肝炎(研究生)课件

肝炎病毒HepatitisVirus

肝炎病毒为主要感染肝细胞并引起病毒性肝炎的一组病毒，目前公认的人类肝炎病毒至少有5种型别，包括HAV、HBV、HCV、HDV、HEV。它们分属于不同的病毒科别。近年来还发现一些与人类肝炎相关的病毒如己型肝炎病毒(HFV)、庚型肝炎病毒(HGV)和TT型肝炎病毒(TTV)等。但其作为人类肝炎病原体的致病性仍有较大争议。此外，还有一些病毒如：CMV、EB病毒、黄热病病毒等也可引起肝炎，但不列入肝炎病毒范畴。2022/11/252微生物学教研室

不同型别的肝炎病毒，其生物学性状各不相同，但从感染者临床表现和流行病学特征上，大致可分为两类：

一类由消化道传播，引起急性感染的甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，不转为慢性肝炎或慢性携带者。

另一类为经肠道外传播，能引起急性肝炎、慢性肝炎及慢性携带者，并与肝硬化及肝癌相关的乙型、丙型和丁型肝炎病毒。2022/11/253微生物学教研室3、基因组:ss(+)RNA,长7470-7478bp。核酸有感染性5’端非编码区，可用于制作探针，进行诊断编码区，合成2235个氨基酸的多聚蛋白，切割成衣壳蛋白VP1、VP2、VP3、VP4及病毒复制所需的酶。3’端非编码区和polyA尾4、病毒的衣壳蛋白有抗原性(HAVAg)，可诱生抗体。迄今，在世界各地分离的HAV均只有一个血清型。2022/11/255微生物学教研室2022/11/256微生物学教研室5、感染模型与细胞培养

黑猩猩和狨猴对HAV易感，经口或静脉注射可使动物发生肝炎，并能在肝细胞浆中检出HAV。

动物模型的主要用途在于研究发病、免疫机制及对减毒活疫苗的毒力和免疫效果考核。

HAV也可用细胞培养，然而本病毒增殖非常缓慢，自细胞释放亦十分缓慢，一般不引起细胞病变和裂解。因此，自标本中分离HAV常需数周甚至数月，并很难获得大量病毒。2022/11/257微生物学教研室二、致病性与免疫性传染源与传播途径

HAV主要通过粪-口途径传播，传染源多为患者。甲型肝炎的潜伏期为15~50d，HAV随患者粪便排出体外，通过污染水源、食物、海产品(毛蚶等)、食具等传播而造成散发性流行或大流行。从粪便排出病毒始于发病前2周，止于发病后2~3周。

2022/11/258微生物学教研室2022/11/2510微生物学教研室三、微生物学检查法

甲型肝炎患者一般不进行病原学分离检查。1、检测病毒颗粒：免疫电镜检测病毒颗粒，敏感性为105~106个病毒/ml;2、直接检测抗原：ELISA等，3、检测核酸：分子杂交，RT-PCR。2022/11/2512微生物学教研室四.防治原则一般预防主动免疫国产:减毒活疫苗（H2株）灭活疫苗已研制成功美国:灭活疫苗被动免疫胎盘球蛋白/丙种球蛋白2022/11/2514微生物学教研室第二节乙型肝炎病毒

HepatitisBVirus

嗜肝DNA病毒包括HBV、土拨鼠肝炎病毒（WHV）、地松鼠肝炎病毒(GSHV)与鸭乙型肝炎病毒（DHBV）。本科病毒具有类似的毒粒结构、均有嗜肝特性，有明显的种属特异性，均为双链环形DNA，但其双链环形并不完整，其中有长链与短链之分。病毒复制需经过一个逆转录过程。病毒易引起持续性病毒感染。

HBV在世界范围内传播，估计在全世界有乙型肝炎患者及携带者达7亿人之多，我国是HBV感染的高发区，乙型肝炎患者及携带者有1.2亿，其中慢性乙型肝炎患者约三千万。2022/11/2516微生物学教研室一、HBV的形态和结构

电镜下可见HBV有三种不同形态的颗粒，小球形颗粒、管形颗粒、大球形颗粒，后者即是Dane颗粒为完整的HBV颗粒。管形颗粒小球形颗粒Dane颗粒2022/11/2517微生物学教研室Virion/DaneParticleDane颗粒：又称大球型颗粒，是HBV具有感染性的完整颗粒，呈球形，直径为42nm。由双层衣壳和核心构成，外衣壳镶嵌了HBsAg，内衣壳为HBcAg，核心含有病毒的DNA和DNA聚合酶。2022/11/2518微生物学教研室脂质双层HBsAg+PreSAg核心结构20面立体对称27nm内衣壳：HBcAg（HBeAg）核心：双股环形DNA，DNA多聚酶外衣壳Dane颗粒42nm7nm2022/11/2520微生物学教研室粘性末端Dane颗粒:管形颗粒:小球形颗粒比例1:120:17302022/11/2521微生物学教研室1．双链环形DNA，分子量为1.6×106-2.0×106，相当于3200bp。2022/11/2523微生物学教研室2．两链核酸的长度并不相同，长链即负链（L－），具有固定的长度为3200bp;

短链即正链（S+），则有可变的长度；约为50%-100%长链的长度。双股中有一段为单股，单股区的长短在各病毒体不等。长链和短链DNA的5’端位置是恒定的，而短链的3’端可长可短。2022/11/2524微生物学教研室3、粘性末端：两链DNA的5’末端有长达250~300个核苷酸可互相配对故DNA可保持环形。短链5’端起始位点为第1601核苷酸长链5’端起始核苷酸为第1826核苷酸两链的5’端互相配对的部分被称为粘性末端。2022/11/2526微生物学教研室2022/11/2527微生物学教研室4、病毒的粘性末端两侧分别有11个核苷酸组成的顺向重复序列（directrepeat，DR），称为DR1和DR2。

