第一节动物细胞组织培养制备动物细胞：

培养液漂洗切割解离液无菌取出目的组织无菌组织小组织块

细胞移放培养瓶抗生素漂洗离心洗涤112动物细胞培养113Quantitativecultivationofmammalcells二.大量培养哺乳动物细胞微导管法以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维管，搭成多层培养床。管内通空气，管外为培养液；微载体法葡萄糖等聚合物形成直径50~500μm的微球悬浮培养液中细胞贴附生长微胶囊法

细胞与褐藻酸钠混合液滴入CaCl2中褐藻酸钙胶囊悬浮培养114动物细胞培养器115Tissuescultivation三.组织培养

动物表面消毒获组织小组织块

鸡胚心肌组织如何培养？无菌刀切加培养液

吸放培养瓶

静置培养（37℃）

组织块长大传代众多组织块培养液、抗生素漂洗解剖116Generationofthecultivatedcell四.培养细胞的传代

胰酶·EDTA离心培养细胞贴壁细胞游离

弃上清加新培养液

分瓶

细胞沉淀悬浮细胞培养117Non-serumcultivation

五.无血清培养血清培养的缺点：成分不确定，批次有差异，容易受污染，价格较昂贵；无血清培养基的组成：基础培养基：常用DME与F12培养基等量混合；基质：纤粘素，血清铺展因子，胎球蛋白，多聚赖氨酸，胶原；生长因子、维生素和激素等约30余种微量有机和无机物；118六.无血清培养基常用生长因子与激素胰高血糖素神经生长因子胰岛素甲状腺释放激素前列腺素E2a表皮生长因子成纤维细胞生长因子前列腺素E1生长激素黄体化激素释放激素黄体化激素甲状旁腺激素转铁蛋白母羊因子氢化考的松SometomedinC无脂肪酸牛血清白蛋白雌二醇孕酮促卵泡刺激因子睾酮三碘甲状腺氨酸亚油酸维生素A醇-生育酚维生素C腐胺CdSO4H2SeO3119Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(1)微生物污染：细菌污染；真菌污染；支原体污染；病毒污染其它细胞污染；120Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(2)污染来源：不洁动物标本；空气：操作室与超净台的过滤设备老化；器械灭菌不彻底；人员操作；血清；121Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染(3)污染物鉴别：肉眼观察；光学显微镜观察；电子显微镜观察；特殊培养观察：支原体122Keepfreefrombiologicalcontamination

七.防治污染污染源治理

细菌青霉素（200u·mL-1),链霉素（200µg·mL-1)真菌制霉菌素（100u·mL-1)

支原体卡那霉素（100µg·mL-1，不能根除)

病毒？

其它细胞1.同一工作面不能有其它细胞系存在；2.两种细胞系不能共用培养器具；123Long-termconservationofcellculture八.细胞培养物的长期保存传代法：Carrel使鸡胚心细胞传3400次，34年;液氮法：

培养细胞甘油/二甲亚砜（5~10%）混匀安瓿封装细胞/安瓿降温至-30℃（1~3℃/min）降温至-150℃（15~30℃/min）置液氮（-196℃）中低温保存细胞124AnabiosisofCell

细胞复苏

取出安瓿，投入37℃水浴，轻摇，重新形成细胞悬液

（注意防护）125Section2FusionofAnimalCells第二节动物细胞融合1958年，日本冈田善雄意外发现经UV灭活的仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合；1960年，法国Barski发现两种不同类型细胞混合培养会自发形成融合细胞；1965年，冈田善雄等采用灭活的仙台病毒融合产生第一个动物种间异核体；1966年，Yerganian用相同的方法获得能增殖的杂种细胞；126AnimalCellFusionInducedbyVirus病毒诱导融合双亲本细胞

灭活仙台病毒（疱疹病毒，副黏液病毒）细胞沉淀细胞凝集

各种融合子

混匀，冰浴20min，稍摇37℃30min洗涤选择培养基所需的融合子分别制悬液混合离心127CellFusionInducedbyChemicals化学诱导融合1974年，高国南发现PEG能诱导植物细胞原生质体融合；1975年，Pontecorvo用PEG法融合动物细胞成功；悬浮法

PEG400040~50%，处理1~2min;

离心法

PEG100030~40%，离心5~8min;

