鼠疫检测新技术、新方法课件

鼠疫检测新技术、新方法一、核酸检测技术（PCR检测）二、标记检测技术（ELISA，胶体金）一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。

核酸的分离与纯化内容：聚合酶链式反应(PCR技术)

核酸杂交技术材料的前处理细胞破碎，核酸释放核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解缓冲液全自动核酸、蛋白提取仪聚合酶链式反应（PCR技术）

简史：1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人发明聚合酶链反应（PCR），随后，Mullis所属公司PE推出第一台PCR自动化热循环仪。基本原理：凝胶成像系统凝胶电泳系统PCR类型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆转录PCR

PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准：PCR扩增（fra+

pla）

+

胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物2.鼠疫病人血液、痰液或尸检标本3.自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）4.媒介昆虫样品处理方法1.煮沸法2.DNA提取试剂盒3.CTAB法4.氯仿抽提法鼠疫菌PCR检测反应程序预变性95℃5min1个循环变性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min变性72℃5min30个循环M123456内参基因PlaFra鼠疫PCR检测电泳结果判定阳性结果：内参基因+Pla+Fra阴性结果：内参基因二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。标记检测特点：标记免疫技术=免疫技术+

标记技术抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性ELISA技术原理：1.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.2.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.3.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.4.加入底物,通过颜色变化来测定.ELISA的类型：间接法双抗夹心法ELISA结果判读：1.目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。（+++）深黄棕色；（++）浅黄棕色；（+）颜色明显可见；（-）无色或颜色很浅2.ELISA检测工作站

标本OD/阴性OD>2.1位阳性。

ELISA操作注意事项：（一）加样

加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，每次加标本应更换吸头，以免交叉污染。（二）保温

在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。

为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。（三）洗涤

洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。2、将洗涤液注满孔板。3、放置3分钟，略作摇动。4、吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3-4次，又是需洗5-6次。（四）显色和比色

显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。胶体金检测技术：原理：将F1-McAb抗体以