DR1起始于nt1824，序列为5’-TTCACCTCTGC；隔开223个核苷酸后为DR2，起始于nt1590，

5’-TTCACCTCTGC。负链的3’

端存在DR1部分,而正链的5’

端恰好在正链的DR2部分。这一区域是DNA成环及病毒复制的关键区，也是易整合的序列。

2022/11/2528微生物学教研室HBVDNA的基因结构

通过分子克隆及序列分析，HBV的DNA基因组较小，仅含约3200个核苷酸，负链DNA核苷酸序列含有4个开放读码框架（openreadlingframe，ORF）分别称为S,C,P和X区。嗜肝DNA病毒基因组在哺乳动物DNA病毒中是最小的一种，其编码区有广泛的重叠，随读码框架起始点的改变同一段病毒核酸可翻译出几种多肽，充分扩大其编码容量，L链可以阅读其长度的1.5倍。

2022/11/2530微生物学教研室2022/11/2531微生物学教研室S区

S基因前S2基因前S1基因

HBsAg、PreS2、PreS1AgC区

C基因、前C基因

HBcAg、HBeAg（由两个基因共同编码）

P区（与S区全部重叠，与X、C区部分重叠）DNA多聚酶

X区

HBxAg，可能作为一个转录转化因子，可反式激活细胞内的某些癌基因及病毒基因，与肝癌的发生有关。具抗原性。

2022/11/2532微生物学教研室SORF：

SORF长度为1185bp，S区基因包括有3个不同起始密码的S、preS1、PreS2区，但共用5’端的终止密码，分别编码长短不等的病毒表面抗原多肽。目前认为共有6种多肽—P24、GP27、GP33、GP36、P39与GP42，分别存在于病毒或非完整病毒的颗粒表面。2022/11/2533微生物学教研室C

ORF：

C

ORF长度为639bp，C区基因有两个AUG，分别在1814和1901核苷酸，1901位置的AUG是起始密码，而在1814和1901核苷酸间区为PreC区。PreC区无转录终止密码子，因此自PreC起始密码子开始转录翻译到C区基因3’端，获得的产物为HBeAg的前体，经过修饰加工成为HBeAg。2022/11/2534微生物学教研室PORF：长度为2532bp，是HBV基因组中最长的ORF，约占基因组75%以上，与SORF全部重叠，与CORF和XORF部分重叠。编码P蛋白。2022/11/2535微生物学教研室XORF：

XORF最小，长度为435-462bp。1、X基因包含重要的调控序列，核心启动子的调控序列区位于X基因的末端，它控制着C基因、前C基因及HBV全基因的复制圈。2、X基因在哺乳类嗜肝病毒中高度保守。3、所编码的HBxAg有反式激活作用。2022/11/2536微生物学教研室HBV基因组特点：1、DNA负链中各个ORF均为病毒抗原蛋白编码序列，基因组中一些顺式调控元件均处于各编码区内。2、HBV基因组结构紧密，编码区间相互重叠，成为编码效率最高的病毒之一。3、不同毒株间的HBV基因组存在着基因组的多态性，也是变异率发生较高的DNA病毒。2022/11/2537微生物学教研室

三病毒的酶HBV核心与其DNA同时存在的有DNA多聚酶1、P区基因产物，为一碱性蛋白，含有较多组氨酸。分子量约为9×104，需在双价镁离子存在条件下起作用，最适pH为7.5，并可在33~41℃起催化作用。2、病毒的DNA多聚酶为内源性的，故可以修补病毒基因组中的短链和缺口。2022/11/2538微生物学教研室

3、具有3种酶活性

DNA合成的引物酶活性

有能以RNA为模板合成DNA的逆转录酶活性

RNA酶H活性。故成为目前研究抑制病毒复制药物的靶。4、P区氨基酸序列有些区是高度保守的，并与逆转录病毒的依赖RNA的DNA多聚酶(RT)、依赖DNA的DNA多聚酶及RNaseH相似。与逆转录病毒RT不同之处为逆转录病毒需要tRNA作为RT的引物。而嗜肝DNA病毒的逆转录酶本身可有一部分作为引物。2022/11/2539微生物学教研室

四病毒的复制①HBV感染肝细胞，通过PreS1、PreS2和HBsAg与肝细胞受体特异吸附、结合并穿人肝细胞内，在胞质中脱去衣壳；②HBVDNA进入核内，在HBVDNA多聚酶作用下补全双链缺口，形成超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)；2022/11/2540微生物学教研室③在胞核中细胞RNA多聚酶Ⅱ作用下，以负链DNA为模板转录形成0.8kb、2.1kb、2.4kb和3.5kb的4种mRNA；④在胞质中，

0.8kbmRNA编码HBxAg，

2.1kbmRNA编码PreS2和HBsAg，

2.4kbmRNA编码PreSl、PreS2和HBsAg。

3.5kbmRNA既是HBV前基因组RNA(pregenomicRNA，PgRNA)，又可编码P蛋白、HBcAg以及HBeAg前体蛋白；2022/11/2541微生物学教研室

⑤病毒的前基因组、蛋白引物及DNA多聚酶一起进入组装好的病毒内衣壳中。在病毒DNA多聚酶的逆转录酶等活性作用下，自DR区开始，以3.5kb前基因组RNA为模板，逆转录全长的HBVDNA负股。在负股DNA合成过程中，前基因组在RNA酶H作用下RNA链被水解而消失，由DNA多聚酶再合成互补的正链DNA；2022/11/2542微生物学教研室

⑥新转录的正负链HBVDNA成为新的双股部分环状DNA，与胞质中的HBcAg形成核衣壳，进入内质网中的高尔基体，获得糖蛋白包膜后装配成完整病毒颗粒，释放于肝细胞外，重新感染其他肝细胞。

2022/11/2543微生物学教研室2022/11/2544微生物学教研室

HBV复制过程有逆转录过程，与逆转录病毒相似。病毒的DNA可整合于靶细胞的染色体中。已知整合区约有50%以上为负股的5’