(可加5~15%二甲亚砜）128电激诱导融合

与植物原生质体相同129ScreeningHybridCells

杂种细胞筛选抗药筛选营养缺陷筛选130ApplicationofCellFusion

细胞融合的应用基因定位;体细胞杂种致瘤性分析;遗传缺陷的基因互补研究;分化功能表达调控;131Section3Monoclonalantibodyproducedbylymphocytehybridoma

第三节淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体

抗原

记忆细胞B淋巴细胞（脾）浆细胞特异抗体

融和小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤细胞2002年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验特异抗体产生产生筛选132淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术示意图133Screenofhybridoma

杂交瘤细胞的筛选(1)HGPRT基因缺陷的肿瘤细胞不能在含HAT的选择培养基上生长；B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外生长。利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的培养基中生长的融合子。HGPRT:次黄嘌呤核糖磷酸转移酶HAT：次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶134Screenofhybridoma

杂交瘤细胞的筛选(2)如何获得融和细胞？如何得到单个融和细胞？鉴别是否分泌所需抗体；融和细胞的遗传稳定性；135Section4CellReconstruction&AnimalClone

第四节细胞重构与动物克隆

将细胞的各部件进行重新组合装配，主要有核移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等技术。136TechniqueforAnimalClone动物克隆技术一.细胞核移植细胞核的制备：显微操作法细胞松弛素B处理法

细胞培养获得核质体和胞质体

离心细胞松弛素B处理如何分离？1372.童第周、牛满江等的鱼类移核研究鲤鱼囊胚期胚胎的细胞核鲫鱼去核受精卵杂合细胞

成鱼（口须和咽区象鲤鱼，脊椎骨数象鲫鱼，侧线鳞片数为中间类型，血清与血红蛋白电泳证明确为杂种鱼。）部分细胞分裂

发育核移植138金鱼与鰟鲏鱼(亚种间）

获中间性状杂种鱼草鱼与团头鲂(亚种间）

子代像草鱼，雄性不育139牛满江教授在海南大学作学术演讲

2005年10月31日，美籍华人牛满江教授来海南大学为该校师生们作了精彩的学术演讲。

当天还是牛满江教授93岁大寿。牛满江教授祖籍河北博野，1936年毕业于北京大学生物系。1953年起，发表有关核酸（RNA）诱导功能论文，引起生物学界的重视，成功地创立了“外基因学说”。140科学家发现细胞质影响克隆鱼发育新证据

中科院水生所朱作言院士发表在2005年3月美国《繁殖生物学》上的文章“细胞质对来源于转基因鲤鱼的细胞核与金鱼去核卵配合的属间克隆鱼发育的影响”报道：以转生长激素基因鲤鱼的胚胎细胞核为供体，以金鱼去核未受精卵为受体，进行属间克隆，在总共501枚操作卵中，得到7尾正常发育为成体鱼的属间克隆鱼。克隆鱼的外形特征酷似细胞核供体鲤鱼而不同于受体金鱼，PCR检测和总DNA的RAPD比较分析均证实克隆鱼的核基因组DNA来源于供体鲤鱼；在血液循环期以前的克隆胚胎中共存着来源于供体和受体两种类型的线粒体DNA，在其后续发育阶段的克隆胚胎直至克隆鱼个体中，仅存在受体细胞质的线粒体DNA；在7尾克隆鱼中，6尾个体的脊椎骨数量是26-28个，1尾个体的脊椎骨数量是31个，而通常鲤的脊椎骨数量是33～36个，金鱼的脊椎骨数量是26～28个。

141Cloneofmammalian

3.哺乳动物克隆1952年，Briggs取出蛙中胚层细胞的细胞核植入去核受精卵中，未发育；但改用囊胚期细胞核获得部分成功；1964年，Gurdon将非洲爪蟾小肠上皮细胞的细胞核取出，重复上述实验，部分发育成蝌蚪；1984年，维拉特森以未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊；1421994年，菲尔斯特用120个细胞的胚胎克隆出牛；1996年，维尔穆特用羊胚细胞克隆了羊；1997年，维尔穆特用羊乳腺细胞克隆了“多莉”羊；

143Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammalian

I.Wilmutetal.

