核酸提取方法资源

核酸提取大体上主要分三大类：基因组DNA、总RNA和质粒一、常见提取方法/原理：基因组DNA：CTAB法、SDS法等以去污剂CTAB/SDS等处理样品，破坏细胞膜结构，裂解细胞（裂解液通常含EDTA抑制DNase活性，Tns-Cl缓冲防止核酸被破坏，同时具有较高NaCl浓度，维持核酸溶解性）：加氯仿去除蛋白复合物（有机相），离心分离，回收水相（内含核酸）；异丙醇沉淀DNA,离心回收絮状DNA,梯度乙醇清洗，自然挥干，溶解DNA于TEbuffer。总RNA：TRIzol法（苯酚+硫氤化弧）、异硫氤酸弧盐两步法、CTAB-PVP法等与DNA提取的原理步骤基本一致。TRIzoVCTAB等buffei•裂解细胞，解聚染色体，释放核酸；氯仿除蛋白，离心后回收水性酚相/水相（RNA提取必须是酸性酚或低盐水相）；异丙醇沉淀，乙醇清洗，挥干，溶解于TEbuffera质粒提取：碱裂解法溶液I,50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA,pH8.0；（作用于重悬细胞、保护DNA）；溶液U,0.2NNaOH/1%SDS：（碱裂解）溶液HI,3M醋酸钾/2M醋酸；（中和碱液，SDS钠离子取代，促蛋白-基因复合物沉淀）从上清回收质粒二、核酸提取技术细节注意点：基因组DNA提取技术细节及原因：CTAB/SDS裂解液配制中必须注意pH值，酸碱度严重影响提取所得核酸的质量。原因在于DNA提取与RNA提取所用的裂解液理论上是可以通用的，但DNA与RNA在溶解性差异上的表现在高盐状态下DNA-蛋白复合物可溶，低盐状态下RNA-蛋白复合物可溶；而在苯酚溶液中，酸性酚下RNA可溶，碱性酚下DNA可溶；故必须注意bu任ei•酸碱和盐平衡问题。样品研磨需要充分研磨，组织结块、样品成团将极大的影响裂解液渗透和生物膜体系崩解,影响核酸溶出。总RNA提取技术细节及原因：RNase控制问题，裂解液处理完毕后的实验步骤必须严格无酶操作。原因在于样品经裂解处理离心后各步骤中样品不再处于RNase抑制剂保护下，如果在后续步骤使用的耗材中沾染RNase将对总量本就较少的RNA造成严重破坏。样品研磨尽量迅速。原因在于通过减少样品细胞裂解的时间，使含RNase抑制剂的裂解液尽快浸润样品，阻遏样品内源RNase活性。质粒抽提技术细节及原因：溶液II加入进行样品碱解时，动作必须轻缓。原因在于NaOH+SDS的组合主要目标在于迅速裂解样品，但强碱存在的情况卜，基因组DNA极有可能断裂，如果裂解过程中过于粗放,基因组DNA将断裂进入裂解液，无法伴随蛋白沉淀而从体系中清除。三、核酸提取常见问题及对策基因组DNA提取常见问题与对策：1、DNA得率低对策：“巧妇难为无米之炊”，因此收集尽可能多的样本是首选方法！！！在样品量无法增加的情况下，裂解液务必与样品充分混匀，各种试剂千万不要过期（PS：节俭是美德，但要不坏事才是美德）若全程操作规范，得率尚不理想，则可以考虑对抽提DNA过程进行重复。2、OD260/280不理想对策：OD260通常是表征核酸的，核酸因为共扼环光吸收发生在240-29011111之间，最大吸收峰一般在260nm左右，单链RNA,双链DNA,环状DNA等吸光略有差别，基因组DNAOD260/280应为1.8左右，偏高则意味着RNA污染；偏低意味着蛋白/多酚污染。3、OD260/230不理想对策：OD230一般是多糖类物质（碳水化合物主要吸收峰），4、电泳-胶孔发亮对策：胶孔发亮多是蛋白和多酚物质污染1、上样量与裂解体系上样量是DNA提取的经典问题，无论用什么方法，首先要解决的就是上样量问题，不同的上样量对应不同的试剂体系，上样量过多或多少都会影响裂解的效果。以GNT-B02的磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒为例，标准上样量为2003,上下浮动不超过100111.搭配的裂解液用量为400U1,有些老师由于实验要求，需要大体积的上样量，这在实际操作中，就需要对磁珠法的操作流程进行改良，一般的改良思路是按比例放大裂解体系；但有些实验的上样量达到亳升以上，这种情况下，就不能再简单的放大裂解体系了，需要先用红细胞裂解液对样品进行处理，将上样体枳浓缩后，再进行磁珠法操作流程的优化。2、磁珠结团磁珠结团是经常遇到的现象，是由磁珠本身特性和磁珠所处试剂环境两方面造成的，有些磁珠不仅在全血DNA提取过程中会结团，其他的样本也同样会结团，有些老师在初次遇到这种现象的时候会感觉不适应，其实结团现象可以用来提前预判实验结果，结团往往是吸附了大量核酸，如果哪次实验没有结团，本次的实验结果或许会不太好，不过也不能一概而论，杂质太多也是引起磁珠结团的原因。通过修改试剂配方，优化试剂配置，可以改善磁珠的结团现象，但是该工作较为复杂，需要对各种参数进行调整。