末端区。

S基因可通过2.1kbRNA为信使RNA而转译HBsAg，有的HBV感染者中无病毒复制，但都长期产生HBsAg，HBsAg产生的量可远远超过病毒体数。

2022/11/2545微生物学教研室2022/11/2546微生物学教研室病毒的转录与编码的蛋白（一）病毒转录的mRNA2022/11/2547微生物学教研室2022/11/2548微生物学教研室

在HBV感染过程中至少有4种未拼接过的mRNA转录产物。

0.8kbmRNA，

2.1kbmRNA2.4kbmRNA3.5kbmRNA

每个mRNA均含有起始密码ATG2022/11/2549微生物学教研室2.1kbmRNA：长链DNA转录，2.1kbmRNA的5’端起自PreS2编码区上游约20个bp，3’端终止于C区的起始点。以1：4的比率合成外膜中、主蛋白。2.4kbmRNA：

3’端与2.1kbmRNA相同，含编码大、中和主蛋白的序列，但其主要的编码产物为外膜大蛋白。2022/11/2550微生物学教研室3.5kbRNA：前基因组RNA（PgRNA)

5’端起始点为PreC区，覆盖了整个病毒基因组，还另加约100个核苷酸长。3’端终止于C区的起始点。5’端不是均一的。起始于PreCATG上游的翻译产生前核心蛋白，经过修饰加工后成为e蛋白。起始于PreCATG与coreATG之间的mRNA是逆转录的模板，也是合成核心抗原及多聚酶产物的模板。2022/11/2551微生物学教研室0.8kbmRNA

有不同的5’端，但3’端与2.1kbmRNA、3.5kbmRNA相同。编码HBxAg。在病毒复制活跃的条件下，0.8kb转录物基本上不会出现。2022/11/2552微生物学教研室（二）编码的蛋白病毒包膜蛋白（HBsAg）由3种蛋白组成：

①主要蛋白由S基因编码，由226个氨基酸组成分子量为24×103及27×103（后者为糖基化蛋白）；②中等分子S蛋白由S及PreS2基因区编码，由281个氨基酸组成，分子量为33×103及36×103（前者带一个糖基，后者带两个糖基）；③大分子S蛋白由S、PreS2、PreS1基因区编码，由389或400个氨基酸组成，不同亚型大分子S蛋白的分子量不同。2022/11/2553微生物学教研室3种蛋白在不同颗粒表面存在的情况不同

●

Dane颗粒与管形颗粒的包膜蛋白组成相同。每一个病毒体含300-400个的主要蛋白与40-80个分子的中等分子S蛋白和大分子S蛋白；●小球形颗粒：在病毒复制者其包膜上大分子S蛋白显著低于Dane颗粒上的大分子S蛋白；无病毒复制者中全是主要蛋白，仅有1%的中等分子S蛋白2022/11/2554微生物学教研室粘性末端据Bend与Hall报告，小球形颗粒、管形颗粒、Dane颗粒三者数量比例大约为1730：120：l。2022/11/2555微生物学教研室2022/11/2556微生物学教研室

S区及其编码产物S区基因编码3种分子量不同的产物

SmallproteinHBsAgMiddleproteinHBsAg+PreS2LargeproteinHBsAg+PreS2+PreS1

2022/11/2557微生物学教研室1、表面抗原（HBsAg）

1）HBsAg(相当于HBV病毒的包膜)，是由糖基化的gp27和非糖基化的gp24亚单位，通过二硫键连接形成二聚体蛋白。是决定病毒吸附至易感细胞的成分。2）HBsAg具有抗原性，为中和抗原，但抗原性较弱。可引起机体产生特异性有保护性的抗-HBs抗体，也是制备疫苗的最主要成分。2022/11/2558微生物学教研室3）HBsAg有不同的亚型，各亚型均有共同抗原表位（称为a抗原），此外还有二组互相排斥的亚型抗原表位（d/y和w/r），按不同的组合，构成亚型。HBsAg亚型的分布有明显地区差异，并与种族有关。我国汉族以adr多见，少数民族多为ayw。因有共同的a抗原，故制备疫苗时各亚型间有交叉保护作用。4）HBsAg大量存在于感染者血中，因此是检查受HBV感染的主要标志。2022/11/2559微生物学教研室2022/11/2560微生物学教研室前S抗原：

1）PreS1及PreS2抗原具有吸附于肝细胞受体的表位，可促进病毒吸附至肝细胞表面。前S区可能与嗜肝DNA病毒严格的种属特异性有关。2）前S抗原是病毒复制的指标，preS1的存在与病毒复制的关系甚为密切，比preS2与病毒复制的正相关性更为明显。3）前S抗原的免疫原性比HBsAg强，刺激机体产生的抗体在清除循环中的病毒、阻止吸附、抑制病毒感染肝细胞等免疫防御中有重要意义。

2022/11/2561微生物学教研室2、核心抗原（HBcAg）

1）HBcAg中主要多肽的分子量为19×103—22×103

这一多肽的C端有近40个氨基酸中重复出现精氨酸，其间由脯氨酸间隔。当HBcAg在细胞内达到一定量后，这一结构可取代细胞中组蛋白，而使宿主细胞的正常基因表达发生紊乱。2）HBcAg存在于Dane颗粒核心结构的表面，为内衣壳成分。因其外表为HBsAg所覆盖，不易在血循环中检出。2022/11/2562微生物学教研室3）HBcAg抗原性强，能刺激机体产生抗HBc抗体。抗HBcIgG在血中持续时间较长，为非保护性抗体；而抗HBcIgM的存在则常提示HBV处于复制状态。4）HBcAg定位于感染细胞核内，也可在细胞浆与膜上表达。HBcAg在感染的肝细胞表面表达，是CTL识别并清除HBV感染细胞的靶抗原之一。2022/11/2563微生物学教研室3、e抗原（HBeAg）1）是由PreC及C基因编码，整体转录及转译后成为

