分子医学技能实验课件：本科实验一-基因组DNA的提取与纯化

分子医学技能中山医学院生物化学与分子生物学教研室银巍Email：yinwei@分子医学技能中山医学院银巍

关于分子医学实验课程严格遵守实验室管理是必须的关于课堂设计和教学注意事项课程要求及考核关于实验教学关于实验教学

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。

一、基因组DNA的提取与纯化

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文一、基因组核酸分离纯化的总原则：

保证核酸一级结构完整排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机熔剂、金属离子、外源DNA、

RNA等）

核酸分离纯化的总原则：核酸提取的主要步骤

主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的主要步骤核酸提取注意事项减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高温等）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）

核酸提取注意事项二、人基因组DNA的制备实验目的及意义

1.从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA2.掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理二、人基因组DNA的制备

基因组DNA提取原理

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。基因组DNA提取原理利用基因组DNA较长的特性，可以

分离纯化基因组DNA的方法有很多种：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。但原理相似，都是利用两种DNA的差异来分离的，因此它们有共同的步骤：

①裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶②除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质；③析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。分离纯化基因组DNA的方法有很多种：

实验材料及试剂

材料：人口腔上皮细胞试剂：抽提缓冲液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAaseSDS，蛋白酶K，饱和酚氯仿/异戊醇（24:1）

75%及95%乙醇

TE缓冲液：Tris，EDTA实验材料及试剂主要试剂的功能

抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成.SDS的作用是裂解细胞.EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA

酶对DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白质。酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA主要试剂的功能取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用15ml离心管（4000rpm

10min）收集细胞沉淀

①

（台式离心机的使用，平衡）

加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5mlEP管

（微量移液器的正确使用）混匀，65℃温育15min

加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀（不要震荡！）P13实验步骤及注意事项（一人一组）：

取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3m12000rpm5min②，400ul上层水相转移至新的EP管

（高速离心机的使用与安全意识）

加入400ul等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀12000rpm5min，400ul上层水相转移到新的EP管

加入2倍体积800ul95%的乙醇，颠倒混匀12000rpm5min

③

12000rpm5min②，400ul上层水相转移至新的E分子医学技能实验课件：本科实验一-基因组DNA的提取与纯化弃上清，沉淀中加入1ml75%乙醇

12000rpm2min

④

轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min

加入30l0.1×TE溶液，42℃助溶10min后4℃保存

弃上清，沉淀中加入1ml75%乙醇实验结果及其分析

定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳定量分析：紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度实验结果及其分析常见问题：

1、提取的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。

2、提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。

3、与细胞器DNA分离不全；变性过程不完全；试剂配置问题。常见问题：微量加样枪使用程序及注意事项

分子医学实验室微量加样枪使用程序及注意事项分子医学实验室分子医学技能实验课件：本科实验一-基因组DNA的提取与纯化第一步:看整体操作按钮容量刻度套头第一步:看整体操作按钮容量刻度套头操作按钮容量刻度套头操作按钮容量刻度套头第二步:看大小调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏。第二步:看大小调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加20l1000l100l10010020020l1000l100l100100200调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏

0.5--10l20--200l100--1000l10.02001000调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏0.5第三步:学调节调节钮切记:

看着刻度调大小刻度第三步:学调节调节钮切记:刻度第四步:学使用一挡吸取二挡放切记:第四步:学使用一挡吸取二挡放切记:第五步:学维护1调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏。2切勿自行拆卸加样枪

3对腐蚀性及毒性试剂等注意防范。第五步:学维护1调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则1每次实验课前主管技术员检查确认加样枪完好后交带教老师签名领取。2带教老师检查确认加样枪完好后按编号交各组学生使用。3学生使用完后按编号交回带教老师。4带教老师确认加样枪完好后交主管技术员检查签收。

微量加样枪使用程序

1每次实验课前主管技术员检查确认加样枪完好后交带教老师签名分子医学技能中山医学院生物化学与分子生物学教研室银巍Email：yinwei@分子医学技能中山医学院银巍

关于分子医学实验课程严格遵守实验室管理是必须的关于课堂设计和教学注意事项课程要求及考核关于实验教学关于实验教学

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。

一、基因组DNA的提取与纯化

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文一、基因组核酸分离纯化的总原则：

保证核酸一级结构完整排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机熔剂、金属离子、外源DNA、

RNA等）

核酸分离纯化的总原则：核酸提取的主要步骤

主要包括：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的主要步骤核酸提取注意事项减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融；高温等）防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）

核酸提取注意事项二、人基因组DNA的制备实验目的及意义

1.从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA2.掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理二、人基因组DNA的制备

基因组DNA提取原理

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻璃棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。基因组DNA提取原理利用基因组DNA较长的特性，可以

分离纯化基因组DNA的方法有很多种：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。但原理相似，都是利用两种DNA的差异来分离的，因此它们有共同的步骤：

①裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶②除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质；③析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。分离纯化基因组DNA的方法有很多种：

实验材料及试剂

材料：人口腔上皮细胞试剂：抽提缓冲液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAaseSDS，蛋白酶K，饱和酚氯仿/异戊醇（24:1）

75%及95%乙醇

TE缓冲液：Tris，EDTA实验材料及试剂主要试剂的功能

抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成.SDS的作用是裂解细胞.EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA

酶对DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白质。酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA主要试剂的功能取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用15ml离心管（4000rpm

10min）收集细胞沉淀

①

（台式离心机的使用，平衡）

加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5mlEP管

（微量移液器的正确使用）混匀，65℃温育15min

加入等体积的饱和酚(0.5ml)，充分颠倒混匀（不要震荡！）P13实验步骤及注意事项（一人一组）：

取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3m12000rpm5min②，400ul上层水相转移至新的EP管

（高速离心机的使用与安全意识）

加入400ul等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀12000rpm5min，400ul上层水相转移到新的EP管

加入2倍体积800ul95%的乙醇，颠倒混匀12000rpm5min

③

12000rpm5min②，400ul上层水相转移至新的E分子医学技能实验课件：本科实验一-基因组DNA的提取与纯化弃上清，沉淀中加入1ml75%乙醇

12000rpm2min

④

轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min

加入30l0.1×TE溶液，42℃助溶10min后4℃保存

弃上清，沉淀中加入1ml75%乙醇实验结果及其分析

定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳定量分析：紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度实验结果及其分析常见问题：

1、提取的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。

2、提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。

3、与细胞器DNA分离不全；变性过程不完全；试剂配置问题。常见问题：微量加样枪使用程序及注意事项

分子医学实验室微量加样枪使用程序及注意事项分子医学实验室分子医学技能实验课件：本科实验一-基因组DN