不过对于磁吸速度较慢的磁珠，结团后能明显提高磁吸速度，提高实验效率，只要磁珠在洗脱步骤能够分散，而且结果也在标准范围内，磁珠结团并不会影响整体效果。3、得率低得率是影响下游实验的最直接因素，根据我们的经验，200U1的全血，得率一般在3ug以上，用GNT-B02的试剂盒，能稳定在5ug以上，有些老师的实验结果只有2ug左右，甚至更低，这就需要重点排查两个环节，一是裂解环节，二是洗脱环节，若是裂解环节的问题，往往会是在结合的时候磁珠不结团，或在洗涤的时候上清液颜色为深黄色或红色，这种情况下，更换全新的裂解液，并且严格按照SOP操作是较为效率的解决办法洗脱环节的问题，经常表现为结团的磁珠未被打散，可■考虑加大震荡力度，或用吸头吹吸、搅拌。有些老师在得率较低的时候，喜欢加大上样量，这可能会适得其反：过大的上样量会抑制裂解液的裂解能力。总RNA提取常见问题与对策:质粒提取常见问题与对策：提质粒主要用到三种试剂：试剂一：溶菌液其中的溶菌酶的作用是水解细胞壁，葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，维持渗透压，EDTA作螯合金属离子用。试剂二：NaOH—SDS液NaOH的作用是促使DNA变性，SDS是表面活性剂，除去蛋白质。试剂三：NaAc溶液作用是使变性的质粒DNA复性。提取质粒成功的标记是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净,获取一定得率的质粒DNA,在提取过程中，比较关键的步骤是加入试剂一与试剂二时，要控制变性与复性操作时机，既使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不产生断裂成小片断能与质粒DNA分离。这要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当。一般来说，加入溶液一时可以用力摇动几次，而加入溶液二时要用力均匀。当加入溶液二5min后，溶液会变粘稠,如果不变粘稠，实验就没有必要再做下去了。这时要检查所用的试剂是否正确，不然坐下去只好浪费时间。我用过天为时代的质粒小提试剂盒，本人认为抽提效果很好。为什么这么说，我的细菌带有大约20KB的耐药质粒，先前使用上海生工的质粒小提试剂盒，提出的质粒经琼脂糖凝胶电泳总不见条带，可是，自从用了天为时代的质粒小提试剂盒，只要操作步骤正确，均能提取到质粒，电泳有多条需要的清晰条带。我考虑你如果操作方法正确，那前面模糊的条带应该是RNA,而你并未提到质粒。考虑一下你的菌种是否有问题，保存方面有没有污染，抗性是否存在。建议：确定菌种正确后，再次提质粒时，在液体培养基中加入相应浓度的抗生素（细菌具有此抗性，同时细菌能在此浓度下生存，可测细菌的MIC值），这样增菌后，可提局质粒浓度。提取质粒主要有三种试剂：悬浮液，裂解液，中和液，第一步是悬浮菌体，彻底的悬浮对提取质粒的量有很大的关系。第二步，加入裂解液后，要温和颠倒两三次，等一两分钟看菌体变清澈时说明裂解完全了，这时需要加入中和液，颠倒两三次后离心去除沉淀。注意裂解时不可以剧烈晃动，这样基因组DNA就会污染，到复性时会和质粒混在一起，这样测OD值是有，但跑胶时就看不到，你上面提不出质粒的原因可能是质粒丢失了，建议你重新做转化！我曾经犯过这样的错误：摇菌的时候没有加入抗生素。这样的话在传代过程中带有质粒的菌体会被逐步淘汰，所以很难提出质粒。另外质粒破碎我觉得不太可能，你得到的小片断应该是基因组DNA污染吧。记得加PIIPIII后一定要温柔混匀，切忌剧烈的动作。我以前也是经常出现这种情况。仔细总结一下•，可能在操作中有些注意的地方操作不得当。你是用试剂盒作的吗？我是用宝生物的试剂盒作的！首先，加试剂1时可■以剧烈震荡，但是加试剂2的时候，千万不能震荡，否则DNA片断可能会断裂，而且2液要新鲜配置。加试剂3时反复颠倒即可！还有，在电泳时是否加Loadmgbuffei-?样品散开了？我觉得注意以上几点，现在小题的成功率还是蛮高的！我在提取质粒时的技巧是尽量避免剧烈的摇动，不要涡旋：ILHI在冰上进行；三种溶液加完后的那次离心延长到15nmi,13200ipmo基本上我每次提取出的质粒都是超螺旋状态。质粒提取后不能完全溶于TE,为什么呢？是因为我用无菌台吹干酒精吹的太厉害了吗？做酶切后电泳带很弱，和不溶应该有关系吧？求答：助］质粒提取后DNA不能完全溶于TE的原因1）我的感觉是你的质粒提取质量不好，不能溶解的部分一定不是质粒而是杂质。一般来说，即使己经干燥的质粒沉淀在四度里三天也会完全溶解的。建议你跑胶检样看看，或者改用试剂盒提取，国产的合子很便宜，博大泰克的合子100次的才80元，质量也不错.2）吹得太干就会不好溶解：后续操作跟这个没有关系。3）我估计也是蛋白，用枪头吹匀后还是不能溶解，取上清做酶切后还是有带的，取上清做电泳发现质粒有四条带，不过有一条比较清楚，应该没有影响到后续操作吧.4）用多少的TE不能溶解啊？