HBeAg，HBeAg与HBcAg虽有部分相同的核苷酸序列，但各自还有特异的抗原性。2）HBeAg为可溶性蛋白质，可自感染肝细胞分泌入血循环中。

●HBeAg与Dane颗粒出现的时间平行；

●与DNA多聚酶的消长基本一致，故HBeAg已作为体内有HBV复制及血清具有强感染性的一个指标。

同时也是母婴传播的免疫学指标。2022/11/2564微生物学教研室HBeAg2022/11/2565微生物学教研室3）HBeAg可刺激机体产生抗体，此抗体对HBV感染有一定的保护作用。

◆但变异的毒株C区基因可发生点突变，在PreC区出现终止密码子，因不产生HBeAg。

对病毒而言：HBV可以逃逸机体针对HBeAg的免疫杀伤作用，不能被抗-HBe及相应的细胞免疫所识别。

对抗HBV治疗而言：血清中HBeAg由阳性转为阴性并不意味着HBV复制的停止及致病作用减弱。变异株可在抗-HBe阳性的情况下仍大量增殖。2022/11/2566微生物学教研室HBxAgX蛋白由X基因区编码，由145-154个氨基酸组成，分子量为24×103-28×103，其抗原性很弱。具反式激活作用。可反式激活HBV增强子和多个启动子，促进S、C蛋白的表达及核心颗粒的形成。

HBxAg反式激活的核苷酸序列很广泛，涉及多种病毒，如在Hela细胞中的HIVLTR等；有数种细胞的调控因子也可被HBxAg反式激活，如MHCⅠ类抗原基因等。2022/11/2567微生物学教研室六病毒分型与变异（一）病毒分型血清型：根据HBsAg抗原性的差异，各亚型均有共同抗原表位（称为a抗原）及二组互相排斥的亚型抗原表位（d/y和w/r），按不同的组合，构成HBsAg9个亚型，即adrq+，adrq-adw

2、adw

4、ayr，ayw1、ayw2、

ayw3、

ayw4

。

HBsAg亚型的分布有明显地区差异，并与种族有关。我国汉族以adr多见，少数民族多为ayw。2022/11/2568微生物学教研室基因型是指按照HBV核酸序列的差异程度进行分型。HBV基因型可分为A～H共8个基因型。不同地区流行的基因型不同，美国和西欧主要是A型，我国及亚洲地区主要流行的是B型和C型。

HBV基因型与血清型的对应关系大致为A型与adw，B型与adw，C型与adr、adw和ayr，D型与ayw,adr。HBV基因型比血清型能更精确地提供HBV基因变异的信息。2022/11/2569微生物学教研室

(二)病毒变异

HBV有逆转录的复制过程，其基因变异较一般DNA病毒为高。HBV在宿主体内时，在各种因素的选择压力下可发生突变。在宿主体内，突变是HBV适应宿主细胞环境和抵抗宿主免疫保护的一种自然选择，可发生于自然感染过程中，也可在乙肝免疫接种、特异性免疫治疗或干扰素治疗的刺激下发生。2022/11/2570微生物学教研室

在HBV的4个ORF区(S区、P区、C区和X区)中均可发生变异，变异呈多样性，其后果是：①突变株可逃避免疫，使自然感染或疫苗诱导产生的抗-HBs不能中和突变株而使感染继续存在；②突变株在体内复制，但常规检测方法不能检出，可逃避诊断；③突变株对药物产生抵抗性，可逃避治疗。HBV基因突变无疑增加了乙肝预防、诊断和治疗的复杂性。

HBV突变可能是病毒传播、致病和导致严重转归的重要因素。目前HBV基因组变异的研究主要集中在以下几个方面：2022/11/2571微生物学教研室1．前C／C区变异如前C区1896位核苷酸发生

GA的点突变，使原来编码色氨酸(TGG)变成终止密码，提前终止HBeAg的表达，故此时HBeAg阴性并不意味HBV的清除或复制水平的减低。临床上表现为HBeAg阴性，而病情处于活动状态的慢性乙型肝炎。又如前C区1862位核苷酸由GT，使17位氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸，其结果是HBeAg前体被信号酶裂解。HBeAg前体在肝细胞内过量积聚，成为细胞毒性T细胞(CTL)的靶抗原而受过度的免疫攻击，使肝细胞大量坏死而致重症肝炎。2022/11/2572微生物学教研室2、前S／S区变异S区第145位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸，可以引起HBsAg“a”决定族的抗原性发生改变，明显低于野毒株。从而导致免疫逃逸及疫苗接种失败等现象，或者引起血清中同时出现HBsAg和抗-HBs。此外，在编码“a”决定簇的基因区前，在S基因编码的第122～124位之间出现插入变异，则可发生HBsAg阴性的HBV变异株感染。2022/11/2573微生物学教研室

3．X区与P区变异自然存在的P基因单位点错义突变致使前基因组RNA无法包装到核心颗粒，从而造成HBV复制缺陷。2022/11/2574微生物学教研室动物模型与细胞培养

黑猩猩是对HBV最敏感的动物，常应用来进行HBV的致病机制研究和疫苗效价及安全性检测。南非学者（1976）报道了从一个HBsAg阳性原发性肝癌组织建立的细胞系（PLC/PRF/5）中找到HBsAg的复制。但未见到Dane颗粒。至今HBV尚不能在常规细胞系中分离及培养，目前采用的细胞培养是病毒DNA转染细胞。将HBVDNA导入人肝癌细胞中，病毒的基因可整合复制，在细胞中表达HBsAg、HBcAg并分泌HBeAg。有些细胞株还可持续地产生Dane颗粒。这些细胞培养系统可用于抗HBV药物的筛选、疫苗制备及HBV致病机制的研究等。2022/11/2575微生物学教研室加热60℃10小时；煮沸100℃，10min高压灭菌121℃，20min干烤160℃，2h0.5%过氧乙酸、3%漂白粉浸泡30min-20℃20年、37℃7天仍有传染性。强!抵抗力2022/11/2576微生物学教研室2022/11/2577微生物学教研室八、致病性与免疫性（一）传染源