Nature,1997,27,Feb.385(6619):810-813CelltypeNo.offusedcoupletsNo.ofrecoveredfromoviductNo.ofmorulaorblastocyststransferredNo.ofpregnancies/No.ofrecipientsNo.oflivelambMammaryepithelium277/434(63.8%)247(89.2%)29(11.7%)1/13(7.7%)1(3.4%)144Birthof“Dolly”1997年，维尔穆特用羊乳腺细胞克隆了多莉羊；

取434个绵羊乳腺细胞的细胞核与同等数量的去核卵电激融合277个融合细胞（63.8%）移入母羊输卵管发育，成功247个（89.2%）发育到桑葚胚29个（11.7%）分别植入13只母羊子宫仅生一只“多莉”（0.23%）145“多莉（Dolly）”的身世1.从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；2.

从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；3.

利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；进行早期胚胎发育；

4.将早期胚胎转移到苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。1461471997年2月27日，《Nature》封面，“多莉”(Dolly)克隆羊

148Basicpathwayforcloningmammalian

克隆哺乳动物基本途径取出体细胞核体外发育未受精卵去核易核卵早期胚胎

化学或电激诱导融合

产下幼畜假孕状态植入代孕母畜子宫中

1493.哺乳动物克隆1998年后，日、美、新西兰和中国等用体细胞核克隆出鼠、牛、猪、猴、羊等哺乳动物。2003年5月4日，美国克隆出一只骡。2003年8月6日意大利科学家宣布以自体克隆的方式克隆出一只小母马；小母马的“妈妈”也是其“姐姐”，也是“自己”。2003年9月，巴西科学家用意外死亡奶牛的卵泡中的颗粒细胞克隆出正常奶牛；2003年10月我国山东莱阳农学院克隆牛“双双”经人工授精，产下“健健”，证明克隆牛具正常生殖能力；

150自体克隆的小母马Prometea151

美国马萨诸塞州的生物技术公司AdvancedCellTechnology2001.11.25成功克隆出人类胚胎，在克隆人的技术上迈出了重要一步，不过该公司表示其目的不是为了克隆人，而是为了获得能够用于治疗帕金森综合症和青少年糖尿病等各种疾病的干细胞。1522002年内蒙古大学郭继彤等用成年耳细胞克隆山羊153我国首例异种克隆北山羊诞生2004年1月21日在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生中国首例异种克隆动物———克隆北山羊。将北山羊的体细胞与山羊的卵母细胞结合组成新的胚胎，待胚胎发育到一定阶段移植到发情的母山羊体内。克隆北山羊，雌性，出生重为2.32公斤，体长42厘米，体高35厘米。在异种克隆研究领域，目前国际上仅有印度野牛和欧洲盘羊取得成功。154

2004年2月15日，美国爱达荷大学的研究人员在西雅图的美国科学年会上展示三头克隆骡子。科学家们从骡子胚胎细胞核内提取细胞核，然后用移植手段将其与去核的马卵细胞结合形成卵母细胞。科学家们共进行了305次尝试，结果只有3个克隆骡子胚胎存活。

155Heterogeneitycloningofpanda

异种克隆大熊猫中科院陈大元研究员提出如何实施？目前进展156世界首例成年体细胞克隆水牛2005年3月17日在广西大学“８６３计划”良种牛南方繁殖中心诞生

这头克隆水牛的顺利出生，是国家“863计划”、“生物反应器”重大研究专项的一项标志性成果，中国的水牛体细胞克隆技术已经初步成熟。

1572005年4月24日韩国科学家培育出首只克隆狗“史纳比（snuppy）”汉城大学教授黄禹锡(中)

158这次研究制造的1095个胚胎只有三个成功受孕，其中一个流产，另一只小狗出生22天后因肺炎死亡，只有史纳比（snuppy

）仍然生存，成功率只有0.09%

159我国第一头体细胞克隆猪诞生

经中国农业大学李宁教授领导的课题组一年多的科技攻关，2005年8月5日，我国第一头体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生。