个人感觉，有蛋白污染的时候质粒比较难溶。纯度高的质粒很容易溶解的。加无水乙醇的作用是沉淀质粒DNA,我们一般用70%的乙醇来洗涤沉淀，洗两次，若沉淀悬浮还要离心，效果挺好的。不妨试试。提取质粒，表面上很简单，但在做的过程中，却往往发现不少的问题。我大概每周要提取将近500个质粒，从提取过程来看，出问题的也忘包括几点：一、提取的量低：二、提取的不纯，有RNA；提取的量低，有几个因素，有可能是裂解不充分；另外和菌种的自身拷贝高低也有很多关系：含RNA主要是RNA酶混合液洗涤的时候没有做好，可以少量分次洗涤，效果会更好。现在提取质粒往往有试剂盒，比较方便，但也有弊端，成本高点。我们己经设计实验，用物理方法去直接进行质粒的提取纯化，从实验来看也是很好的。就是根据质粒本身带有负电荷，它游离与细胞质中不像基因组DNA与蛋白质结合，在电动势的作用下可以转移出来。这种方法提取质粒也有其弊端，就是对技术要求比较高，对实验操作要求比较严格优势也比较突出：省时，成本也降了下来。我觉得有两方面你可以注意下：1片断产物有毒，细菌都死掉了。这是我以前遇到过的情况，过夜摇菌后，第二天可见，细菌聚集成颗粒状，提得质粒浓度很低，后来发现是细菌都死掉了，质粒降解了，所以量很低，可能目的基因所表达的蛋白对细菌有毒，后来我换了一下菌株，使用Xl-blue,提质粒就好了。2有无杂菌污染，Amp培养基摇菌时，由于细菌会把Amp抗生素降解掉，造成抗生浓度降低，后果就是无抗性细菌疯狂生长，原因就是在抗性菌和非抗性菌都能生长的条件下，非抗性菌具有生长优势，另外菌体里含质粒拷贝数低的细菌较高的细菌具有生长优势。所以大提质粒时，要从新鲜平板上挑取单克隆细菌去摇菌，避免杂菌干扰质粒抽提，过夜培养的时间不要过长。建议你：1从新鲜平板上挑取菌落来摇菌，按标准步骤来做：新鲜平板上挑取单克隆，震摇培养8小时，然后1/500-1/1000稀释,过夜摇菌12-16小时。2换菌株，如XI-blue等。3如果以前没有大提过质粒的话，还是仔细看下说明书。很有可能是大摇时，许多菌死掉了，我建议你摇菌时间稍短一些，然后将菌液放置于4度过夜，再提，或许会好些，11，你的电泳时间太长，或者电压太高了。要得到大量的质粒，有如下几点供参考1、确保质粒在宿主菌中有高拷贝，细菌培养时保证筛选压力。不同的质粒在宿主菌中的拷贝数不同，低拷贝的质粒很难得到高的量，所以，我们一般把目的基因克隆到高拷贝的质粒上。并选用合适的宿主工程菌。在宿主菌的培奔中，抗生素往往加在培养基中用来筛选阳性克隆，然而，当宿主菌在对数生长期，像氨茉青霉素之类的抗生素就会被代谢完了，筛选压力的消失会让质粒丢失的细菌得以存活，并在最终占据很大的比例，所以有的时候提的菌很多，而质粒很少。应此要保证筛选压力，抗生素最好选较高的用量。2、质粒提取方法的选择热裂解法往往会得到较高的产量，质量也较好，然而对某些的宿主菌不适合，热裂解法不稳定，不能保证次次成功。小提的结果较好，相对稳定。碱裂解法是最常用的方法，严格按照分子克隆的操作要求去做，一定会得到很好的结果。12.如果采取碱裂解的方法。我认为应该控制碱裂解的时间一定要短，我一般是加SolutioiiII后缓慢混匀后，即加入Solutionlll.另外，4度离心后吸取上清时，一定不要吸进沉淀杂质，否则最后DNA沉淀不能很好溶解。13•为了得到更好效果的图，最好不要省略酚氯仿抽提这一步，而旦可以适当延长抽提的时间。质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNAo大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。（一）、碱法1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液2501111,4°C下5000g离心15分钟，弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。5、加入12ml新配制的溶液H,盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。6、加9ml用冰预冷的溶液HI,摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。7、4°C下5000g离心15分钟。8、取上清液，加入50inlRNA酶A（10mg/ml）,37°C水浴20分钟。9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀,4°C下12000g离心10分钟。10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀,4°CF12000g离心10分钟。11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000）,冰上放置60分钟。