HBV主要的传染源是患者

无症状HBsAg携带者。

0.00004ml含病毒血液足以使人感染。HBsAg阳性患者血液中HBsAg浓度可达1012~1014/ml。2022/11/2578微生物学教研室（二）传播途径

1、血液、血制品传播主要通过医源性方式，如输血、注射、外科或牙科手术、针刺等。2、母婴传播人群中HBsAg携带者中约有1/3来自母婴传播（我国至少有3千万HBsAg携带者源于此）。主要是围产期感染及分娩过程感染，宫内传播（即通过胎盘感染）和产后感染新生儿。3、性接触传播

HBsAg阳性男性精液肯定有传染性，动物实验已证实。4、其它传播方式如当口腔粘膜（包括牙龈）破损时，有可能经口感染，通过昆虫也可能传播。2022/11/2579微生物学教研室（三）致病机理L.CV.Ag1.肝细胞膜表达新抗原引起免疫攻击自身AgLSPAg-Ab-CADCCMTcNK2022/11/2580微生物学教研室2.ICsediment→typeⅢallergy肝外沉积:肾小球肾炎/关节炎肝内沉积:急性肝坏死(暴发型肝炎)2022/11/2581微生物学教研室3.HBVDNA–LiverCellDNA↓integrationLiverCelltransform2022/11/2582微生物学教研室4.HBVvariation5.HBVproteinsHBcAgaccumulateinnucleus:cytoclasis/fusionpreSpro.accumulateinplasm:injureL.C.2022/11/2583微生物学教研室6.HBV(-)immunocompetence(-)IL-2(-)IFN(-)HLA-Iexpress→CTLeffect↓infantinfection2022/11/2584微生物学教研室感染HBV的临床类型Tc免疫正常↓killHBV-cell↓Ab清除游离HBV↓acuteinfection

(90%)Tc免疫↓V.变异↓killfaulty↓Ablack↓chronicinfection

(10%)Tc免疫↑V-Cell↑↓livercellsnecrosis↓暴发性肝炎无免疫HBV耐受↓不杀伤靶细胞↓Agcarrier(12%)2022/11/2585微生物学教研室HBV感染机体，可刺激机体产生一系列的抗体与细胞免疫。1、抗HBs是肯定有中和病毒作用的抗体。2、对HBcAg的CTL。在清除HBV感染中有一定作用。3、抗PreS2及抗PreS1可能通过阻断HBV吸附于肝细胞的表面受体而起作用。4、抗-HBe可能通过与肝细胞表面表达的HBeAg结合后，通过补体介导而参与破坏病毒感染的肝细胞。5、抗HBc无直接保护作用，因乙型肝炎患者多数均有高效价的抗-HBc。2022/11/2586微生物学教研室HBV与原发性肝癌

虽然目前尚无HBV致肝癌的直接证据．但在土拨鼠中发现，当初生时即感染上拨鼠肝炎病毒(WHV)，经3年饲养后100％发生肝癌，而未感染WHV的动物无一只发生肝癌。在人群中的流行病学研究显示，HBsAg携带者较无HBV感染者，发生肝癌的危险性高217倍。因X蛋白(HBxAg)可反式激活癌基因，可能是HBV致癌的起动因子，需经一系列过程导致肝癌的发生。

2022/11/2587微生物学教研室Maupas等就HBV与原发性肝癌的密切关系作了以下论证：①乙型肝炎传染形成高度地方性的区域与原发性肝癌流行率高的地区，在地理上有相关性；②在地方性与非地方性区域，男性HBsAg慢性携带者中发生原发性肝癌的危险是相对恒定的。在此种人群中，原发性肝癌的年死亡率在250-500/10万人。粗略估计全世界HBsAg慢性携带者约1.75亿，原发性肝癌的年发生率为35万例。这就指出与HBV相关的原发性肝癌是在全世界人口中较为流行的癌症之一；③HBV感染可先于并经常伴随原发性肝癌的发生；2022/11/2588微生物学教研室④原发性肝癌常发生于与乙型肝炎病毒有关的慢性肝炎或肝硬化人群；⑤在原发性肝癌患者取出的组织中存在HBV的特异性DNA及抗原；⑥有些原发性肝癌细胞系已能在培养中产生HBsAg，并已证明HBV的DNA已能整合到这些细胞的基因组中。此外，含有HBV相似的生物化学、生物物理特性，它在其宿主可诱发肝硬化及原发性肝癌。在中国和美国的北京鸭（Anasdomesticus）中已分离出一种相似的病毒。2022/11/2589微生物学教研室但对上述资料解释仍有不同观点：①HBV能引起致癌或促癌作用，须配合其它如遗传、内分泌、免疫与环境因素而导致肝癌；②肝癌是与HBV无关的因素引起，但这些癌细胞可能对HBV特别易感，以致持续携带病毒。2022/11/2590微生物学教研室

九、微生物学检查法

●样品的采集

1、血液：用于抗原抗体及核酸检测，病毒分离

2、组织：病毒分离、核酸或抗原检测

3、唾液：病毒分离、核酸或抗原检测

4、乳汁：病毒分离、核酸或抗原检测

5、阴道分泌物、精液：病毒分离、核酸或抗原检测所有标本均-20℃保存。2022/11/2591微生物学教研室●病毒的分离培养（1）动物实验：家鸭，土拨鼠等（2）细胞实验：人肝细胞系、原代肝细胞培养●实验室诊断方法（一）HBV抗原抗体的检测

HBV的血清标志物（HBV–M）即三大抗原抗体系统，是判断HBV感染状态主要的、常用的指标。常用ELISA和化学发光法。各项HBV–M的意义是：2022/11/2592微生物学教研室◆HBsAg阳性：1、表示感染过HBV2、急性乙型肝炎或慢性肝炎，无症状携带者。

