有机溶剂沉淀法分离与纯化蛋白质

有机溶剂沉淀法分离与纯化蛋白质摘要：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。关键词：有机溶剂沉淀分离与纯化正文一、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法的概念利用与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀。有机溶剂沉淀法的原因有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。有机溶剂沉淀法的影响因素（一）有机溶剂的选择在实际生产中，常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、氯仿等。丙酮的介电常数小，沉淀能力强；而乙醇无毒，广泛应用于药品生产中。（二）温度的控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的控制指标。根据沉淀对象不同，采用的温度不同，为防止生物大分子在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行，同时还要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象。（三）pH值等电点时，蛋白质的溶解度最低。在有机溶剂沉淀时，应选择pH值在等电点附近，但是pH值的控制还必须考虑目的药物的稳定性条件，一般生产中常用缓冲液来控制溶液的pH值。（四）离子强度在有机溶剂和水的混合液中离子强度是一个特别重要的因素。因为盐在一定的浓度范围内能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，使有机溶剂沉淀收率降低，因此当采用盐析沉淀法得到蛋白质或酶后，如需进一步用有机溶剂沉淀法纯化，一定要先透析除盐。有机溶剂沉淀法的溶剂选择原则溶剂的选择原则就是：与水可以混溶，不与蛋白反应，沉淀效应良好，无毒等。一般就是乙醇丙酮。方法就是调节适当的pH，pH调节适当会使沉淀效果好很多，等电点附近比较好。加入前将有机溶剂低温处理，缓慢加入，边加边缓慢搅拌（可以冰浴），静置15min后离心。蛋白溶液浓度不要太低，否则蛋白容易变性，5mg/ml以上吧。一般加丙酮的话，体积百分含量20〜50%即可。至于加盐的话，可以在加有机溶剂前加入，浓度不要太大，否则如你所说，沉淀太猛，失去分级的效果。如果加NaCl，浓度0.05mol/L左右即可。［3］有机溶剂沉淀法的主要机理向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。主要机理：（1）亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。（2）水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。二、有机溶剂沉淀法分离与纯化的实例以乙醇为溶剂，人心2为沉淀剂，采用有机溶剂沉淀法对湿法磷酸进行净化，在乙醇与预处理酸体积比为2.0、溶剂沉淀剂用量为3.5%、反应温度40°C、反应时间100min条件下，脱氟率可达到96%以上，磷收率为86%以上.实验方法取一定量的原料磷酸于250mL烧杯中，置于恒温水浴中进行搅拌，恒温之后加入一定量的复合脱氟剂对原料酸进行预处理［2］，经反应、静置、过滤分离后得预处理酸.取一定量的预处理酸于三口烧瓶中，加入一定量的溶剂沉淀剂，置于恒温水浴中，同时用搅拌器进行搅拌，恒温后加入一定体积的乙醇，于给定温度下反应一定时间后将物料进行过滤分离，滤液经蒸馏分离回收溶剂后得净化磷酸，净化酸取样分析［1］试验结果（一）原料酸预处理实验条件:原料酸500mL，复合脱氟剂用量17.2g，反应温度30C，搅拌速度300r/min，反应时间2h，静置时间2h，经预处理后的磷酸脱氟率达到65.60%，磷酸磷收率为92.80%.（二）单因素实验影响反应的因素主要包括:溶剂沉淀剂种类及用量、溶剂用量、反应温度、反应时间等，先以单因素实验分别考察各因素对脱氟率的影响以初步确定实验条件范围.不同溶剂沉淀剂对脱氟效果的影响实验条件:预处理酸与乙醇体积比为1：2，沉淀剂用量为预处理酸质量的2.5%，搅拌速度300r/min，反应温度25C，反应时间90min，乙醇均匀缓慢加入.分别以液氨、RNH2和复合沉淀剂（RNH2+液氨）为溶剂沉淀剂。乙醇用量对脱氟效果的影响实验条件：RNH2用量为预处理酸质量的2.

5%,搅拌速度300r/min，反应温度25°C,反应时间90min，乙醇均匀缓慢加入.于不同溶剂用量时对脱氟率进行考察，实验结果如图下图所示01.501.52.02.53.03.5『（乙醇）/V（酸）由图可见，随乙醇用量的增加，脱氟率逐渐增大，这是因为当乙醇用量增加时，不溶于乙醇的铵盐及含氟铵盐被析出，脱氟率增加，当乙醇与磷酸体积比为2:1时，脱氟率最高，之后脱氟率随乙醇用量的进一步增加而略有下降，此时磷被同时析出.因此乙醇用量以乙醇与磷酸体积比2：1左右为宜.[4]溶剂沉淀剂RNH2用量对脱氟效果的影响实验条件:预处理酸与乙醇体积比为1：2，搅拌速度300r/min，反应温度25C，反应时间90min，乙醇均匀缓慢加入，于不同溶剂沉淀剂用量时进行实验研究，结果如下图所示.由图可知，当溶剂沉淀剂RNH2用量小于3.0%时，脱氟率随着溶剂沉淀剂RNH2用量的增加而增大，这是因为当溶剂沉淀剂RNH2用量增加，杂质形成的铵盐相对增加，而这些铵盐又不溶于乙醇，所以随着溶剂沉淀剂RNH2用量的增加，脱氟率增大;当溶剂沉淀剂RNH2用量大于3%时，脱氟率变化不明显，所以选择溶剂沉淀剂RNH2用量为3.0%进行后续实验研究。[5]3结论该工艺对湿法磷酸进行预处理后，以乙醇为溶剂，RNH2为沉淀剂，采用溶剂沉淀法对湿法磷酸进行净化，在乙醇与预处理酸体积比为2:1、溶剂沉淀剂用量为3.5%、反应温度40°C、反应时间100min条件下，脱氟率可达到96%以上，磷收率为86%以上.该工艺可较好地解决湿法磷酸中铝等杂质含量较高时脱氟困难的问题，经该工艺处理后的湿法磷酸氟含量可达到工业或饲料级要求，也为高铝含量的湿法磷酸深度净化前处理提供了一。三、总结大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内(度为10%，40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶(V10ug/ml)直至极易溶解(>300mg/ml)不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。使用的有机溶剂多为醇和酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。有机溶剂沉淀法的优点是是分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制，而且有机溶剂使用量大，溶剂的使用及回收；储存都比较困