12、4°C下12000g离心15分钟，沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤，4°C下12000g离心5分钟。13、真空抽干沉淀，溶于500nilTE或水中。［注意］1.提取过程中应尽量保持低温。加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡。由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（80°C1小时），使DNA酶失活。我也遇见过你这样的问题，用过试剂盒，和简易的碱裂解法，都没有提出过质粒，或者是跑出很怪的条带，比如曾经跑出2万的分子量,我想你的问题可能有以下原因：在乙醇沉淀步骤中，将DNA弄丢了.很可能是表皮葡萄球菌污染，具体这方面的分析可见以前的旧贴.或许你提的是少量，电泳胞不出来.或许是存在蛋白质污染，或RNA污染等我最近提了几次质粒，产量挺高的，我在提取时某一步稍微注意了一些，我在这里说一下，看看能不能对大家提质粒有所帮助。在加入溶液2后我都是让他们充分作用大约5-7分钟，不长于7分钟。加入溶液3后先轻轻混匀，大约混5-10次，然后剧烈震荡让白色沉淀成碎豆腐花状（我觉得这一步挺重要的，这是前面一个战友告诉我的，呵呵谢谢了），然后在冰浴10Mm.［有问题】冰浴后直接加入等体积酚：氯仿=1:1,然后离心取上清，大约能取400微升最后一步干燥时，一定要干燥充分，最后可以看到质粒都变成透明的了。这样就说明比较纯了。往后作酶切连接转化都没有问题。加溶液2没有冰浴。3.3是写得时候没注意，其实3.4就是3.3无水乙醇没有冰浴冷，但是加上后是在-20度放置2h用70%乙醇就洗了一次18•建议加溶液2后冰浴5mm,溶液2的主要作用是破细胞膜以及基因组DNA变性，这是需要一定时间的，没有冰浴5mm的话细胞膜未能充分破掉，那么你提质粒的效率自然就很低。当然，冰浴5min就够了，时间要严格掌握，也不能超过。此步动作要轻柔。另外，溶液2应该是新鲜配置的，否则也会降低效率。质粒提取的常见问题1、菌液较多：可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解,导致提取量和纯度偏低，菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解，导致导致提取量和纯度偏低。质粒提取使用的溶液I主要是悬浮菌体，溶液II裂解菌体，其中的高浓度NaOH破会细菌细胞壁和细胞膜，使菌体中的质粒DNA释放出来，溶液HI主要是中和溶液，使溶液恢复中性环境，利于质粒DNA复性，溶液D中SDS的Na+会被K+置换，SDS变为PDS并结合大分子的基因组DNA,蛋白质和细胞碎片形成不溶物，然后通过离心可以得到含有质粒DNA的上清。因此加入溶液II后要温和地混合，不要剧烈震荡，以免使基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5mm,以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，若继续进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀，无法通过离心分离得到含有DNA的上清液，因此在加入溶液II后菌液没有变清亮后可•以适当按比例加大溶液1【和后续溶液III的用量。2、菌液培养时间：使用TB培养基培养菌液的时间一般在17小时左右，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，都会影响收集的菌体量，从而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前，可以将保存的菌种先进行活化，然后再接菌，可使过夜培养的菌液生长更充分，在一定范围内菌体量的增加，可以提高所提质粒的浓度。3、宿主菌株：宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，HB101,如JM101,JM110,TGl以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10,DH5a进行质粒纯化。4、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可■更换具有相同功能的高拷贝数载体，或者加大提取的菌液量，并减小洗脱时的体积。5、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况，导致无法提出质粒，若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。6、碱裂解不充分：