3、与HBV相关的肝硬化和原发性肝癌◆抗-HBs阳性：1、已恢复或痊愈

2、注射后疫苗有免疫力，

3、隐性感染的健康人，产生了免疫力。2022/11/2593微生物学教研室另外，PreS抗原与病毒复制有关，其含量变化与外周血中HBVDNA的含量成正比，出现早，消失快，因此PreS抗原的检出可作为HBV复制的指标。若抗-PreS出现于急性乙肝恢复期的早期，表示病毒正在或已被清除，预后好。抗-PreS存在时间短暂，时间为6-12个月，若抗-PreS迟迟不出现，则预后较差。2022/11/2594微生物学教研室◆抗-HBcIgM阳性：

1、提示仍有病毒复制，

2、是HBV急性感染和慢性活动性肝炎的重要指标。◆抗-HBcIgG阳性：主要见于恢复期或慢性感染，可伴随感染者终生存在。2022/11/2595微生物学教研室◆HBeAg阳性：

1、表示病毒复制，患者血液有传染性，同时也是母婴传播的免疫学指标。

2、急性乙肝的辅助诊断

3、判断预后的指标◆抗-HBe阳性：表示机体已获得一定的免疫力，病毒复制减少或停止，传染性减弱或消失。（出现变异株者例外）。2022/11/2596微生物学教研室（二）、血清HBVDNA检测

DNA阳性（大于103

拷贝/ml）表示病毒处于复制状态，患者血液有传染性，母婴传播的免疫学指标。方法：

1、PCR检测HBVDNA2、核酸杂交检测HBVDNA

两对半检测的结果分析（表）两对半检测的应用乙型肝炎的特异性诊断、筛选输血员、流行病学调查、预后参考。

2022/11/2597微生物学教研室HBsAgHBeAg抗HBs抗HBe抗HBc

结果分析

+————HBV感染或无症状携带者

++———急性或慢性乙肝，或无症状携带者++——+急性或慢性乙肝（传染性强，“大三阳”）

+—-++急性感染趋向恢复（“小三阳”）——+++/—既往感染恢复期————+既往感染或“窗口期”——+——既往感染或接种过疫苗2022/11/2598微生物学教研室十、防治原则应针对传播途径采取综合性预防措施：

1、严格筛选输血员，对血液制品严格检查。2、防止医源传播，病人血液、血清分泌物以及可能有

HBV污染的器具、物品应进行严格消毒，医用器械均须严格灭菌。3、对具有传染性的患者进行隔离治疗，对无症状HBV

携带者应随访观察。4、乙肝疫苗优选接种对象：2022/11/2599微生物学教研室新生儿、医务人员。密切接触HBsAg阳性者，而本身又无免疫力者。高危人群：如血液透析、肾移植者。

第一代为血源疫苗第二代为基因工程疫苗第三代为多肽疫苗或DNA疫苗。5、应急预防措施，注射高效价抗-HBs（HBIg）。

2022/11/25100微生物学教研室第三节丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)于1989年方被命名，1991年被归属于黄病毒科，过去被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。虽然丙型肝炎作为疾病早就被发现，但因本病毒不能在体外培养，在血流中的含量又很少，约100个病毒体／ml。故对HCV的认识主要根据黑猩猩动物实验及分子生物学技术研究所得的结果。2022/11/25101微生物学教研室1、HCV是一类有包膜结构的单正链RNA病毒。病毒体呈球形，大小为40-60nm，包膜蛋白厚7nm，有刺突结构。2、HCV对氯仿、甲醛、乙醚等有机溶剂敏感。

可感染黑猩猩并在体内连续传代，引起慢性肝炎。一、生物学特性2022/11/25102微生物学教研室二、病毒的基因结构

HCV基因组长度约9.5kb，由9个基因区组成自5，端开始，依次为5，端非编码区、核心蛋白区(core，C区)、包膜蛋白-1区(El区)、包膜蛋白-2/非结构蛋白-1区（E2/NS1区）、非结构蛋白-2区(NS2区)、非结构蛋白-3区(NS3区)、非结构蛋白-4区（NS4区）、非结构蛋白-5区(NS5区)和3’端非编码区。其中C区和El区为病毒结构蛋白编码区，即编码病毒的衣壳及包膜蛋白。2022/11/25103微生物学教研室

5，端非编码区的核苷酸序列保守性强，可用于基因检测诊断。El、E2/NS1区基因易发生变异，使包膜蛋白的抗原性改变而不被原有的抗包膜抗体识别，使病毒得以持续存在，这可能是HCV易引起慢性丙型肝炎的原因之一。C、NS3及NS4、NS5区基因的表达产物，可用于检测患者血清中的抗-HCV。2022/11/25104微生物学教研室HCV基因排列顺序依次为：5’UTR-C-El—E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-UTR3’。由5’端非翻译区(untranslatedregion，UTR)、一个单一开放读码框(ORF)和3’端非翻译区组成。(3010~3030aa)2022/11/25105微生物学教研室

5’NCR由319~341个核苷酸组成，含有多个6~7个核苷酸组成的重复序列，其5’端前22个核苷酸形成一发夹结构，是病毒复制酶的识别部位；5’端非翻译区极少变异，为保守的基因序列，参与蛋白翻译的启动。目前作为基因诊断的靶区域。

3’端还有两处回文结构。3’非翻译区有一个高度保守的98个氨基酸保守区。2022/11/25106微生物学教研室HCV基因组仅有一个开放读码框，ORF编码一条约3008～3037个氨基酸的多蛋白前体，该前体蛋白在宿主细胞内分别经宿主细胞基因及病毒基因编码的蛋白酶切割后，至少加工成10种蛋白。如病毒结构蛋白：核心蛋白(C)、包膜蛋白(El、E2)、P7蛋白及病毒的非结构蛋白：NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。2022/11/25107微生物学教研室三、病毒结构蛋白与非结构蛋白