160意大利克隆成功14头仔猪2005年10月29日，意大利克雷莫纳繁殖技术研究中心一次性成功地克隆出了14只小猪仔161国际首例体细胞克隆亚洲黄羊临沂降生

2005年12月8日中国科学院动物研究所用山羊克隆的一只亚洲黄羊(左)与普通山羊一起在山东临沂亮相。

162克隆猛犸象？猛犸象已经消失3000多年；没有被破坏的猛犸象细胞；猛犸象精液；163

流产率高；难产率高；畸形率高；围产期死亡率高；幼年死亡率高；Worryaboutmammaliancloning哺乳动物克隆的忧虑164PersonalClone克隆人克隆人做得到吗？人的年龄会被克隆吗？人的智力能被克隆吗？克隆人的社会伦理问题;世界各国普遍反对克隆人;165克隆技术应该应用于哪些领域

——新浪网调查1克隆濒临灭绝的动物66.32%;2克隆人类部分器官用于医疗62.11%;3克隆国家保护的动物27.37%;4创造新的物种17.89%;5克隆可食用的动物11.58%;6克隆人类用于生活7.37%;7其它5.26%

166坚持克隆人的3位科学家意大利医生安蒂诺里Antinori美国医生扎沃斯Zavos邪教组织“雷利安运动”的法国科学家布瓦瑟利耶BrigitteBoisselier167Cloneofhumanembryo

克隆人类胚胎英国政府2004年8月向纽卡斯尔大学颁发了世界上第一份克隆人类胚胎的合法执照，批准这所大学进行以医疗为目的的克隆人类胚胎研究。168Section5ChromosomeTransfer

第五节染色体转移微细胞（微核体）介导

微细胞(minicell)：只含有一至几条染色体、少量细胞质和完整质膜的核质体。

优点：简化供体；受体细胞受影响小；染色体很少损坏或不损坏；

169Preparationforminicells

微细胞制备

秋水仙素0.1µg/mL，8~16h细胞松弛素B1µg/mL，4~6h供体细胞培养中期细胞大小细胞悬液12000g，10min细胞松弛素B10µg/mL，0.5~1h39000g,20min含微细胞上清液微细胞

无血清培养基悬浮滤膜过滤微细胞微细胞沉淀

线性梯度BSA悬浮分别离心微细胞170Fusionbetweenminicellsandacceptedcells

微细胞与受体细胞融合

微细胞（百万个）含植物凝集素P的无血清培养基悬浮液受体细胞10~15min，37℃凝集吸去植物凝集素P加PEG1540（30~50%）1min

吸去PEG液无血清培养基洗涤3次

16~24h，37℃加完全培养基胰酶消化，收获离散细胞分装培养瓶选择培养基筛选171DirectlyChromosomeTransfer直接转移染色体细胞同步化与染色体分离

秋水仙素处理胰酶处理离心供体细胞

4℃，20min细胞沉淀缓冲液洗涤破坏有丝分裂器37℃，10min4℃，3000rpm,10min

针筒喷射细胞破碎液密度梯度离心染色体分离大小染色体流式细胞仪172ChromosomeTransfer

染色体转移显微注射法细胞直接吞噬法染色体-磷酸钙共沉淀法染色体悬液与CaCl2（2mol/L）按16：1混匀滴入受体细胞

20min37℃,4h,CO2培育箱

加入完全培养基（20mL)加二甲亚砜（30%）10mL30s

加10mL新培养液吸去培养液胰酶消化收获细胞选择培养基

173Lipidsomepacking脂质体包装法乙醚-氯仿-染色体悬液2mL

37℃旋转蒸发卵磷脂-胆固醇混合液

100000g,30min弃上清染色体悬液，培养液脂质体悬液脂质体沉淀混悬液

滴加2h

受体细胞加PEG吸去各液体

24h加新鲜培养液选择培养基混合174乙醚：氯仿=1：1107条染色体•mL-1乙醚-氯仿染色体悬液配方：175Prescriptionforchromosomesuspension

染色体悬液配方NaCl8.0gKCl0.2gK2HPO41.15gKH2PO4

0.2g无菌水定容1000mL176Section6ResearchonHumanStemCell

第六节人干细胞研究

干细胞是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。

177EngineeringofStemCell

干细胞工程上世纪五十年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干细胞（EmbryonicStemCell,ESC），从此开创了干细胞生物学研究的历程。1970年，MartinEvans分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。接着，科学家直接从病人的身上提取某种特殊的细胞使之长成皮肤、骨胳和软骨，甚至是重要器官的一部分，这类细胞就是干细胞。1997年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。178全能性干细胞（胚胎干细胞）；多能性干细胞；专一性干细胞；

TypesofStemCells

干细胞的