(一)病毒的结构蛋白2022/11/25108微生物学教研室1．核心蛋白C

病毒的核心蛋白，分子量23000Da。编码C蛋白的基因区位于N端，由573个核苷酸组成，编码191个氨基酸。加工成熟的C蛋白约有172～182个残基，在病毒株间相对保守。

◆

C蛋白构成病毒核衣壳蛋白，◆具有很强的抗原性，可诱发多数感染者在感染早期产生抗核心抗体，且持续时间长。◆另外，C蛋白还参与调控病毒基因转录、细胞增殖与死亡、脂类代谢等，并在病毒感染的免疫耐受和免疫抑制中起重要作用。2022/11/25109微生物学教研室2．包膜蛋白El和E2El和E2是位于病毒包膜上由病毒编码的糖蛋白。分子量分别为33000Da(gp33)

和70000Da(gp70)。E蛋白变异性大，疏水性强，抗原性弱。El和E2可相互作用形成非共价的异源二聚体。E蛋白与病毒的侵袭力有关，病毒感染时借助El和E2与宿主细胞表面的受体相结合，侵染细胞。3．p7p7是从E2蛋白上切割下来的一段含有63个氨基酸的多肽，是一种小的跨膜蛋白。可能参与病毒的组装和膜运输。2022/11/25110微生物学教研室(二)病毒的非结构蛋白

1．NS2

由NS2C末端的1/2、NS3N末端的1/3共同组成一种依赖Zn2+的蛋白酶，在宿主细胞蛋白的调控下先将NS2-NS3复合物从聚蛋白前体上切割下来，再将NS2与NS3分割开。NS2-NS3蛋白酶在HCV基因组的复制过程中起重要作用。2022/11/25111微生物学教研室

2．NS3

基因位于丙型肝炎病毒全基因组序列约3300～5200nt位点，编码600多个氨基酸，分子量略大于60kD，NS3N末端与NS4A特定部位形成NS3-NS4A复合体，具有丝氨酸蛋白酶活性。

◆丝氨酸蛋白酶主要负责切割HCV聚蛋白上的NS3／NS4A、NS4A／NS4B、NS4B／NSSA和NS5A／NS5B连接位点。

◆

NS3蛋白具有很强的抗原性，在大多数HCV感染者体内都会产生较高滴度的特异性抗体。NS3基因在HCV不同型和亚型中的变异性较大。2022/11/25112微生物学教研室

3．NS4A

由54个氨基酸组成的小蛋白质。可以形成α-螺旋。◆参与NS3-NS4A蛋白酶在细胞膜上的锚定过程。

◆NS4A蛋白的中间结构域还参与调节NS3的丝氨酸蛋白酶和解旋酶活性，主要为负调节作用。2022/11/25113微生物学教研室4.NS4B

为分子量27kD的疏水蛋白。目前推测其作为NS3-NS4A蛋白酶的一种辅助因子参与HCV基因组的复制和翻译过程。

5．NS5A

为高度磷酸化的非结构蛋白，分子量为58kD。目前证实有很多激酶参与了NS5A的磷酸化过程，而且NS5A的磷酸化水平在HCV基因组的复制和翻译过程中起调节作用。NS5A存在干扰素敏感性决定位点，与干扰素治疗效果有关。

6．NS5B

是HCV复制所必需的RNA依赖的RNA聚合酶。由591个氨基酸组成，在HCV复制过程起着至关重要的作用。2022/11/25114微生物学教研室抗体临床意义C（c22）HCV感染后出现很早，阳性率也很高，在HCV的检测中发挥重要作用NS3（c33c）抗原的免疫原性很强，相应的抗体滴度也高，

HCV感染后出现很早，同C区抗体一样在HCV的检测中发挥重要作用NS4（c100）HCV感染后出现延迟，持续阳性可能与疾病的慢性化有关NS5HCV感染后出现较早，可用于急性感染诊断2022/11/25115微生物学教研室四、病毒的基因分型

HCV基因组具高度的遗传变异性，根据编码病毒RNA聚合酶的NS5B基因区核酸序列同源性分析，将HCV分为6个主要基因型。且HCV基因型分布存在明显的地理差异，在亚洲，HCV主要有l、2、6型，中国以1b型为主，也存在2a、2b、3b型感染及混合感染。由于病毒易发生变异，HCV在体内呈准种分布（5%），基因组由优势株及一群密切相关但又不同的变异株构成，这一病毒群称为准种。HCV准种可能是影响感染转归的重要因素。

2022/11/25116微生物学教研室

目前对HCV的基因分型可通过核苷酸测序分析、PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)和型特异探针杂交等方法对HCV5’端非编码区和其相邻的核心区进行分析，5’非编码区的分析主要用于型的鉴别，核心区的分析主要用于亚型的鉴别。HCV核心区同源率若大于94％，为同一亚型；介于89％和94％之间为同一型的不同亚型；同源率小于89％为不同型。2022/11/25117微生物学教研室HCV3/4无症状为亚临床型感染1/4有症状为临床型感染1/3为黄疸型2/3为无黄疸型50%转为慢性10%-20%可发展为肝硬化或肝癌。慢性丙肝六、致病性与免疫性

世界约有1.7亿感染者，我国人群抗体阳性率约为1%-3%，母婴传播率为3%-6%。传播途径

HCV主要通过输血传播(43%)临床表现2022/11/25118微生物学教研室致病机制

1、HCV长期在肝细胞内复制，引起肝内淋巴细胞浸润及肝细胞坏死。

2、免疫复合物沉积。

3、CTL免疫病理反应

：杀伤肝细胞、诱导肝细胞凋亡。免疫性

丙型肝炎患者恢复后，仅有低度免疫力。迄今未检出HCV有中和抗体。2022/11/25119微生物学教研室HCV感染慢性化机制基因易发生突变感染多为低水平感染在肝细胞和肝外组织均有病毒复制病毒持续与机体免疫功能紊乱相关自身免疫反应的诱生参与肝细胞的损伤2022/11/25120微生物学教研室HCV与HBV不同点:感染类型:隐性感染者更多临床类型:更易转为慢性/肝硬化/肝癌致病机制:HCV-肝内复制-直接损害肝细胞免疫特点:抗原性弱/变异多→免疫耐受/持续感染/无中和抗体/无疫苗2022/11/25121微生物学教研室七、微生物学检查法(一)HCVRNA检测

急性感染期：患者感染HCV后1-3周，外周血清中即可检测出HCVRNA，HCVRNA出现早于HCV抗体，在急性期只有50％~70％的患者抗-HCV阳性，3个月后90％患者抗-HCV阳性。

慢性感染期：HCVRNA持续阳性6个月以上为慢性感染。目前HCVRNA的检测主要有荧光PCR和PCR-ELISA方法。大于103拷贝/ml为阳性。2022/11/25122微生物学教研室

(二)HCV抗体的检测

HCV抗体检测分为筛选试验和确认试验。筛选试验主要采用ELISA方法，确认试验采用重组免疫印迹试验(recombinantimmunoblotassay，RIBA)。2022/11/25123微生物学教研室1．ELISA由于HCV感染人体后机体所处的免疫状态和感染阶段不同，机体针对病毒特定蛋白产生的特异性抗体出现的时间也不同，HCV结构区和非结构区的每一片段抗原都有不同的血清学诊断意义。目前广泛使用的抗HCV-IgGELISA第三代试剂，是将HCV的C、NS3、NS4和NS5作为抗原，检测患者血清或血浆中的抗HCV-IgG。这种方法有较好的敏感性，但可能会出现假阳性。对测定比值不高的阳性结果应做确认实验加以证实。2022/11/25124微生物学教研室2．重组免疫印迹试验(RIBA)选用重组抗原c100p，c33c，c22p，NS5，以及两个质控对照超氧化物歧化酶(SOC)和IgG。包被在硝酸纤维素膜上，加入待检血清和酶标记的第二反应系统，根据底物显色来判断结果。2022/11/25125微生物学教研室

(三)临床HCV感染的诊断

▲HCVIgG抗体仍是筛选慢性丙型肝炎主要指标；

▲HCVIgM抗体存在与否不能提示病毒复制状态。由于HCVIgM抗体检出率较低，如只检测此项容易造成漏检；

▲HCVRNA是反映病毒复制的可靠指标。2022/11/25126微生物学教研室1．急性丙型肝炎感染的诊断

(1)HCVRNA阳性，抗-HCV阴性，提示患有急性丙型肝炎；

(2)HCVRNA和抗-HCV均阴性，可排除急性丙型肝炎；

(3)HCVRNA阴性，抗-HCV阳性，可排除急性丙型肝炎；

(4)HCVRNA和抗-HCV均阳性，应注意鉴别急性丙型肝炎与慢性丙型肝炎的急性发作；2022/11/25127微生物学教研室2．慢性丙型肝炎感染的诊断(1)HCVRNA和抗-HCV均阳性，可确诊为丙型肝炎；(2)HCVRNA阳性，抗-HCV阴性，可见免疫抑制治疗患者、严重免疫缺陷患者；(3)健康普查中抗-HCV阳性者，可检测HCVRNA来确定是否为慢性丙型肝炎感染2022/11/25128微生物学教研室3．婴儿丙型肝炎垂直感染的诊断(1)婴儿出生后18个月仍能检测到HCV抗体；(2)婴儿出生后3-6个月可检测到HCVRNA，并且需两次阳性；(3)婴儿血清ALT升高；(4)母亲和婴儿病毒基因型一致。2022/11/25129微生物学教研室(四)HCV感染患者漏诊和误诊可能的原因1．病程处于窗口期；2．患者免疫系统受到抑制、免疫功能低下；3．病毒株的变异；4．受检测的血清中病毒拷贝数过低；5．血清的交叉反应。2022/11/25130微生物学教研室九、防治原则

1、严格筛选输血员，血制品要严格检查。

2、IFN为首选药物。聚乙二醇干扰素λ联合利巴韦林治疗12周可获得比聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林治疗方案更高的完全早期病毒学应答率、、、、3、百时美施贵宝研发的小分子抗病毒药物——NS5A复制复合体抑制剂BMS-790052的临床试验中发现，其联合聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗基因1型初治慢性丙肝患者结束后，停药后24周持续病毒学应答率可达83%。

2022/11/25131微生物学教研室第四节

丁型肝炎病毒1977年，意大利学者Rizzetto在用免疫荧光法检测乙型肝炎患者的肝组织切片时，发现肝细胞内除HBcAg外，还有一种新的抗原，当时称其为δ抗原。通过黑猩猩实验发现，自肝提取的这种因子可引起实验动物感染。以后证实这是一种缺陷病毒，必须在HBV或其它嗜肝DNA病毒辅助下才能复制，现已正式命名为丁型肝炎病毒(hepatitisDvirus，HDV)。2022/11/25132微生物学教研室一、生物学特性1、HDV为球形，直径35--37nm，基因组为一单负链环状RNA，长度为1.7kb，是已知动物病毒中最小的基因组。HDVRNA可编码一种HDV抗原(HDAg)。2、HDV颗粒由HBsAg构成其外壳，内含HDVRNA及与之结合的HDAg。HBsAg可防止HDVRNA水解，在HDV致病中起重要作用，它是由同时感染宿主细胞的HBV提供的。

HDAg的分子量约68000，有24000和27000(P24和P27)两种多肽形式，主要存在于肝细胞内，在血清中出现早，但仅维持2周左右，故不易检测到。2022/11/25133微生物学教研室3、黑猩猩及土拨鼠可作为HDV临床研究的动物模型。2022/11/25134微生物学教研室二、致病性与免疫性

1、传播途径

HDV传播途径与HBV相似。